以多變量分析探討現行發布之生物毒性試驗

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國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

以多變量分析法探討現行發布之生物毒性試驗

Using Multivariate Statistical Analysis to Evaluate

the Present Standard Methods of Aquatic Bioassays

研 究 生 : 孟 哲 賢

指導教授 : 陳 重 元 教授

2

以多變量分析法探討現行發布之生物毒性試驗

Using Multivariate Statistical Analysis to Evaluate

the Present Standard Methods of Aquatic Bioassays

研 究 生：孟哲賢 Student：

Che- Hsien Meng

指導教授：陳重元 Advisor：

Chung-Yuan Chen

國 立 交 通 大 學

環境工程研究所

碩 士 論 文

A Thesis

Submitted to Institute of Environmental Engineering College of Engineering

National Chiao Tung University in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master

in

Environmental Engineering

September 2012

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

I

以多變量分析法探討現行發布之生物毒性試驗

學生：孟哲賢 指導教授：陳重元 老師 國立交通大學環境工程研究所

摘要

水生生物毒性評估會因生物敏感性之差異而有低估毒性風險的發生，因此 不能只用單一種生物試驗來評估毒性。"組生物"試驗方法中包含多種生物試驗 方法，能得到較完整的毒性資訊。然而，我國環境檢驗所發布之環境生物毒性 檢驗方法中，並未考慮到物種敏感性及食物鏈之概念。因此，本研究目的除了 利用實驗及統計結果了解現行發布之生物毒性試驗方法是否足以有效評估汙 染物的危害性外，並為"組生物"試驗法選擇適當的生物測試方法，作為日後評 估環境毒物之參考依據。本實驗主要利用多變量統計法進行研究分析，為避免 統計結果缺乏準確性，研究以小樣本(二十種)及大樣本數(九十種)之有機物兩個 部份進行，所用到之生物試驗法包含密閉式與批次式月芽藻、水蚤、鯉魚、 Fathead minnow及海洋螢光菌六種試驗法，並將兩部份對應生物試驗所得之毒 性數據分別進行主成分分析與集群分析，以比較大小樣本數在統計上之差異性。 多變量分析結果顯示，密閉式月芽藻為本驗究中最具敏感性的試驗方法，且在 主成分分析中與水蚤皆為重要的成分變數；海洋螢光菌、鯉魚與Fathead minnow 之間具非常高之相關性，但會因有機物之特殊作用機制使其相關性改變。由於 大小樣本數之有機物統計結果相符合，依據主成分分析、群集分析及Pearson 相關係數分析之結果選擇的"組生物"包含：密閉式月芽藻、Daphnia magna及海 洋螢光菌或添加鯉魚試驗法，且根據最終之主成分分析結果顯示，以此"組生物 "來評估毒性並不會造成任何毒性評估資訊之損失。因此，密閉式月芽藻、 Daphnia magna及海洋螢光菌是"組生物"試驗法中合適的試驗生物。 關鍵字 : 月芽藻、多變量分析、主成分分析、集群分析、組生物

II

Using Multivariate Statistical Analysis to Evaluate

the Present Standard Methods of Aquatic Bioassays

Student：Che- Hsien Meng Adviser：Chung-Yuan Chen

Institute of Environmental Engineering National Chiao Tung University

ABSTRACT

In the aquatic toxicity testing, the potential risk of toxicants can be underestimated due to differences in species sensitivity; therefore, it can not only use single-species to assess the toxicity. Test batteries consist of several individual assays which have become more common and receive more complete toxicity information. However, from the testing methods for environmental biological toxicity of the Environmental Protection Administration of Taiwan, it does not consider the concept of species sensitivity and the different trophic levels. The aims of this study not only use experimental and statistical data to investigate whether the existing testing methods for environmental biological toxicity can assess the harmfulness of the pollution effectively, but also select an optimal battery of bioassays as a source references to evaluate ecotoxicity in the future. This study utilize mainly the multivariate analyses, to avoid the insufficient accuracy of the statistical result, the experiment is proceeding from two parts: small sample (Twenty chemicals) and large sample (ninety chemicals). The six bioassays include closed-system and open-system algal(Pseudokirchneriella subcapitata), Daphnia magna, Cyprinus carpio, Fathead minnow and Microtox, then using Principal Component Analysis (PCA) and Cluster Analysis(CA) separately from the toxicity data of the two corresponding biological test. These multivariate analysis clearly showed that closed-system algal is the most sensitive testing method in this study, and is the same as Daphnia magna in the PCA that both are the important component variable. The correlation among Microtox, Cyprinus carpio and Fathead minnow is high, but it changes according to the special mode of action. PCA, CA and Pearson allowed for the selection of the following test battery：closed-system algal、Daphnia magna and Microtox or in addition Cyprinus carpio test. And the final PCA shows that the number of bioassay can be reduced without significantly losing information. Thus, closed-system algal, Daphnia magna and Microtox are the ideal bioassays in the test battery.

Keywords : Pseudokirchneriella subcapitata,

Multivariate,

Principal Component Analysis, Cluster Analysis, The test battery

III

致謝

歷經了非常充實的兩年研究生涯，感覺成長了許多，感謝父母的栽培，謝謝 你們供養我讀到碩士，使我在求學期間毫無金錢壓力，你們的後半輩子我全包了。 感謝陳重元 教授二年來的指導，包容我每一次的上台口頭報告，使我漸漸地對 報告不再懼怕且逐漸掌握到訣竅及要點而對口說有大幅的進步。 感謝陳group的所有成員，謝謝大學姐對我在論文上的指導及總是熱心規劃 活動讓實驗室充滿歡樂；感謝宏爺、祥哥、萱芳姊的照顧，我超想你們的，謝謝 兩位同學阿表及筱涵妳們的關照及相處上的包容；感謝我的好球友們:南維、能 俊、脫水、人妖、菸王……，有了你們我的籃球才能如此的精進，才知道我原來 還蠻強的!!!!!!；學弟妹們：騏瑋、姜姜、宜君，接著是你們領頭了，盡情去凌 虐碩一的毛頭們吧!實驗及論文上多多加油，祝你們一切順順利利；碩一的毛頭 們：阿彰、阿法克、阿辰，妳們就是要先被凌虐，皮繃緊點~祝你們有個充實又 快樂的碩一生活，加油啦~ 最後，超級感謝我的女友 林育汝，妳是我生命中最最最重要的人，與妳在 一起的每分每秒真是如此的幸福與美好，感謝妳三不五時來交大陪我克服研究上 的萬難，感謝妳讓我能同時兼顧課業與愛情，感情妳那優異的英文能力，感謝妳 對我那千奇百怪的情緒與語言上的包容，能與妳在一起我真的是賺到了，我超愛 妳的，永遠的那種喔~~~~

IV 中文摘要 ... I 英文摘要 ... II 致謝 ... III 目錄 ... IV 表目錄 ... VIII 圖目錄 ... IX

目錄

第一章 前言 ... 1 1.1 研究緣起 ... 1 1.2 研究目的 ... 3 第二章 文獻回顧 ... 4 2.1 "組生物"試驗法發展趨勢 ... 4 2.2 毒性試驗物種 ... 7 2.3 月芽藻毒性試驗概述 ... 9

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2.4 有機物質之毒性機制 ... 12

第三章 基本理論 ... 14

3.1 濃度（劑量）反應模式 ... 14

3.2 多變量分析 ... 17

3.3 主成分分析(Principal component analysis) ... 18

3.3.1 主成分分析分析架構 ... 19 3.3.2 主成分個數之選取 ... 21 3.3.3 主成分分析結果之解釋與應用 ... 22 3.4 集群分析(Cluster analysis) ... 25 3.4.1 選擇衡量觀察值相似性(距離)的方式 ... 25 3.4.2 集群的分類方法 ... 27 第四章 實驗材料與方法 ... 29 4.1 儀器設備與試劑 ... 29 4.1.1 Microtox 生物毒性實驗： ... 29 4.1.2 鯉魚靜水式毒性試驗： ... 30

VI 4.2 試驗之毒化物 ... 32 4.3 試驗方法 ... 36 4.3.1 藻類毒性試驗 ... 36 4.3.2 Microtox®標準分析程序 ... 43 4.3.3 鯉魚靜水式毒性試驗 ... 44 4.4 文獻數據蒐集與推估 ... 47 4.4.1 生物毒性數據 ... 47 4.4.2 毒性數據推估 ... 47 4.5 毒性數據統計分析 ... 48 第五章 結果與討論 ... 50 5.1 二十種有機物之毒性試驗結果 ... 50 5.2 多變量統計分析 ... 57 5.2.1 群集分析(Cluster analysis)結果 ... 57 5.2.2 主成分分析(Principle analysis)結果 ... 59 5.3 選擇"組生物"物種 ... 67

