第四章 結果與討論
第三節 蛇毒蛋白雙硫鍵鍵結分析
二、RADAR 搜尋結果
此處 RADAR 搜尋參數設定都為定義值，僅 missed cleavage 調整為 2 以及 maximum chain number 調整為 4。
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1. 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白 (使用 trypsin 水解酵素)
圖五十八為台南眼鏡蛇蛇毒蛋白於 pH 6 環境下，經蛋白水解酶 trypsin 水解與雙甲基化反應後，藉由 RADAR 軟體比對結果。鑑定結果得到 13 段未重複雙硫鍵鍵結胜肽 (unique disulfide peptides) 以及 4 段非預期雙 硫鍵鍵結胜肽 (scrambled disulfide bonded peptides) ，如圖六十六所 示。 硫鍵鍵結胜肽 (scrambled disulfide bonded peptides)，如圖六十六所示。
圖六十三為新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白於 pH 7 環境下，經蛋白水解酶 trypsin thermolysin 水解與雙甲基化反應後，藉由 RADAR 軟體比對結果。鑑定結 果得到 11 段未重複雙硫鍵鍵結胜肽 (unique disulfide peptides)。結果未
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鑑定出 acidic phospholipase A2 1 以及 cysteine-rich venom protein natrin-1 兩蛋白質。而 thermolysin 水解專一性不高，也有文獻指出其切點 包含 alanine 及 tyrosine 兩胺基酸，故將 RADAR 參數中蛋白水解酵素切 點從原先 6 個調整至 8 個，加入兩個 alanine 以及 tyrosine 兩胺基酸，針 對 acidic phospholipase A2 1 以及 cysteine-rich venom protein natrin-1 兩蛋白質再次進行比對。圖六十一為改變切點參數後所鑑定得到結果，於 acidic phospholipase A2 1 蛋白中鑑定到 5 段未重複雙硫鍵鍵結胜肽，在 cysteine-rich venom protein natrin-1 蛋白中鑑定到 2 段未重複雙硫鍵鍵結 胜肽。
4. 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白 (使用 thermolysin 水解酵素)
圖六十四為新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白於 pH 6 環境下，經蛋白水解酶 thermolysin 水解與雙甲基化反應後，藉由 RADAR 軟體比對結果。鑑定結 果得到 5 段未重複雙硫鍵鍵結胜肽 (unique disulfide peptides)。結果未鑑 定出 acidic phospholipase A2 1 以及 cysteine-rich venom protein natrin-1 兩蛋白質。將 RADAR 參數中蛋白水解酵素切點從原先 6 個調整至 8 個，
加入兩個 alanine 以及 tyrosine 兩胺基酸，針對 acidic phospholipase A2 1 以及 cysteine-rich venom protein natrin-1 兩蛋白質再次比對。圖六十五為 改變切點參數後所鑑定得到結果，於 acidic phospholipase A2 1 蛋白中鑑 定到 4 段未重複雙硫鍵鍵結胜肽，並未鑑定到 cysteine-rich venom protein natrin-1 蛋白中雙硫鍵鍵結胜肽。
三、MSMS 圖譜
針對 RADAR 鑑定得到未重複雙硫鍵鍵結胜肽，比對其 a1 ion 是否符 合胜肽 N 端胺基酸以及胜肽分子量與理論分子量是否吻合，接著比對 b、
49 565.3433 (2+)，分子量符合理論分子量 1128.6727 Da。圖譜中產生兩個 訊號提升的 a1離子分別為 106.06 Da 與 119.11 Da，確認 N 端為 Cys 與 565.3446 (2+)，分子量符合理論分子量 1128.6727 Da。圖譜中產生兩個 訊號提升的 a1離子分別為 106.06 Da 與 119.11 Da，確認 N 端為 Cys 與
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分析台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵鍵結，經由不同水解酵素水解後進行 雙甲基化標記實驗中，使用 trypsin 水解酵素實驗，鑑定得到 13 段未重複 雙硫鍵鍵結胜肽；使用 thermolysin 水解酵素實驗，設定兩次不同 RADAR 搜尋參數，no. of cleavage sites 6 以及 8，鑑定共得到 18 段未重複雙硫 鍵鍵結胜肽，如表 11 所示。兩蛋白水解酵素所鑑定之未重複胜肽，利用 蛋白水解酵素專一性不同特性，相互比較 trypsin 與 thermolysin 水解後胜 肽，可增加鑑定雙硫鍵鍵結位置可性度。例如，使用 trypsin 水解酵素水解 胜肽，分別為 cobrotoxin、neurotoxin、atratoxin-B、neurotoxin-like protein。
探討未鑑定出之原因，推測其中 cobrotoxin 以及 atratoxin-B 兩蛋白質無 論使用蛋白水解酵素 trypsin 或 thermolysin，由於蛋白質序列中無合適切 點，無法順利將蛋白質水解為較小片段，產生具四條雙硫鍵之單一胜肽其 分子量皆落在 5300~6500 Da 範圍內，導致分子量過大不易偵測而未鑑定 到。而 neurotoxin 以及 neurotoxin-like protein 兩蛋白質，根據蛋白水解 酵素理論水解後之胜肽分子量皆若於適合偵測範圍，分析 XIC 圖譜並無觀
51 雙硫鍵鍵結胜肽；使用 thermolysin 水解酵素實驗，設定兩次不同 RADAR 搜尋參數，no. of cleavage sites 6 以及 8，鑑定共得到 9 段未重複雙硫鍵 鍵結胜肽，如表 12 所示。兩蛋白水解酵素所鑑定之未重複胜肽，利用蛋 白水解酵素專一性不同特性，相互比較 trypsin 與 thermolysin 水解後胜肽，
可增加鑑定雙硫鍵鍵結位置可性度。表 10 為針對鑑定出之未重複雙硫鍵 鍵結胜肽，與眼鏡蛇蛇毒蛋白其雙硫鍵鍵結數據庫中之 22 個蛋白質進行 比對，分析每個蛋白質其鑑定到之雙硫鍵鍵結胜肽數目/理論產生之雙硫鍵 鍵結胜肽數目比例。結果顯示共有 17 個蛋白質被鑑定出，其中有 5 個蛋 白質並未鑑定到其對應之雙硫鍵鍵結胜肽，分別為 cobrotoxin、neurotoxin、
atratoxin-B、neurotoxin-like protein、Cysteine-rich venom protein natrin-1。
探討未鑑定出之原因，推測其中 cobrotoxin 以及 atratoxin-B 兩蛋白質由 於蛋白水解酵素無法順利將蛋白質水解為較小片段，導致分子量過大不易 偵測而未鑑定到。而 neurotoxin 以及 neurotoxin-like protein、Cysteine-rich venom protein natrin-1 兩蛋白質，根據蛋白水解酵素理論水解後之胜肽分 子量皆若於適合偵測範圍，分析 XIC 圖譜並無觀察到其胜肽訊號，推測可 能是兩蛋白質於混合物中含量較低，易受高含量之蛋白質遮蔽其訊號，故 難以鑑定。
52 個別蛋白質進行選擇，對於 cobrotoxin 以及 atratoxin-B 兩蛋白質利用蛋