利用雙甲基化標記搭配質譜儀技術自動化鑑定蛋白質雙硫鍵鍵結
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(2) 謝誌 研究所生涯彈指間落幕。在這短短日子中，我最感謝的是我的指導教 授陳頌方老師，老師充滿教育熱忱，有教無類，不厭其煩地解決我們的疑 惑，並在研究上給予寶貴建議，指引方向，使我能順利完成這份研究。老 師不僅在學術上給予指導，於球場上同樣也教導我一些打球技巧，實驗室 在老師這位大家長的帶領下，不僅氣氛和樂，也成為一個有良好運動習慣 的健康實驗室，讓我生活不單單只有實驗研究，也養成定時運動良好習慣， 真的十分感謝老師。另外我要特別感謝黃聖聿博士，黃博士總在一些我沒 注意到的實驗細節中，提醒我需要注意的地方，給予我建議以及鼓勵，解 決我的疑惑，在此要謝謝黃博士的教導。 此外還要感謝 C404 實驗室的成員；育廷學長，謝謝你教我如何鑑定 雙硫鍵，對我實驗研究上幫助很多；沛倫學長，謝謝你教我 mascot 的知 識；芷葳學姊，感謝妳奉獻智慧，幫助我解決實驗上的疑惑；昀諭學長， 謝謝你教導我 packing column 的技巧；德蕙學姊，謝謝妳教導我質譜操 作上的技巧；子瑋學長，謝謝你在質譜出問題時，幫忙我解決問題，在趕 實驗數據時，特別空出時間讓我實驗能順利進行；郡倫學姊，謝謝妳經營 的合作社，有妳在實驗室大家都有口福；俞靜學姊，感謝有妳參與的台語 教室實在非常有笑果，非常令人紓壓；珮琳，同為 QSTAR 組的戰友，謝 謝妳兩年來的互相幫忙；堯聰，謝謝你這位專業跑膠人幫忙，讓我能順利 進行短暫跑膠實驗；立平，謝謝妳這兩年在英文寫作上幫助我不少；最後 謝謝祖儀、羽薇、昀昇、佳穎，在最後這一年的幫助。 最後要感謝 ABI 工程師陳伯睿對於 QSTAR 的維護；俊懋曾鈺秀小姐 幫忙維護解決 LC 的問題。另外感謝輔大陳翰民博士及工研院曾湘文博士 在百忙之中抽空參與口試審查，並對於本研究論文給予指導及建議。最後 要謝謝支持我的家人，讓我能完成這份研究，以及曾經幫助過我的人。.
(3) 目錄 圖目錄 ..................................................................................................... III 表目錄 ................................................................................................... VII 中文摘要 .............................................................................................. VIII Abstract ................................................................................................. IX 縮寫 ....................................................................................................... XI 第一章 序論 ............................................................................................. 1 第一節、前言 .................................................................................... 1 第二節、蛋白質結構 ......................................................................... 2 第三節、生物藥物 ............................................................................ 4 第四節、眼鏡蛇毒液介紹.................................................................. 7 第五節、蛋白質結構鑑定.................................................................. 9 第六節、質譜儀介紹 ....................................................................... 11 第七節、蛋白質身份鑑定................................................................ 16 第八節、應用質譜鑑定蛋白質雙硫鍵方法探討 ............................... 18 第九節、實驗原理 .......................................................................... 22 第十節、研究動機 .......................................................................... 25 第二章 實驗材料 ................................................................................... 27 第一節. 實驗樣品 .......................................................................... 27. 第二節. 實驗藥品 .......................................................................... 27. 第三節. 實驗試劑 .......................................................................... 28. 第四節. 實驗儀器 .......................................................................... 28. 第三章. 實驗方法 .................................................................................. 29. 第一節. 蛋白質藥物水解及胜肽鏈雙甲基化反應 ........................... 29. 第二節. 非預期雙硫鍵鍵結探討 ..................................................... 30 I.
(4) 第三節. 蛇毒蛋白水解及胜肽鏈雙甲基化反應 ............................... 32. 第四節. 毛細管柱的製備................................................................ 34. 第五節. 層析參數設定 ................................................................... 35. 第六節. 質譜參數設定 ................................................................... 36. 第七節. RADAR 參數設定 ............................................................. 37. 第四章. 結果與討論 .............................................................................. 38. 第一節 蛋白質藥物雙硫鍵鍵結分析 ............................................... 38 第二節 還原劑與非預期雙硫鍵鍵結探討 ........................................ 43 第三節 蛇毒蛋白雙硫鍵鍵結分析 ................................................... 46 第五章. 結論與未來展望 ....................................................................... 52. 附圖 ....................................................................................................... 54 附表 ..................................................................................................... 141 參考文獻 .............................................................................................. 168. II.