VII 5.4 九十種有機物毒性分析結果 ... 71 5.4.1 群集分析結果 ... 71 5.4.2 主成分分析結果 ... 72 5.4.3 文獻結果比較 ... 73 第六章 結論與建議 ... 84 6.1 結論 ... 84 參考文獻 ... 86 附錄一 ... 91 附錄二 ... 106

VIII

表目錄

表 4.2.1 有機物之結構與物化特性 ... 33 表 4.3.1 微藻營養鹽之組成 ... 38 表 4.3.2 微藻營養鹽之組成 (EDTA 成分) ... 38 表 5.1.1 二十種有機物之毒性試驗數據 ... 53 表 5.1.2 二十種有機物毒性數據平均值與標準偏差 ... 54 表 5.2.1 主成分分析-共變異矩陣之特徵值及解釋的變異量 ... 62 表 5.2.2 主成分分析-共變異矩陣之特徵值及解釋的變異量 ... 62 表 5.3 六種試驗生物之 Pearson 兩變數間相關係數比較 ... 69 表 5.4.1 九十種有機物之毒性試驗數據 ... 76 表 5.4.1 主成分分析-共變異矩陣之特徵值及解釋的變異量 ... 79 表 5.4.2 主成分分析-共變異矩陣之特徵值及解釋的變異量 ... 79

IX

圖目錄

圖 3.1.1 毒性試驗之劑量-反應關係曲線 ... 16 圖 3.2.1 多變量分析之目的 ... 17 圖 3.3.1：陡坡圖 ... 21 圖 3.3.2：主成分分析之成分圖 ... 24 圖 4.3.2 去離子水之曝器設備示意圖 ... 41 圖 4.3.1：密閉式藻類毒性試驗流程暨裝置示意圖 ... 42 圖 4.3.3： Microtox® 螢光快速分析儀的 32 個槽其相關位置圖 ... 43 圖 4.6.1 本研究之實驗流程圖 ... 49 圖 5.1.1 密閉式月芽藻與批次式月芽藻試驗法相關性比較錯誤! 尚未定義書籤。 圖 5.1.2 鯉魚與 Fathead minnow 相關性比較 ... 錯誤! 尚未定義書籤。 圖 5.1.3 生物試驗方法敏感性比較 ... 56 圖 5.1.4 有機物毒性大小比較 ... 56 圖 5.2.1 試驗生物集群分析樹狀圖 ... 58 圖 5.2.2 敏感性模式:第一及第二主成分之主成分分數圖 ... 63 圖 5.2.3 敏感性模式:第一及第二主成分之主成分負荷圖 ... 63 圖 5.2.4 敏感性模式:第二及第三主成分之主成分分數圖 ... 64 圖 5.2.5 敏感性模式:第二及第三主成分之主成分負荷圖 ... 64

X 圖 5.2.6 毒性模式:第一及第二主成分之主成分負荷圖 ... 65 圖 5.2.7 毒性模式:第一及第二主成分之主成分分數圖 ... 65 圖 5.2.8 毒性模式:第二及第三主成分之主成分負荷圖 ... 66 圖 5.2.9 毒性模式:第二及第三主成分之主成分分數圖 ... 66 圖 5.3.2 組生物：第一及第二主成分之主成分分數圖 ... 70 圖 5.4.1 五種試驗生物集群分析樹狀圖 ... 80 圖 5.4.2 敏感性模式:第一及第二主成分之主成分分數圖 ... 81 圖 5.4.3 敏感性模式:第一及第二主成分之主成分負荷圖 ... 81 圖 5.4.4 敏感性模式:第二及第三主成分之主成分分數圖 ... 82 圖 5.4.5 敏感性模式:第二及第三主成分之主成分負荷圖 ... 82 圖 5.4.6 毒性模式:第一及第二主成分之主成分負荷圖 ... 83 圖 5.4.7 毒性模式:第一及第二主成分之主成分分數圖 ... 83

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第一章 前言

1.1 研究緣起

隨著時代的進步，高科技產業的日新月異，的確為我們的生活帶來許多便利， 但同時這些產業在製程中所排放出的廢水也將種種的汙染帶進我們的生活環境。 這些高科技產業所排放的廢水中包含了許多複雜的毒性化學物質，這些毒性化學 物質不僅對水體環境造成汙染，影響了整個生態環境，更進而影響全體人類的健 康與生活品質。因此，對高科技產業之廢水進行毒性評估是極為重要的事情。 以往對放流廢水進行排放控管或污染性評估，只著重在於生物與化學需氧量 (BOD、COD)以及固體量(SS)等傳統水質項目，但若只用這些物化參數來進行水 質控管，即使放流廢水已達到放流水排放標準，也可能對於環境及生物造成的衝 擊與危害性(Hernando et al. [1]_{)。其主要原因在於放流廢水中之化學物質過於複雜，} 且大多都會隨外界因素，如溫度、pH、硬度等使毒性有所改變；有些毒性物質其 在水體中之濃度甚小，尚不足以改變原來水體中 BOD、COD、TOC 等參數值， 但此濃度卻已嚴重影響水體中之生物；且這些化學物質間之相互作用（協同，拮 抗或加成），可能導致毒性的增強或降低，利用傳統水質分析並無法得知毒性改 變情形。由於生物的敏感性很高，可以感受到化學物質的劑量遠低於儀器所能偵 測的範圍，且直接將生物體曝入於污染物中，將可以更了解污染物之危害程度。 與傳統化學分析法進行比較，可發現到以生物試驗來分析廢水，其優點包含簡單、 快速、具敏感性且成本較低。為了強化高科技廢水管制，環保署發布於 101 年 1 月起，光電業廢水優先實施「生物急毒性」檢測。環保署表示，生物急毒性屬廢 水綜合性指標，代表廢水對水中生物活性影響的程度，如經環保機關查證生物急 毒性單位超過 1.43 TUa(Toxicity unit acute)時，將據以判定業者是否開罰，對於整 體環境水體生態維護具有正面效益。

生物毒性評估會因生物種類以及對毒性物質敏感度間的不同而造成不同的 毒性結果。如果只利用單一的生物試驗法來評估毒性，可能會因生物敏感性之差

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異而有低估毒性風險的發生。法國環境保護署有鑑於此，考慮到物種敏感性及生 物營養階層(食物鏈)的關係，為避免發生潛在毒性被低估的風險，於 1998 年提 出"組生物" (The battery of bioassays)試驗之標準方法，其中所選擇的生物包含植 物、甲殼類、無脊椎類、魚類動物等，希望能以這幾種生物來代表整體的生態系 統，得到較完整的毒性資訊。而我國環境檢驗所於今年 4 月起發布環境生物毒性 檢驗之標準方法(其中包含:水蚤（Daphnia magna；Daphnia pulex）、羅漢魚 （Pseudorasbora parva）、鯉魚（Cyprinus carpio）、粗首鱲（Zacco pachycephalus）、 多齒新米蝦（Neocaridina denticulata）五種生物為試驗生物)其中的生物多為甲殼 類及魚類生物，並未故慮到物種敏感性及食物鏈的關係。 藻類為一種被廣泛使用於毒性試驗的物種之一，為水體環境中最主要之生產 者，位於食物鏈之最底層，當水中之毒性物質對藻類造成毒性傷害時，經由食物 鏈的傳遞，也會對其他更高階之生物物種間接地造成影響。過去，藻類毒性試驗 皆為批次式之開放系統，當試驗樣品為具揮發性或半揮發性的有機毒物時，在試 驗期間會逸散至空氣中，造成實驗的誤差。而本研究所採用的藻類，月芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata)，以連續式母槽系統進行培養，並且以「48 小時 密閉式 BOD 瓶藻類毒性試驗」為試驗方法，其優點為簡單、快速、便宜且敏感 度皆高於其他試驗物種，此外藻類繁衍迅速，生命週期短暫，於試驗期間幼年或 是老年對毒性物質不同忍耐力之影響亦會較小。由上述之各項優點皆可說明以藻 類作為毒性測試物種是十分合適的。 從許多相關研究文獻結果得知，將生物毒性試驗之結果進行多變量統計分析 能有效評估汙染物之危害性。因此本研究將加入藻類(密閉式與開放式)及菌類等 生物進行毒性試驗，並將試驗結果之數據進行主成分分析、集群分析和相關係數 等統計方法來分析討論，以檢討現行發布之生物毒性試驗標準方法之不足，同時 比較密閉式及開放式藻類兩種毒性試驗於主成分分析中之差異，希望藉由本研究 之結果能作為評估環境毒物之參考。

