藻類毒性實驗

z 玻璃器皿：

使用無磷清潔劑清洗後，以自來水沖洗數次，而後泡至 10%

HCl 溶液至少 1 小時，取出後以 Na₂CO₃ 溶液中和。最後再以 自來水沖洗約 5-6 次，去離子水沖洗 3、4 次後放入烘箱中加 以烘乾 （溫度約保持於 50℃）。使用前面通口處封上鋁箔，然 後置於設定為 1.1 kg/cm²，121 ℃ 的滅菌釜中滅菌 15 分鐘。

z 母槽：

先用不含磷的清潔劑清洗後再用自來水沖洗數次，直到不見 泡沫為止；之後再用去離子水清洗，瀝乾後，在母槽上的各個通 口覆上錫箔紙，放入滅菌釜中滅菌 15 分鐘後，取出放至室溫後 才使用。

2. ISOTON II 溶液的配製：

加 200g NaCl 於 20 公升的超純水中完全混合，並以電導計 測其導電度，其導電度應為 17 mmho。若超過 17 mmho，則以 超純水稀釋直到導電度為 17 mmho，若低於 17 mmho，則加入 少量 NaCl 直到導電度為 17 mmho。此溶液以 0.2 µm 濾紙過濾 即得 Isoton II 溶液。其主要作用在於當作電子顆粒計數器之導 電溶液用。

3. 電子顆粒計數法及操作原理：

在電子顆粒計數器內有一根玻璃管，操作中需浸入含有 Isoton II 稀釋樣品的燒杯中，水樣在量測的過程須加以攪拌以使

顆粒均勻分佈。而在玻璃管近底端的側面鑲有紅寶石的精準小圓 孔，藉以吸取水樣。在玻璃管內外各有一電極片通以直流電，當 水樣中所含之顆粒經過圓孔時，會暫時性地干擾到電流，形成某 特定量的電阻。而電阻量化透過示波器的波峰顯示，其高度正比 於顆粒的大小，且脈衝數即是顆粒的數目，直接由電子記數器記 錄顯示。電子顆粒計數器主要條件設定如下表 4.2.3。本實驗採 用 50 µm 孔徑之毛細玻璃管，其設定之量測粒徑上下限為 2.622 µm 至 60 µm。量測時，取 1 mL 的藻液置入 50 mL 之定 量瓶內，再加入 Isoton II 至 50 mL 。將之倒入燒杯，放進顆粒 計數器內量測。以顯示之讀數值扣除空白顆粒數之數值 (純 Isoton II 之背景值) 【*註 1】，連續三次其值相差在 2 % 者之平 均值為量測值。

表 4.2.3 The conditions of Coulter counter

Conditions Values Full scale 10Ma

Polarity + Currents , I 100

Diameter Lower Threshold , Tl 2.622µm Diameter Lower Threshold , Tu 30µm

Attenuation , A 1

Preset Gain 1

Alarm Threshold OFF Analysis amount 500Μl

*註 1：藻液每毫升顆粒數 (cells/mL) =

(扣除空白組數值後之三次讀值平均值 / 0.5 mL) ×50 4. 溶氧測定器的校正：

一般溶氧測定器可使用飽和空氣於水中校正與空氣校正兩 種，但因前者須將水曝氣至 100％ 相當困難，因此建議採用空 氣校正法。茲將空氣校正法介紹於下：將電極置於 2.5 公分左 右水量之 BOD 瓶 (可視同 100％溼度)，轉鈕至校正鍵，輸入校 正值 (100％)，確認後轉回一般測定鍵，連續反覆校正三次。每 月定期更換 CLARK-TYPE 薄膜與 3M 氯化鉀電解質；若有必 要時，需以亞硫酸鈉 30％ 將 PROBE 表面清洗乾淨，不要殘留 任何化學物質，而得 0％ 之 DO 溶液，進行零點校正。

5. 藻類毒性實驗步驟：

當以上準備完畢即可進行藻類毒性實驗，詳細步驟如下:

(1) 稀釋水配置

毒性試驗的營養鹽參考 U.S. EPA 建議配製，適當地修正濃 度作為本試驗的營養鹽；以含 0.5％ CO₂ 的 N₂ 氣體 （流量為 600 mL/min） 對營養鹽進行曝氣，降低水中的溶氧值並提高其 CO₂ 含量，再以 0.1N 的 NaOH 和 HCl 將營養鹽的 pH 值調 整至7.5 ± 0.1，完成營養鹽的配製。

(2) 毒物添加

從培養母槽（steady state 狀態）中取出所需之藻液與上述之 營養鹽混合成所需濃度，接下來再加入不同之毒物濃度（含一組 控制組及六組處理組）的試驗瓶，一組實驗做三重複組；此時須

注意各瓶中的營養鹽濃度與初始細胞密度應該相同，本實驗之初 始細胞密度設定在15,000 cells/ mL，進行毒性試驗，且另外再量 測初始溶氧值 （Initial DO，在此要注意曝氣的時間及狀況，盡 量讓初始溶氧降為最低）。

每種毒物之第一次試驗需先進行 range finding 的測試，得到 毒性作用的主要範圍濃度，當範圍確定後，取適當倍數配製七個 濃度，再進行確定試驗。

(3) 實驗終點

經過 48 hr 的毒性物質曝露後，量測各加入不同毒物濃度後 的試驗瓶之溶氧值（Final DO），扣除起始之溶氧值得到淨溶氧 值（∆DO），同時利用顆粒計數器測量瓶中細胞密度扣除初始細 胞密度15000 cells/ml，以求得藻類生長率。利用水樣濃度與上述 參數，透過 Probit 模式分析，求出毒性物質之 EC₅₀ 值與劑量 曲線圖。

圖 4.2.1 藻類毒性實驗流程圖 將藻類置於光度64.5 ± 10%

µEm-2s-1 溫度24 ± 1℃ 下培養

移入母槽中繼續培養至穩定 ( 細胞數約 1.7×106-1.9×106 cell/mL

MCV 約 39-46µm3 )

自母槽中取出藻液

以15000 cells/mL 之初始細胞密度 加入BOD 瓶中

再加入純水、培養基與毒性物質 測初始溶氧後水封

藻類密閉式毒性試驗 Range finding 與確定試驗

測最終溶氧值、細胞數 帶入 Probit 模式中求得各化合物之

EC50與劑量反應曲線

4.2.3 化學物質之配製與定量