(5) 圖目錄 圖一 Immunoglobulin G 1 結構 .................................................................................54 圖二 Bevacizumab 與 Trastuzumab 的蛋白質藥物結構圖 ........................................55 圖三 電噴灑現象示意圖 ............................................................................................56 圖四 毛細管分流進樣系統 .........................................................................................57 圖五 毛細管分流進樣系統-Load mode......................................................................58 圖六 毛細管分流進樣系統-Inject mode .....................................................................59 圖七 AB Sciex QSTAR XL 質譜儀結構圖 .................................................................60 圖八 Thermo Scientific Q Exactive 質譜儀結構圖 ....................................................61 圖九 質譜中常見胜肽碎片離子..................................................................................62 圖十 RADAR 工作原理 .............................................................................................63 圖十一 RADAR v1.0.0.5 版本介面圖示 .....................................................................64 圖十二 RADAR v3.0.0.1 版本介面圖示 .....................................................................65 圖十三 實驗研究流程示意圖 .....................................................................................66 圖十四 RADAR 流程示意圖 ......................................................................................67 圖十五 Bevacizumab RADAR 結果 (使用 trypsin + Glu-C 水解酵素, pH 7) .............68 圖十六 Bevacizumab RADAR missed cleavage 結果 (使用 trypsin + Glu-C 水解酵素, pH 7) .............................................................................................................69 圖十七 Bevacizumab RADAR 結果 (使用 thermolysin 水解酵素, pH 7) ..................70 圖十八 Bevacizumab RADAR 結果 (使用 Lys-C 水解酵素, pH 7) ............................71 圖十九 Trastuzumab RADAR 結果 (使用 trypsin + Glu-C 水解酵素, pH 7) .............72 圖二十 Trastuzumab RADAR missed cleavage 結果 (使用 trypsin + Glu-C 水解酵素, pH 7) .............................................................................................................73 圖二十一 Trastuzumab RADAR 結果 (使用 thermolysin 水解酵素, pH 7) ...............74 圖二十二 Trastuzumab RADAR 結果 (使用 Lys-C 水解酵素, pH 7) .........................75 圖二十三 Bevacizumab CL domain 的 MSMS 圖譜 ..................................................76 III.
(6) 圖二十四 Bevacizumab CH3 domain 的 MSMS 圖譜 ...............................................77 圖二十五 Bevacizumab VH domain 的 MSMS 圖譜 .................................................78 圖二十六 Bevacizumab CH2 domain 的 MSMS 圖譜 ...............................................79 圖二十七 Bevacizumab VL domain 的 MSMS 圖譜 ..................................................80 圖二十八 Bevacizumab hinge domain 的 MSMS 圖譜 .............................................81 圖二十九 Bevacizumab CH1 domain 的 MSMS 圖譜 ...............................................82 圖三十 Bevacizumab H-L domain 的 MSMS 圖譜 ....................................................83 圖三十一 Trastuzumab CL domain 的 MSMS 圖譜 ..................................................84 圖三十二 Trastuzumab CH3 domain 的 MSMS 圖譜 ................................................85 圖三十三 Trastuzumab VH domain 的 MSMS 圖譜 ..................................................86 圖三十四 Trastuzumab CH2 domain 的 MSMS 圖譜 ................................................87 圖三十五 Trastuzumab VL domain 的 MSMS 圖譜 ...................................................88 圖三十六 Trastuzumab hinge domain 的 MSMS 圖譜 ..............................................89 圖三十七 Trastuzumab CH1 domain 的 MSMS 圖譜 ................................................90 圖三十八 Trastuzumab H-L domain 的 MSMS 圖譜 .................................................91 圖三十九 Lysozyme RADAR 結果 (使用 trypsin 水解酵素, pH 7) ............................92 圖四十 Lysozyme 雙硫鍵胜肽位置於 C24-C145 的 MSMS 圖譜 ..............................93 圖四十一 Lysozyme 雙硫鍵胜肽位置於 C48-C133 的 MSMS 圖譜 ..........................94 圖四十二 Lysozyme 雙硫鍵胜肽位置於 C82-C98, C94-C112 的 MSMS 圖譜 ..........95 圖四十三 Lysozyme 胜肽雙硫鍵位置於 C24-C48 的 MSMS 圖譜 ............................96 圖四十四 Lysozyme 雙硫鍵胜肽位置於 C48-C145 的 MSMS 圖譜 ..........................97 圖四十五 Lysozyme 雙硫鍵胜肽位置於 C24-C82 的 MSMS 圖譜 ............................98 圖四十六 Lysozyme 雙硫鍵胜肽位置於 C24-C24 的 MSMS 圖譜 ............................99 圖四十七 Lysozyme 不同濃度還原劑及不同反應時間胜肽強度分佈圖 (1) .............100 圖四十八 Lysozyme 不同濃度還原劑及不同反應時間胜肽強度分佈圖 (2) .............101 圖四十九 Ribonuclease A RADAR 結果 (使用 trypsin + Glu-C 水解酵素, pH 7) ....102 IV.