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1.2 研究目的

據統計，全世界現在至少有超過十萬種以上的化學物質被廣泛使用 (Forget

et al. [2])。現今工業中所使用的化學物質大多屬於麻醉型 (narcotic mode)毒性物

質，其中又以非極性麻醉型有機物之量為最多，因此本研究選擇二十種有機毒

化物，其依據 Russom et al.[3]_{對毒性機制的分類，可分為有七種非極性麻醉性}

(Non-polar narcosis)、四種極性麻醉性(Polar narcosis)以及九種反應性(Reactive) 之有機物，其中麻醉性有機物占所選擇之有機物一半以上，符合當今化學物質 使用概況。

除了將這二十種有機毒化物進行鯉魚（Cyprinus carpio）及海洋螢光菌 (Photobacterium phosphoreum)之生物毒性試驗外，還加入此二十種有機物過去 已在本實驗室建立之密閉式月芽藻毒性試驗數據，並且蒐集批次式(非密閉式) 月芽藻、水蚤（Daphnia magna）與Fathead minnow之文獻毒性數據，將生物試 驗與文獻蒐集所得之數據一同進行多變量統計分析。 研究目的除了利用實驗及統計之結果了解現行發布之生物毒性試驗標準方 法是否足以有效評估汙染物之危害性外，同時也能挑選出"組生物"試驗中合適 的物種，可作為日後評估環境毒物之參考。除此之外，為避免實驗上所選擇之 二十種毒化物樣本數過小造成統計結果缺乏準確性，因此後續於文獻上蒐集近 九十種有機物之毒性數據，同樣進行多變量統計分析，比較小樣本與大樣本數 之統計結果有無明顯的差異。

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第二章 文獻回顧

2.1 "組生物"試驗法發展趨勢

在過去，各種不同型態的放流廢水能否排放至環境中的承受水體，大部分是 透過立法制定廢水排放管制項目來加以控管。傳統水質管制項目如BOD、COD、 懸浮固體物(SS)、總有機碳(TOC)、重金屬等，主要都是根據物化特性參數及化 學方法來制定的。然而，放流廢水中化學物質大多以不同的形式存在且會隨著時 間與空間的改變，而以不同的形式存在於環境水體中，這些化學物質與生物體及 環境間複雜的交互作用，若僅利用傳統的化學方法是無法評估水質是否對環境具 危害性，因此即使放流廢水已達到放流水排放標準，也可能對於環境或生物造成 的衝擊與危害性( Hernando et al. [1]_{)。Manusadzianas et al.指出利用傳統化學方法}

來評估廢水之危害性，其最主要的限制性在於無法利用化學方法測得生物對毒化 物質之利用度以及毒化物質間交互作用所造成的影響，且要完全鑑定出廢水中之 毒化學物質為何，是非常困難的。[4] 由於生物的敏感性很高，可以感受到化學物質的劑量遠低於儀器所能偵測的 範圍，且直接將生物體曝入於污染物中，將可以更了解污染物之危害程度。因此， 生物試驗法逐漸備受重視，並於較先進的工業國家中，都已利用生物進行毒性試 驗來評估放流廢水之危害性。目前，生物毒性試驗之標準方法不勝枚舉，要如何 選擇較適當的生物來評估毒性便成為一大研究課題。從一些相關研究的文獻中顯 示，每一種生物試驗之物種對不同的毒化物會有不同的敏感性，且研究指出目前

沒有任何一種生物對所有的毒化物都是最具敏感性的 ( Ren et al. [5]_{、Fochtman et}

al. [6])。因此，單單只藉由單一種生物來評估毒性，其試驗結果可能會因生物對毒

化物間敏感性的差異而有所不同，且可能在生物物種選擇上之不適當，造成低估 毒性之風險發生。

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各樣的毒化物可以影響整個水生生物群落，包括初級生產者，初級消費者， 食肉動物及細菌分解者，其毒性影響及各種營養階層生物互相影響之關係可能 是相當複雜的。法國環境保護署有鑑於此，考慮到物種敏感性及生物營養階層 (食物鏈)之關係，為避免發生潛在毒性被低估的風險，於1998年提出利用一組 試驗生物來評估毒性之概念，發展出"組生物"試驗(The battery of bioassays)之標 準方法，其中所選擇的生物包含植物、甲殼類、無脊椎類、魚類動物等，希望 能以這幾種生物來代表整體的生態系統，得到較完整的毒性評估資訊。因此， 使用"組生物"試驗已變得越來越普遍。 "組生物"試驗法在挑選試驗之物種上，包含以下幾個重點: 1.包含各種不同營養階級之生物 2.挑選之試驗生物足以代表整個生態系統 3.生物毒性試驗之結果具互補性 4.試驗成本及效率上之顧慮 "組生物"試驗之試驗生物包括了各種不同營養階級的生物，例如：Blaise et al.)[7]提出使用四個營養層級越來越高的試驗生物（如發光細菌，甲殼類動物，藻 類和魚類）來評估廢水對生態環境的毒性作用。通常，在"組生物"試驗中的生物 體應該要能代表整個（生態）系統，且除了代表性外，另一個重要的考慮因素為， 所選擇之生物其進行試驗所得之毒性結果是必須具互補性的(Ren et al. [8]_{)。當然，} 試驗生物在"組生物"試驗中之數量越多越能了解汙染物對環境的危害性，相對的 生物試驗所需之花費、試驗時間也會隨著試驗生物的數量增加而提高。因此，為 了顧及成本、時間和實驗室空間等因素，經濟及效率層面決定了"組生物"試驗中 生物數量上的限制，Vindimian et al.指出"組生物"試驗中之物種在選擇上需考慮 到容易進行實驗且需要包含最小的生物多樣性[9]_{。如果沒有審慎地去選擇"組生物} "試驗中的受測生物，將會導致毒性結果具相似或相關性，這樣的"組生物"試驗 不僅使毒性結果冗餘無法正確評估汙染物之危害性。

6 雖然文獻資料中有紀載"組生物"試驗之重要性,但要從眾多生物試驗方法中 對應不同型態之汙染物選擇適合的"組生物"試驗物種，其方法十分有限。然而， 統計方法在試驗生物之選擇上卻是個非常有用的工具，除了簡單的迴歸分析及相 關係數分析外，較複雜的多變量統計分析，如主成分分析(PCA)、集群分析(CA) 等，在許多文獻結果上皆顯示利用"組生物"試驗法配合多變量統計方法能成功有 效地評估汙染物對於生態環境之危害性。例如，Rojickova-Padrtova et al. [10]從九種 生物試驗中欲挑選適合於評估五十種廢水毒性之"組生物"，作者利用主成分分析 法及Spearman相關係數矩陣中發現，海洋螢光菌之試驗結果較其他試驗生物有明 顯不同的敏感模式，因此在"組生物"中佔有不可或缺的角色，其次作者在"組生 物"物種的挑選上，根據營養層級之概念選擇了三種營養層級及四種不同種類之

生物。Fochtman et al. [6]_{從五種不同的Daphnia magna試驗方法中挑選適合於評估}

殺蟲劑毒性之"組生物"，從多變量分析法及Spearman相關係數分析中得知五種 Daphnia magna試驗方法之毒性結果具高度相關性，使作者可選擇敏感性較傳統 急毒性試驗法佳且足以取代慢毒性試驗法的Daphnia magna Fluotox試驗法。另外

Vindimian et al. [9]利用急、慢毒性及基因毒性之生物試驗方法進行三十種放流廢 水之毒性試驗，主成分分析法之結果顯示，生物急、慢毒性試驗與基因毒性有顯 著不同的毒性結果，因此在"組生物"試驗中，急、慢毒性試驗法無法取代基因毒 性之試驗方法，並建議將基因毒性之試驗法納入"組生物"試驗法中。而Ren et al.[8] 則是利用了多元尺度分析法(MDS)，選擇"組生物"來評估進入活性污泥中廢水的 毒性。以上例子皆說明，只要將統計方法運用得當，並顧及"組生物"試驗法選擇 物種上之概念之，便能使用最小數量且富生物多樣性之"組生物"來完整評估各種 汙染物對於生態環境造成之危害性。 儘管"組生物"試驗法能有效評估汙染物之危害性，但仍有其他學者認為不能 只用"組生物"來取代傳統的水質分析法，例如：Bernard et al. [11]_{利用七種生物試} 驗以及十六種水質分析參數來評估垃圾掩埋滲濾液之危害性，並將實驗所得之數 據進行主成分分析來選擇適合評估垃圾掩埋滲濾液危害性之"組生物"，分析結果 得知毒性試驗數據及水質數據間具有相關連性，能藉由所測得的水質數據來解釋

