試驗中的重要參數控制

藻類毒性試驗若是在實驗中採用不同的物化參數，將會影響藻類 的生長情形與對化合物的敏感性，因此容易造成實驗結果不ㄧ，也導

致不同的藻類毒性試驗資料存在許多差異，故評估文獻中之藻類毒性 試驗資料時，通常必須參考其試驗方法一起評估。有許多的控制因子 都會影響藻類毒性試驗的結果，本研究實驗中所考慮的重要參數分成 環境條件、營養鹽濃度、毒性試驗植種量與時間三部份彙整如下：

1. 環境條件:

環境條件包括各種可影響藻類生長的參數，以下針對 pH 值、光 照強度與溫度分別說明如下。

(1) pH 值

藻類因行光合作用，故導致 pH 值會產生變化，因此有些學者主 張 pH 值可以不需要控制，讓藻類在合理的 pH 值範圍內暴露於毒性 物質下進行試驗。Lin et al.在密閉式藻類毒性試驗中，並未刻意對整 個系統的 pH 加以限制，發現在水中溶解性金屬對於藻類的抑制率 若高於20% 時，系統中 pH 的濃度變化大部份皆在 1.5 個單位以下，

因此認為在藻類毒性試驗中，不需限制系統中 pH 的變化 [33]。

不過如此將使重複試驗不易進行，而且用來預測在某特定的 pH 值狀況下之物種濃度影響也有困難。因此標準藻類毒性試驗皆傾向將 pH 值維持在固定範圍內。

以毒理學的觀念而言，pH 值若變化一個單位，可能導致毒性改 變 10 倍以上； pH 控制值隨著不同的標準方法而有差異， U.S. EPA 規定最終 pH 值需在 8.5 之下 [35]，OECD 則要求 pH 值之最大變 動不要超過一個單位 [36]；ISO 則是要求 pH 值之變動在 1.5 個單 位之內 [37]。若決定試驗在一固定 pH 值下進行時，就必須小心的確 保 pH 值變化量為最少。減少 pH 值改變的方法大致有下列幾種：

使用較低之生物接種量、縮短整個試驗之時間、以空氣或是添加二氧

化碳之空氣加以曝氣。本研究為減少 pH 值所產生的誤差，仍在毒性 試驗前將 pH 值控制在 7.5±0.1 之間，

(2) 光照強度

光照的強度會影響藻類行光合作用之速率，因而造成其產氧率之 不同 [41]。藻類毒性試驗之中，光照的強度依照不同的試驗標準及不 同藻種而有些許的差異。在實驗室培養藻類時必須要考慮「自身遮蔽」

效應 (self-shading)，此效應會造成距光源較遠處之光照與較近處之光 照強度之差異，良好的混合可以減低自身的遮蔽效應並使光照有更好 的利用效率。光照強度在良好的培養條件之下，應為一常數並能使藻 類呈現指數生長、縮小培養體積及維持充分的混合有助於達到理想狀 態。

(3) 溫度

當溫度逐漸增加時，藻類會呈現指數生長，而當達到其最適生長 溫度後即迅速下降。本研究採用 U.S. EPA 建議的 24 ℃ 環境下來培 養藻類及進行實驗，整個培養及試驗過程中，溫度之變化不可大於 2

℃，因此本研究所有藻類培養與毒性實驗皆在 24±1 ℃之恆溫室下進 行。

2. 植種數量與時間

對批次式實驗而言，若實驗開始時的植種數量過高，將會造成實 驗後期由於藻類細胞大量增加造成代謝物累積及水中碳源耗盡，而導 致 pH 值升高等問題，進而影響毒性試驗結果之精確度。Lin 針對不 同試驗時間和不同初始植種密度進行敏感度和變異性的分析，發現生 物毒性試驗隨著時間增加，其敏感度提高而 C.V.值減少；而隨著初始 植種密度減少，其敏感度提高但 C.V.值亦提高 [42]。而根據 Vasseur

and Pandard [43] 改變初始生物量進行批次試毒性試驗，結果也證實 當提高實驗初始生物量時，EC₅₀ 值也顯著提升。在兼顧兩者的考量 下，本研究選定之最佳化藻類初始植種密度為 1.5×10⁴ cells/ml。

而試驗時間的長短會關係到毒性試驗的敏感性和數據結果。過長 的試驗時間，會使得存在於BOD 瓶內的營養鹽不足，使藻類死亡現 象增加，此外過長的試驗期間，也會使得毒性的反應消失。本實驗選 定的時間為四十八小時。

5. 試驗基質

一般為使試驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微 量元素，在未受污染的水體中螯合物的 (EDTA) 的濃度不超過 30 µg/L [44]，於試驗時會在培養基中加入固定量之螯合劑，如 ISO 於培 養基中加入78 µg/L 的 EDTA 螯合劑可助於藻類與水中必要元素的螯 合，如此可確保毒性試驗期間藻類維持於對數生長期。但是，從文獻 上顯示若毒性試驗過程中添加螯合劑會與常見二價金屬(Cu²⁺ 、 Cd²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺等) 形成親水性錯合物，此錯合物對微生物的 毒性相較於游離態金屬來得低，進而影響毒性試驗結果，因此本研究 於試驗時不加EDTA [45]。

Lin et al. [33] 在密閉式藻類毒性試驗中，若將營養基質成份之一 的NaHCO3由15 mg/L 增為 300 mg/L，對於酚的毒性試驗結果而言，

敏感度將降低。為了解HCO3-對於毒性試驗之影響，Lin, (2001) [42]

進行兩組試驗：一組初始細胞密度為 10⁵ cells/mL，毒性試驗時間為 十二小時，毒性物質為重金屬鋅及鎘的條件下，分別進行營養基質採 用原U.S. EPA 營養基質 (HCO3-濃度為 10 mg/L)及加入兩倍 HCO3-之 營養基質進行藻類毒性試驗，試驗終點為溶氧變化量；另一組初始細

為重金屬鋅及有機物質酚。試驗結果發現，HCO₃^-加倍後對毒性試驗 敏感度之影響並沒有一定之趨勢，而且並不會對其毒性反應造成太大 之影響。因此本研究在最初藻類活化培養時，加入 100% 之 EDTA，

於連續式培養中加入10% EDTA，毒性試驗開始時則不添加 EDTA。