7 滲濾液中毒性來源之成分為何，因此建議可同時使用化學方法和生物毒性試驗來 評估汙染物之危害性。Castillo et al. 也認為生物測定只能視為一種補充傳統化學 分析的方法，並不能替代或取代之。[12]

2.2 毒性試驗物種

一般來說，選擇受測物體之條件不外乎取得容易、培養簡單且所需養殖空間 不大、生命週期短、實驗容易進行、具有地區代表性等。Walsh et al. [13]_認為選擇 敏感性較佳之物種比選擇具代表性之本土物種來的重要，因為污染物可能會很輕 易的傳輸到其他地方，因此以本土生物來進行毒性評估，可能無法保護生態環境。 而 Nyholm et al. [14]_{認為標準的生物試驗法，因其需要被廣泛的利用，所以應該選} 擇容易在實驗室中培養的物種，而不是敏感性佳或在自然中數量豐富的物種。目 前用來進行生物毒性試驗的物種很多，以美國環境保護局（U.S. Environmental Protection Agency, U.S. EPA）所訂定的標準方法為例，其列舉的試驗物種就包含 有植物及動物性浮游生物、珊瑚、甲殼類、無脊椎動物、水體昆蟲、細菌、藻類、 魚類等。以下針對本研究所使用的生物種類進行簡單的描述：

1. 魚類

魚類是最常用來做為水生態環境急毒性的測試物種，包括 Guppy、 Rainbow trout 和 Fathead minnow (Pimephales promelas)等，其中以 Fathead minnow 進行的急毒性試驗使用最廣泛，為美國環保署所使用 的標準方法之一。而本研究所使用的鯉魚（Cyprinus carpio）為我國 所使用的生物毒性試驗標準方法之一，為本土的魚種。

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2. Microtox

Microtox 毒性測試技術的基礎是利用 Photobacterium phosphoreum 這種 海洋發光細菌，其具有在進行新陳代謝作用時會發出螢光的特性，當毒 性物質抑制其正常的代謝作用時，便會使發光的強度減弱，而能用來偵 測汙染物毒性之大小。早在 15 年前，發光細菌的毒性試驗法已發展用 於評估工業排放廢水的毒性上。由於其具操作迅速簡單，試驗期間短， 再現性高且使用成本低等優點，因此能快速的篩選大量的汙水水樣，而 被廣泛運用在廢水毒性監測及學術研究上。除了上述之特性外，菌類占 了營養階層中重要的位子。 3. 水蚤 (Daphnia magna)

Daphnia magna 為 OECD 及 US. EPA 等國際組織的水生生物毒性試驗 標準物種之一，也是我國生物毒性試驗的標準物種。Daphnia magna 是 水生生物食物鏈中的重要環節，因為牠們可以是攝食水中細菌，藻類及 原生動物的食草動物，也是魚的獵物之一。[15]_{此外，水蚤是無脊椎動物中} 對多種毒性物質具高敏感性的物種(Henegar et al. [16])。 4. 藻類 在所有的生物試驗中，藻類試驗常被廣泛利用於毒性研究，在生物試驗物種 中占有一席之地，其優點條列如下： (1) 藻類為生態系統的生產者，位於營養階層底層，在食物鏈的過程中將會 由於生物濃縮作用(Bioconcentration)，間接地對高營養階層之生物造成 傷害。

9 (2) 在毒性試驗過程中，其毒性試驗期間雖短，但由於其生命週期短的優點， 在試驗期間已歷經數個生命週期，因此試驗中較不會有幼年期或衰老期 而影響毒性數據的改變。 (3) 相對於魚類及甲殼類動物試驗，藻類的毒性試驗十分簡單、快速且培養 成本較低。 (4) 藻類毒性試驗較其他生物試驗敏感性佳，且每組毒性試驗中生物的數量， 藻類會比其他生物試驗高很多，較符合常態分布，因此毒性結果可信度 高，再現性也較其他生物試驗高[17, 18]。

2.3 月芽藻毒性試驗概述

目前標準試驗方法中建議可使用的藻類種類甚多。Hornstrom et al. [19]_提出試 驗之藻種須均勻且穩定的成長，並足以代表某一生態系統。本研究室所採用的試 驗 藻 種 為 月 芽 藻 （ Raphidocelis subcapitata, Selenastrum capricornutum or

Pseudokirchneriella subcapitata）為單細胞藻類，屬於綠藻綱（Chlorophceae）。其 特徵為成群體但不具移動性，正常培養下不易糾結在玻璃壁上，以顯微鏡觀察其 外型呈現半月型。選用 Pseudokirchneriella subcapitata 作為毒性試驗藻種之原因 除了其符合前述之條件及優點外，其敏感性也較其他藻種佳(Rojickova-Padrtova et al.[10]利用七種藻類進行敏感度比較顯示)。此外，當缺少營養鹽或是溫度、光線、 pH 等環境條件不適合其生長時，藻類會逐漸呈現出黃綠色，因此可以很容易的 發現藻液遭受到污染或是培養狀況不良等情形。 藻類毒性試驗發展至今，已有許多藻類試驗的標準方法。在過去，本研究 室探討了這些標準方法之優缺點，利用了「連續式培養」法培養試驗期間所需 之月芽藻種，而在試驗方面則採用「批次 BOD 瓶式」藻類毒性試驗法，發展

10

出一套「48 小時的批次式 BOD 瓶藻類毒性試驗」Chen and Huang [20]_，其內容

描述分別如下:

(1) 連續式培養法

Chen and Lin[21]以連續式藻類母槽系統(Chemostat)為基礎進行藻類的培養，

Chemostat 的容量為四公升，培養期間不僅有新鮮基質流入也有藻類代謝物質 流出，此狀態與自然水體較為相似，而且營養鹽的供給是由蠕動幫浦來做控制， 因此可由控制稀釋率（Dilution rate，即 D =基質流入量和反應槽體積之比值） 來調整母槽中月芽藻細胞之密度，使藻種在培養期間維持在最佳的生長狀態， 可在試驗時取得長期穩定且生化特性趨近一致的藻種，有利於控制實驗品質。 此法改善了「批次式培養(Batch culture)」的缺點，「批次式培養」是將營養鹽 加入密閉的空間中，期在培養過程中可能導致營養鹽之匱乏和變質現象以及造 成藻類代謝物累積的情形，且「批次式培養」在實驗後仍繼續培養藻類，直到 藻類族群恢復正常後方可再進行下一次實驗。

11

(2) 批次藻類毒性試驗

現有的藻類標準方法，如 U.S.EPA 採用的 "Fresh water algae acute toxicity test"[22]、OECD 採用的 "Algal growth inhibition test guideline"[23]_及

ISO 採用的"Water quality-algal growth inhibition test"[24]等方法大多屬於批 次式法，但多屬於「開放式的系統(Open System) 」。「開放式系統」是可 藉由激烈的搖晃和外界空氣相通來達到氣體交換及提供藻類碳源(CO2)之 目的，但卻使揮發性有機物可能在試驗期間內揮發，造成揮發性有機物濃 度系下降以至於低估其毒性結果，因此「開放式之系統」並無法有效偵測 揮發性有機物之毒性。本研究室針對這項缺失，發展密閉式試驗系統來解 決此項問題，使用具有完全密閉系統優點之 BOD 瓶進行毒性試驗。其內 容概要為使用體積為 300mL 的 BOD 瓶，將藻類、營養鹽和試驗毒物加入 其內，再用蓋子密封，讓藻類暴露於毒性物質中 48 小時，由觀測終點量 測實驗組與無暴露控制組的抑制情形並進行比較分析。整個實驗過程中沒 有新鮮基質的加入，也沒有藻類之代謝物移出，在操作更加簡單，在時間 與成本的耗費也大幅減少，且可處理較大量的樣品數、實驗數據取得容易， 所以相對了提高實驗的再現性。同時也發現，以細胞密度及產氧量作為反 應參數，對揮發性有機物可得到再現性與敏感度皆較佳的結果。Mayer et al.[25]也指出，在不含 headspace 之完全密閉式批次實驗系統，是評估揮發 性有機物的較佳實驗方法。本研究使用了具有密閉系統優點之 BOD 瓶進 行毒性試驗。Lin[26]_{利用此 BOD 瓶藻類毒性試驗系統針對氯酚類之有機物} 進行毒性試驗，其實驗結果與一般傳統批次式藻類毒性試驗相比其敏感度 較好，Hsu[27]_{以此系統針對苯類、氯乙烷類、甲苯和氯甲苯類有機毒物進} 行毒性試驗，與開放式系統相比不會有毒物濃度隨時間揮發的問題而同樣 得到較佳的敏感度。Kao[28]_{利用本系統測出揮發性有機之毒性與傳統批次} 式方法之 EC50值相差 3～56 倍，證明了本系統應用於揮發性有機物的適用 性。

12

2.4 有機物質之毒性機制

有機毒物之毒性作用機制在毒理學中可粗略分為兩類，一類為非反應性 毒性機制（Non-reactive），另一類為反應性毒性機制（Reactive），這兩大類毒性 機制描述如下： 1. 非反應性毒性機制（Non-reactive） 一般又稱為麻醉性機制（Narcotic mechanism），麻醉性有機物又可細分為非

極性麻醉型(Narcosis I)和極性麻醉型(Narcosis II) 兩類，以下對麻醉性有機物進行 分類探討：

(1) 非極性麻醉型(Nonpolar narcotic or Narcosis I)

Konemann et al.[29]指出此類型之有機物影響生物體時，只會與生物細胞膜上 的脂質反應，因此此類型有機物之毒性可以從部分係數來計算。另外 Schultz et al. [30]_{從實驗結果中發現，這類型的化學物質所觀察到的毒性與化學物質的辛醇-水} 係數(log P)，進行線性迴歸時，其相關係數（R2值）可高達 0.85 以上，同樣顯 示這類型有機物之毒性主要來自親脂性。此外這類型的化學物質毒性符合基線 毒性(基線毒性，Baseline toxicity；所有有機物毒性機制中毒性最低的機制)，毒 性較低，通常被用來當作毒性機制毒性的比較基準。

(2) 極性麻醉型(Polar narcotic or Narcosis II)

Ren et al.[5]的實驗結果顯示這類型的化學物質毒性會較 Narcosis I 的毒性要

高一些，毒性約為 Narcosis I 建立的毒性迴歸式預測值的 2 倍到 10 倍，隨物種

而異。Kamlet et al.[31]_{指出極性麻醉型有機物其毒性較非極性麻醉型有機物高之}

13

也有其他學者認為其毒性較高之原因與有機物所帶之電荷、偶極性等不同因素 有關(Verhaar et al. [32]_{、Liao et al.} [33]_)。

整 體 而 言 ， 非 反 應 性 有 機 物 其 毒 性 主 要 是 來 自 於 有 機 物 質 之 親 脂 性 （Lipophilip），親脂性促使有機物分子附著於細胞膜或酵素表面之疏水結構上， 並將其生化作用之管道或是反應基給阻擋住了，使得養分吸收、物質傳遞等新 陳代謝之功能因而不能正常之進行，造成生命功能受損，造成與麻醉(Narcosis) 相似的毒性效應。親脂作用屬於物理性作用，有機物並未在生物體內產生化學 變化，因此，在某種程度的曝露劑量內，當毒性物質遭到移除時，毒性抑制效 應即消失，屬於可逆性之毒性作用。 2. 反應性毒性機制（Reactive） 毒性機制屬於反應性機制的毒物，其毒性除具有麻醉效應外，其官能基與生 物體內受體結合產生之化學變化為主要之毒性來源，因此這類化學物質的毒性通 常超過基線毒性回歸式非常多（差至 10 倍到 1000 倍）。這類型的化學物質通常 具有受體專一性，可和特殊受體結合，促使原先養分吸收、物質代謝等新陳代謝 進行的生化反應位址遭受破壞或抑制而產生毒性，屬不可逆性的反應。 許多學者根據毒性試驗的症狀，有機物的反應機制，生物代謝，和特殊受體 結合能力分為許多種不同類型毒性機制。如 Russom et al.[3]_{是將有機物分為一般} 性 (General) 和特異性 (Specific) 兩大類型。一般性毒物是指麻醉作用在細胞膜 非特定的位置上；而特異性毒物又可稱為反應性毒物，它會作用在細胞的特定位 置上或抑制特定的反應，其中包含以下四種特殊的抑制作用：

1. Oxidative phosphorylation uncouples (氧化磷酸非偶合) 2. Respiratory inhibitors (呼吸抑制)

3. Electrophiles/proelectrophiles (親電性/前親電性) 4. Acetycholinester inhibitors (乙醯膽鹼酶抑制)

14

第三章 基本理論

3.1 濃度（劑量）反應模式

毒理學上，劑量與反應關係(dose-rseponse relationship) 是探討化學物質對生 物體所造成影響之基礎。進行生物毒性試驗時，生物體受毒性物質影響或死亡之 百分率，會隨著毒性物質濃度的變化，而呈現 S 型曲線狀，此曲線稱為劑量-反 應曲線（Dose-response curve）；在劑量反應曲線座標中，通常 x 軸代表毒性物質 的濃度，而 y 軸代表毒性物質對受測生物的抑制率。在毒性試驗過程中，實驗物 種受毒性物質作用時，所造成生物體 50% 受抑制（或死亡）時所表現出的測試 物質濃度，即稱做 EC50 ( Effect Concentration 50%) 或 LC50 ( Lethal Concentration

50%)。生物體受毒性物質影響的劑量反應關係如圖 3.1.1(a)所示，圖中在死亡率 (Mortality)50%處，延伸至兩曲線所對應的毒性物質濃度，即為毒性物對生物體所 造成的半致死濃度(LC50)。但欲從 S 型曲線求得 EC50或 LC50值不容易，必須藉 由數學關係式將 S 型轉為直線型以便求取，此種數學轉換模式便稱為劑量反應 關係模式，不同的模式根據的理論基礎互有出入，因此同一組數據，經由各種不 同模式的分析，其結果可能有所差異；以生物試驗來講，不同生物甚至不同觀測 參數 ( Endpoint ) 對毒性物質容忍度不盡相同，若以不適當之反應模式計算，實 驗點與理論點間變異過大，則所得結果則相當可議，尤其在所求為外插情況下， 變異波動更加明顯，因此數據處理程序中往往需要作適合度分析，以判斷最適合 之使用模式。 本研究所使用的 Probit 模式為最常用的劑量-反應模式，其假設生物對毒性物 質的容忍度分布為常態分布(Log-normal distribution)，其主要是將毒性物質之濃度 取 log 值，而此值與反應率之 NED (Normal equivalent deviation)具有線性的關係， 其中的反應率為測試生物對毒性物質之反應比率（如死亡率等）。Probit 模式是 將劑量-反應模式之 S 型曲線，轉換成 NED 尺度上的一直線，原來之劑量-反應曲

15

線 50%反應率之處對應到 NED scale 上為 0。84.1%反應率之處對應為 1，而 NED scale 之座標值加 5 即為 Probit 的座標，Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之 轉換關係如下：

其中，Y為 Probit 的概率單位；A，B分別為反應曲線之截距與斜率；Z為毒 性物質所加之劑量濃度(mg/L)；P為受測物種對毒性物質之反應率(如死亡率(%) 等)，erf. 為Error Function。

另外，圖3.1.1(b)之數據與圖3.1.1(a)相同，差別在於圖3.1.1(b)之數據已經 由Probit 模式轉換。由此圖得知，死亡率在50%時，信賴區間最窄，也因此，許 多毒性試驗之反應終點會選擇半致死濃度(EC50或 LC50)來表示，原因在於此值於 統計中變化較小，較具可信度。

5





NED

Y

)

log( z

B

A

Y





    _   2 ) 5 ( 1 5 . 0 erf Y P

16 圖 3.1.1 毒性試驗之劑量-反應關係曲線 (a)死亡率(%)對應毒物濃度(mg/L)。(b)右側之 y 軸為死亡率轉換之 Probit 座標，對應的 x 軸為取 log 之濃度值，兩旁之虛線為 95%信賴區間。

(a)

(b)

17

3.2 多變量分析

一般在研究後會面臨有大量的數據需要處理，通常會進行統計分析，以從中 獲取有用的資訊來了解這些數據背後所代表的意義，以利進行後續的討論與決策。 分析的方法很多，從簡單的資料列表、圖表，基本的敘述統計分析再到較複雜的 多變量統計分析，可使用的方法不勝枚舉。其中多變量統計分析(Multivariate Statistical Analysis)是一種綜合性分析方法，他能夠在多個研究對象和多個指標相 互關聯的情況下分析出他們的統計規律，能讓學術研究者重資料中擷取更多的訊 息，正確的解讀分析結果。 多 變 量 統 計 分 析 之 方 法 包 括 多 變 量 變 異 數 分 析 (Multivariate analysis of variance,MANOVA)、主成分分析(Principal component analysis)、因素分析(Factor analysis)、對應分析(Correspondence analysis)判別分析(Discriminant analysis)、典 型相關分析(Canonical correlation analysis)、路徑分析(Path analysis)等，其應用的 場合各有不同，如下圖 3.2.1 示，但主要都是要能達到簡化資料且清楚了解變數 間的關係。

18

3.3 主成分分析(Principal component analysis)

生活周遭的事物往往受多個指標(變數)的影響，例如環境污染指數、國家競 爭力、大學申請入學的成績等。為了能完善的瞭解環境汙染的程度、國家競爭力 的強弱、成績的優劣等，我們並不能就單一變數來決定事情的好壞，而是必須同 時考量所有的變數，並且使用一個較具有代表性的指標來進行評估。 因而研究學者須找出影響問題變化的相關變因(變數)，進而對每個變因行統 計分析，了解它們之間個別的差異。一般就統計而言，變數間的變異數越大，會 使得受測者在這些主成份上顯出最大的個別差異，有利於瞭解變數影響問題之輕 重程度，給予變數權重做加權平均，產生一個具代表性的指標，便於分析評估。 此外，在進行分析評估時，假若變數太過於複雜，會降低評估過程的困難度與複 雜性，且當遇到較多的變數時，常會碰到某些變數間存在共線性的問題，使得有 些變數在選擇上是多餘的。為了希望所選擇的變數精簡、獨立且具代表性，又能 解釋問題中較多的變異，在這兩者之間找到平衡點是十分重要的。 主成分分析法能找出數值加權平均後的最大變異數，能從手中許多相關性較 高的變數轉化為彼此獨立的變數，並由其中選取較少且能解釋資料中大部分變異 的新變數，也就是所謂的「主成分」，而幾個所選取的主成分能用來解釋分析原 始資料的綜合性指標。

19

3.3.1 主成分分析分析架構

使用主成分分析法之目的是將原始資料中多個具相關性的變數轉換成彼此 獨立的新變數(即主成分)，並利用主成分解釋原始資料中大部分的變異，而這些 新變數即為原始所有變數的線性組合。當原始資料中含 n 個變數 x，而經轉換後 的新變數為 y，可用下列數學式來表示： 上式中，PC1即為第一主成分；PC2為第二主成分；依此類推。yi是按照解釋總變 異比例的大小來排列，即 ＞ ＞…＞ ，因此第一主成分能解 釋原始資料中最多的變異量；第二主成分次之，且能解釋第一主成分未能解釋之 變異；依此類推。所有主成分所能解釋的變異總和會等於原始資料中變異數的總 和，即： 另外，轉換式中的 w (weight，亦即權重)為轉換式中極其重要的參數，因此 需求得此參數來作變數轉換。一般以電腦軟體進行主成份分析時，原始資料是以 的矩陣形式來進行分析，先求出原始資料之共變異矩陣(Variance-covariance matrix；

S)或相關係數矩陣(Correlation coefficient matrix；R)，再計算出 S(或 R)之特徵值( )，

n nx w x w x w x w y PC 1 11 1 12 2 13 3 1 1      n nx w x w x w x w y PC 2 21 1 22 2 23 3 2 2       n nn n n n n n y w x w x w x w x PC   1 1 2 2 3 3

)

(

y

1

Var

Var

(

y

2

)

Var

(

y

n

)





 



n i i n i i

Var

x

y

Var

1 1

)

(

)

(



20 而每個主成分皆有其對應之特徵值，分別為 , ,…, ，且 ＞ ＞…＞ ， 緊接著會求出其所對應之特徵向量： = ， = ， ， = 所謂的特徵向量即為上述提及之權重 w，其中特徵向量是正交(orthogonal)且獨 立的，亦即 =1， =0。 當原始變數共有 n 個，經運算後可得到 n 個主成份個數，但為了達到簡化的 目標，只選取最大的 p 個新變數，來代替原來的 n 個變數。每一主成分( )解釋 變異的比例為： 而前 個主成分共同解釋全部變異的比例則為： 在從事主成分分析時，另一點值得注意的是，如果分析的問題中變數的單位 不一樣時，則應將原始變數的資料標準化，然後再進行分析。主要原因在於，如 果單位不一樣時，分析所得的主成分也會跟著改變。此時可使用相關矩陣 R 取代 共變異數矩陣 S 再求特徵值及特徵向量。 1





2



n



1



2



n 1

w





















n

w

w

1 11



w

2





















n

w

w

2 21





w

n





















nn n

w

w



1 i w wi wi

w

j i

y

 

 

 

 

_





     n i i n i i n i i Var x y Var y Var y Var 1 1 1 1 1 1





p

 

 

_







    _ n i i p i i n i i p i i y Var y Var 1 1 1 1





21

3.3.2 主成分個數之選取

主成分個數選取的原則在於，所選取的主成分必須能共同解釋大部分原資料 中的總變異。某些統計軟體(如 SPSS、Minitab 等)內設值是以特徵值大於 1 來做 為保留主成分的依據。另外，也可藉由陡坡考驗(scree plot)來做為選取的依據。 陡坡考驗圖的繪製原理是將特徵值依序排列後，繪製出一條由左上往右下走向的 曲線圖，如圖 3.3.1 所示。其判斷準則是找出該曲線特徵值突然驟降之轉折處， 該轉折處以上的幾個特徵值就是可以保留下來得主成分。 圖 3.3.1：陡坡圖

22

3.3.3 主成分分析結果之解釋與應用

一般將原始數據進行主成分分析後，主要會以兩張散佈圖來呈現分 析結果，此兩張圖分別為成分負荷圖(Loading plot)與成分得點分數圖 (Score plot)，其分別是由主成分負荷(Loading)與主成分得分分數(Score)繪 製而成，利用成分負荷值及成分得分分數在圖中的相對位置，能瞭解觀測 樣本資料與變數之間的相關性。以下分別進行說明：

一. 主成分負荷

主成分負荷值(Cji)可利用上述提的特徵向量運算得到，其公式如下： (原始資料已標準化)

(原始資料未標準化) 其中 為第 個主成分的特徵值， 第 個變數的標準差， 為權重。 主成份負荷值的大小常用來定義或解釋主成分的意義，當主成分中原 始變數所對應的負荷值越大時，表示該變數在解釋主成分變異量上的重要 性越高、影響力越大，一般取負荷值在 0.5 以上為取捨標準。由於新變數 (主成分)是原始數據中所有變數的線性組合，所以沒有既定的名稱，藉此 可利用幾個負荷值較高的原始變數，判斷它們之間的共通性，對新變數(主 成分)進行命名的工作。 j ji ji

w

C





i j ji ji

S

w

C





j



j

S_i

i

Wji

23

二. 主成分分數

主成分得分分數(A_m)可用前述之主成分負荷值計算而得到，首先須將原始 數據進行標準化處理，使其平均值為 0，變異數為 1，即 其中 為原始變數之平均值； 為所有變數之標準偏差 主成分得分分數(Am)即等於： 其中 Cji為第 j 個主成分中第 i 個變數對應的負荷值；m 為觀測樣本數 將計算所得之主成分得分分數繪製成主成分分數圖後，圖中的得分點即為觀 測樣本經變數之負荷值影響後的散佈位置。當原始的觀測樣本具相關性時，於主 成分分數圖中的位置也會較為接近。因此利用主成分分析之結果也可將觀測樣本 資料進行分類如下圖 3.3.2 所示，圖中可觀察到 A、B、C 被分為一類；E、F、 G 被分為另一類；而 D 自成一類。 i i ji ji

s

x

x

x







i x si









n i ji ji m

C

x

A

1

24

25

3.4 集群分析(Cluster analysis)

群集分析法(Cluster analysis)的目的是將大量的觀測樣本資料，依資料中變數 的共通性質進行分群的分析方法。經由集群分析後，在同一集群內的觀察樣本具 有高度的同質性；反之，則具高度的異質性。 在前一章介紹主成分分析時，提到可以利用其分析結果，計算其對應各主成 分的主成分分數(principal component scores)，可以用來將觀測資料進行分類。作 法在本質上有所不同，但其分群結果不一定會有很大的差異，可進行分析結果的 比對，確定統計結果之正確性。一般進行集群分析時，會按照以下的步驟來進行： 1. 選擇衡量觀察值間相似性(距離)的方式 2. 選擇集群的分類方法，並決定集群數 3. 繪製集群樹狀圖，解釋分群解果 以下將針對上述步驟做重點式的說明。

3.4.1 選擇衡量觀察值相似性(距離)的方式

集群分析根據變數的測量值將性質相近的觀察值歸為同一類，因此在進行 分析時，首先要計算出觀察值之間的相似性，其方法包括：

26 1. 點間距離 測量兩觀察值間的相似性最常見的方法就是計算二者間的距離，而 常用的方法包括： (1) 歐氏距離(Euclidean distance) =

(2) 歐氏距離平方(Squared Euclidean Distance)

=

由於歐幾里得距離必須計算平方根較麻煩，因此在集群分析上多採 用歐氏平方距離(Square Euclidean distance)做為分群之依據。

(3) 馬氏距離(Mahalanhois distance) 當變數間測量單位有差異時會影響統計結果，馬氏距離法是另一種 克服此題的方法。其相當於歐氏距離在乘上一權數 ，可將變數之變 異程度及相關程度納入考慮。 為變項間之變異數共變數矩陣，如下 所示： 將歐氏距離乘上 後，即構成馬氏距離： = xy d



  p i i i y x 1 2 ) ( xy d



  p i i i y x 1 2 ) ( 1 





              p p p p p 2 2 1 2 2 2 21 1 12 1 2



















       1 



xy d ( ) 1( ) i i i i y x y x   

27 2. 相關係數 除了以距離來表示變項之間的相似性外，也可直接利用相關係數來做為集群 分析分類的依據。兩觀察值間的相似性越高，代表愈密切。

3.4.2 集群的分類方法

在選擇計算觀察值間相似性的方法後，距離最近的點已被歸為一群，如要進 一步分群，則需額外計算以分在一群觀察點全體，與其他尚未分群的每一個觀察 點 的 距 離 。 各 種 集 群 分 類 的 方 法 ， 依 照 分 類 過 程 的 差 異 ， 可 以 分 為 階 層 (Hierarchical)與非階層 (Non-hierarchical)兩種分群的原則。分別說明如下： 1. 階層式集群法

階層群集分析(Hierarchical Cluster Analysis, HCA)是廣泛被應用的一種方法， 基本算法是將每個樣本資料各自成一群集，再根據相似性計算原則，將相似性最 高的兩個樣本合併成新的群集，並重複合併作業，直到所有樣本資料都被歸為同 一群集為止。合併的過程可用樹狀圖(Dendrogram)的方式加以圖示。其分類的方 法包含單一鏈鎖法(Single linkage)、完全鏈鎖法(Complete linkage)、平均鏈鎖法 (Average linkage)、中心法(Centroid linkage)及華德最小變異法(Ward’s method)，

其中群間距離的計算以華德法(Ward’s method)之應用較為廣泛。華德法計算 A、

B 兩群距離是以 A 群中心點 到兩群合併中心點 距離平方乘 A 群個體數，與 B 群中心點 到兩群合併中心點的 距離平方乘以 B 群的個體數之和，即： = A X

X

B

X

X

AB d n_A XAX 2n_B  XBX 2

28 2. 非階層式集群法 非階層式集群法以所謂 K 組平均法 (K-means) 為主。其在作法上要先確 定欲分群的群數，將所有樣本觀察值隨機各自歸入其中的一群，接著根據各觀 察值到各集群中心之距離遠近，重新將觀察值移動到距離最近的集群，再次重 新計算各集群的中心及觀察值到各集群之心距離，再次移動觀察值，重複這樣 的步驟，值到整個分類結果穩定為止，便完成分群的工作。其主要缺點在於要 先主觀的決定所要分群的群數，造成統計的誤差。

29

第四章 實驗材料與方法

4.1 儀器設備與試劑

4.1.1 Microtox 生物毒性實驗：

1. 微毒測量儀：Microtox Model 500, Microbic’s 製。

2. 生物試劑( Reagent )：海洋發光菌Vibrio fisheri (費氏弧菌)之商用冷凍乾燥試 劑, 典試科技總代理

3. 稀釋液( Dilution water )：主要成分為濃度2%之NaCl無毒性溶液，功用為稀 釋樣品。 4. 活化液( Reconstitution solution) ：活化液為經過0.2μm濾紙三次過濾後之無 菌去離子水，功用在於活化冷凍乾燥狀態下的螢光菌。 5. 滲透壓調節液( MOAS ) ：滲透壓調節液主要成分為22%氯化鈉(NaCl)之無毒 性溶液，其功能為調整樣品之NaCl濃度達到2 %左右，與螢光菌本身之滲透 壓相等。其用量多寡與取用樣品體積的關係如下: X ml sample * 0.1 = 所需的滲透壓調節液體積

30

4.1.2 鯉魚靜水式毒性試驗：

1. 鯉魚 使用全長（上顎前端至尾鰭後端的長度）2.0 至 3.0 公分之鯉魚幼魚，本實驗 之鯉魚苗來源為新屋及彰化淡水魚苗養殖場。 2. 溫度恆溫控制設備 使用臻美公司訂製之循環式水浴槽並配合室內空調恆溫方式，將馴養水溫及試 驗水溫控制在 25 ± 2℃。且內含溫度監測裝置，可顯示毒性試驗期間試驗水 樣之最高及最低溫度 3. 馴養容器 使用 150L 之普力桶作為馴養的容器，每桶約放置 200 隻鯉魚。 4. 試驗容器 使用 2 L 之硼矽玻璃燒杯。 5. 溶氧測定儀

使用美國 YSI 公司出品之微電腦溶氧測定儀，Model YSI 5100，附有 Model 5010 溶氧測定探頭 (BOD Probe) ，其探頭部分裝有電動攪拌器，可以對樣品 進行攪拌。溶氧量測定範圍為 0.0 ~ 60.0 mg/L，精準度為 ±0.1%。 6. 酸鹼度（pH）測定儀 使用 Suntex 公司，Model SP-2200 之pH 測定儀。其精確度為± 0.01%。 7. 導電度計 使用 Lutron 公司，Model CD-4306 之比導電度計。 8. 餘氯計 使用 Motortech 之 Micro7+ 餘氯計。

31 9. 分析天平 量測藥品用，產牌 Precisa 205A，精確度至0.01mg。 10. 曝氣機 使用一般水族使用之曝氣設備，使馴養水中之溶氧充足。 11. 水循環過濾裝置 使用上部及外接式過濾器材，內含白棉(過濾用)、生化棉以及陶瓷石英環。 12. 馴養水 本實驗使用稀釋水作為馴養水，其硬度在 80 至 100 mg CaCO3/L 間。稀釋水之 配方如下： 每一 L 之試劑水含下列成分（試藥級以上）： 碳酸氫鈉（NaHCO3） 96.0 mg 七水硫酸鎂（MgSO4‧7H2O） 123.0 mg 氯化鉀（KCl） 4.0 mg 二水硫酸鈣（CaSO4‧2H2O） 60.0 mg 13. 參考毒物 氯化鈉，試藥級以上。

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4.2 試驗之毒化物

本研究所選用之二十種的有機毒化物，其依據Russom et al.[3]對毒性機制的分

類，可分為七種非極性麻醉(Non-polar narcosis)、四種極性麻醉(Polar narcosis)以 及九種反應性(Reactive)機制的有機物，其中九種反應性有機物又被Russom et al. [3]_{分作四種特殊的作用機制(mode of action)，包括兩種氧化磷酸非偶合、兩種呼} 吸抑制型、三種親電與前親電性和兩種乙醯膽鹼酶抑制之有機物。 通常反應性有機物之毒性會比用疏水性參數所預測的毒性高出甚多，且反應 性有機物通常因具有特別的作用模式，會與特殊的受體作結合，使物種間敏感度 之變異性提高。從環境保護的角度上來看，這些具特別作用機制的有機物是需要 特別關注的。本研究選擇將這二十種有機物視為一種富含各種毒性機制之廢水， 主要目的是希望能增加統計分析結果上之準確性，以利選擇適合評估環境毒性危 害的"組生物"。表4.2.1為本研究選擇有機物之結構與物化特性。

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表 4.2.1 有機物之結構與物化特性

Chemical CAS No. Formula M.W. Structure

Henry’s law constant (atm-m3/mole) Log P Solubility (mg/L) MOA

Benzene 71-43-2 C6H6 78.11 5.55E-03 2.13 1.79E+003 NP

Toluene 108-88-3 C7H8 92.14 6.64E-03 2.73 5.26E+002 NP

Methylene chloride 75-09-2 ClH2Cl 84.93 3.25E-03 1.25 1.3E+004 NP

1,3-dichloropropane 142-28-9 C3H6Cl2 112.99 9.76E-04 2.00 2.75E+003 NP

Ethanol 64-17-5 C2H6O 46.07 5E-006 -0.31 1E+006 NP

Propionitrile 107-12-0 C3H5N 55.08 3.70E-05 0.16 1.03E+005 NP

Pentachloroethane 76-01-7 C2HCl5 202.29 1.94E-03 3.22 4.8E+002 NP

Aniline 62-53-3 C6H7N 93.13 2.02E-06 0.90 3.6E+004 P

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Chemical CAS No. Formula M.W. Structure

Henry’s law constant (atm-m3/mole) Log P Solubility (mg/L) MOA

Phenol 108-95-2 C6H6O 94.11 3.3E-007 1.46 8.28 E+004 P

2-chlorophenol 95578 C6H5ClO 128.56 1.12E-05 2.15 2.85E+004 P

Pentachlorophenol 87-86-5 C6HCl5O 266.34 2.45E-008 5.12 14.00 OPU

2,4-dinitrophenol 51-28-5 C6H4N2O5 184.11 8.6E-008 1.67 2.79E+003 OPU

Acetaldehyde 75-07-0 C2H4O 44.05 6.67E-05 -0.34 1E+006 EP

Glutaraldehyde 111-30-8 C5H8O2 100.12 2.39E-08 -0.18 1.67E+005 EP

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Chemical CAS No. Formula M.W. Structure

Henry’s law constant (atm-m3/mole) Log P Solubility (mg/L) MOA

Chloroacetonitrile 107-14-2 C2H2ClN 75.50 1.08E-005 0.45 1E+005 RI

Malononitrile 109-77-3 C3H2N2 66.06 1.31E-007 -0.60 1.33E+005 RI

Parathion 56-38-2 C10H14NO5PS 291.26 2.98E-007 3.83 11 AI

Malathion 121-75-5 C10H19O6P1S2 330.35 4.89E-09 2.36 143 AI

-Log P、M.W.、Henry’s law constant、Solubility data from EPIWEB version 4.0 software -Structure’s picture from chemexper.com

-以上有機物皆為非發性或半揮發性，其區分原理為： - 揮發性有機物定義為：亨利常數＞10-3 atm-m3/mole -半揮發性有機物定義為：亨利常數介於 10-3 ~10-7 atm-m3/mole -非揮發性有機物定義為：亨利常數< 10-7 atm-m3/mole

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4.3 試驗方法

4.3.1 藻類毒性試驗

在本研究中，密閉式月芽藻之毒性數據取自過去實驗室已建立的毒性資料庫， 試驗方法為本研究室發展之「48小時BOD瓶藻類毒性試驗」，其方法介紹如下： (一) 試驗藻種 本研究中，採用植物性浮游生物，在分類上屬於綠藻綱(Chlorophceae）的月 芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata) ，其特徵為單細胞、成群體但不糾結、不 能移動，一般細胞體積為 40-60 μm3_{，體型呈半月型。U.S. EPA、ISO、OECD 及} APHA 等單位之藻類毒性試驗，皆使用此藻種做為標準試驗物種之一。本實驗之 月芽藻種購自於University of Texas, Austin。

(二)

培養基配製

本研究使用之培養基質為參考 U.S. EPA 使用之營養基質組成，配製方法如下： 將下列 1 ~ 7 的貯備液 (Stock Solution) 各加 1 ml 至含 900 ml 去離子水 中，再稀釋至 l 公升。接著以 0.l N 當量濃度的 NaOH 或 HCl 將營養基質之 pH 值調至 7.50±0.10，用錫箔紙包覆後置於 4 ℃冰箱中保存。 1. 硝酸鈉貯備液：溶解 12.750g NaNO₃ 於 500 ml 去離子水。 2. 氯化鎂貯備液：溶解 6.082g MgC1₂．6H2O 於 500 ml 去離子水。 3. 氯化鈣貯備液：溶解 2.205g CaCl₂．2H2O 於 500 ml 去離子水。 4. 硫酸鎂貯備液：溶解 7.350g MgSO₄．7H2O 於 500 ml 去離子水中。 5. 磷酸氫二鉀貯備液：溶解 0.522g K₂HPO₄ 於 500 ml 去離子水中。

37 6. 碳酸氫鈉貯備液：溶解 7.5g NaHCO3 於 500 ml 去離子水中。 7. 微營養鹽貯備液：溶解下列所有藥品於 500 ml 去離子水中。 92.760 mg H3BO3 0.714 mg CoC12．6H2O 207.690 mg MnCl2．4H2O 3.630 mg Na2MoO4．2H2O 1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2．2H2O 79.880 mg FeC13．6H2O 150 mg Na2EDTA．2H2O 其中微營養鹽貯備液中，EDTA 分別有 100%、10%及 0%三種。100%是使用於 活化藻類時，而在連續式母槽中培養藻類時使用 10%，進行實驗時則使用不含 EDTA 之貯備液。最後配成之營養基質，其所含巨量及微量營養素濃度列於表 4.3.1及表 4.3.2。營養基質的滅菌是以 0.45 µm 的濾膜過濾，過濾滅菌後的營 養基質須保存在 4 ℃ 且置於陰暗無光線照射處，以避免產生光化學反應。

38 表 4.3.1 微藻營養鹽之組成 化合物 濃度 (mg /L) 元素 各元素實際濃度 (mg /L) NaNO3 25.5 N 4.20 MgCl2．6H2O 5.7 Mg 2.90 CaCl2．2H2O 4.41 Ca 1.20 MgSO4．7H2O 14.7 S 1.91 K2HPO4 1.04 P 0.186 K 0.649 NaHCO3 15.0 C 2.14 Na 11.0 表 4.3.2 微藻營養鹽之組成 (EDTA 成分) 化合物 濃度 (µg /L) 元素 各元素實際濃度 (µg /L) H₃BO₃ 186 B 32.5 MnCl₂．4 H2O 264 Mn 115 ZnC1₂ 3.27 Zn 1.57 FeC1₃．6H2O 96.0 Fe 30.0 CoC1₂．6H2O 0.78 Co 0.354 Na₂MoO₄．2 H2O 7.26 Mo 2.88 CuCl2．2H2O 0.00900 Cu 0.0400 Na2 EDTA．2H2O 300

39

(三) 實驗前準備工作

連續式藻類培養與保存

實驗物種 Pseudokirchneriella subcapitata 在進行實驗前必須經過 2~7 天的

預培養，使之平均細胞體積 (mean cell volume) 達到 39-46μm3，而藻類細胞數

量達到 1.9~2.0×106 cells/mL，在此條件下才取藻液進行實驗。在培養藻類最需 注意的步驟為微營養鹽貯備液的加入方法，一開始活化藻類加的是stock1 (100％ EDTA)，而在連續式母槽中培養藻類時使用的是stock2 (10％ EDTA)。此外液態 營養基質中之藻類可在 4 ℃下保存四個星期，於四個星期之後做移植以繼續培 養保存菌種。實驗條件依據 Lin[21, 34]所決定之適當的條件下進行，條件如下： (1) 溫度：藻類之培養及毒性試驗皆在24 ± 1℃下進行。 (2) 光度：藻類之培養及毒性試驗皆在光度為 4300 ±10% Lux 下進 行，所使用之光源為連續白冷光。 (3) HCO₃ 濃度：15 mg/L。 (4) pH：初始 pH 為 7.50 ± 0.01。 (5) EDTA 含量： 100% 是使用於活化藻類時，而在連續式母槽中培 養藻類時使用 10% ，進行實驗時則使用不含EDTA 之貯備液。 (6) 試驗時間：48 hr。 (7) 藻類初始植種密度：1.5 × 104 cells / ml。 (8) 振盪頻率：100 rpm

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(四) 密閉式藻類毒性試驗方法及步驟

1. 實驗方法

在進行藻類毒性實驗前，先查尋過去是否有學者亦是以藻類進行毒性試驗， 並參考其實驗結果，接著以文獻中所記載之濃度，於實驗前進行配製。若查無以 藻類進行毒性試驗的資料時，則以文獻中的實驗數據與本實驗室過去實驗數據之 間的關連性，進行實驗毒物濃度的預測。每次所進行之藻類毒行試驗均包括無添 加毒物的控制組，以及添加七種不同濃度的處理組，進行三重覆的分析。最終分 別以溶氧、藻類顆粒數、以及生長率，做為觀測終點 (End point)，並利用Probit 模式計算出各種毒物對藻類所造成 50% 抑制時的濃度 (EC50)。 2.

實驗步驟

本藻類試驗屬於四十八小時的急毒性試驗，圖4.3.1為密閉式藻類毒性試驗 流程暨裝置示意圖。以下針對實驗進行之步驟1 ~ 8即為尋找EC50範圍的實驗程序

（range-finding test），而實驗步驟 9為確定試驗（definitive test）：

(1) 當確定連續式培養母槽穩定之後，即可以開始進行藻類毒性試驗。毒性試 驗之營養基質為參考 U.S. EPA 標準方法，而後修改濃度配製。 (2) 將自行設計之去離子水曝氣設備裝滿的去離子水，裝完後用 NaOH 調整 pH 值至 7.50± 0.01，氣體鋼瓶進行曝氣 15 分鐘 (如圖 4.3.2)。曝氣的目的是 為了降低營養基質中之溶氧值並增加其 CO2濃度。經過 5 ~ 6 分鐘的曝氣 後，溶氧值可接近 1.0 mg/L。迅速將下口瓶之蓋子蓋上。