(7) 圖五十 Ribonuclease A 雙硫鍵胜肽位置於 C58-C110 的 MSMS 圖譜 ...................103 圖五十一 Ribonuclease A 雙硫鍵胜肽位置於 C40-C95 的 MSMS 圖譜 .................104 圖五十二 Ribonuclease A 雙硫鍵胜肽位置於 C58-C95 的 MSMS 圖譜 .................105 圖五十三 Ribonuclease A 雙硫鍵胜肽位置於 C40-C58 的 MSMS 圖譜 .................106 圖五十四 Ribonuclease A 雙硫鍵胜肽位置於 C40-C110 的 MSMS 圖譜 ................107 圖五十五 Ribonuclease A 雙硫鍵胜肽位置於 C95-C110 的 MSMS 圖譜 ................108 圖五十六 Ribonuclease A 不同濃度還原劑及不同反應時間胜肽強度分佈圖 (1) ....109 圖五十七 Ribonuclease A 不同濃度還原劑及不同反應時間胜肽強度分佈圖 (2) .... 110 圖五十八 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR 結果 (使用 trypsin 水解酵素, pH 6) ......... 111 圖五十九 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR 結果 (使用 trypsin 水解酵素, pH 7) ......... 112 圖六十 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR 結果 cleavage sites 6 (使用 thermolysin 水解酵 素, pH 6) ..................................................................................................... 113 圖六十一 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR cleavage sites 8 結果 (使用 thermolysin 水 解酵素, pH 6) .......................................................................................... 114 圖六十二 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR 結果 (使用 trypsin 水解酵素, pH 6) ......... 115 圖六十三 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR 結果 (使用 trypsin 水解酵素, pH 7) ......... 116 圖六十四 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR 結果 cleavage sites 6 (使用 thermolysin 水解 酵素, pH 6) .............................................................................................. 117 圖六十五 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白 RADAR 結果 cleavage sites 8 (使用 thermolysin 水解 酵素, pH 6) .............................................................................................. 118 圖六十六 眼鏡蛇蛇毒蛋白未重複雙硫鍵鍵結胜肽與非預期雙硫鍵鍵結胜肽比例圖 119 圖六十七 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C21 的 MSMS 圖譜 .............120 圖六十八 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C14-C38, C42-C53, C54-C59 的 MSMS 圖譜 .............................................................................................121 圖六十九 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C22 的 MSMS 圖譜 .............122 圖七十 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C15-C40, C44-C55, C56-C61 的 V.
(8) MSMS 圖譜 ...............................................................................................123 圖七十一 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C21 的 MSMS 圖譜 .............124 圖七十二 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C14-C38, C42-C53, C54-C59 的 MSMS 圖譜 .............................................................................................125 圖七十三 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C24, C6-C11 的 MSMS 圖譜126 圖七十四 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C60-C85 的 MSMS 圖譜 ...........127 圖七十五 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C28-C44, C43-C99 的 MSMS 圖譜 ................................................................................................................128 圖七十六 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C50-C92, C78-C90 的 MSMS 圖譜 ................................................................................................................129 圖七十七 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C73-C148 的 MSMS 圖譜 .........130 圖七十八 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C56-C134 的 MSMS 圖譜 .........131 圖七十九 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C21 的 MSMS 圖譜 .............132 圖八十 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C14-C38, C42-C53, C54-C59 的 MSMS 圖譜 ...............................................................................................133 圖八十一 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C22 的 MSMS 圖譜 .............134 圖八十二 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C15-C40, C44-C55, C56-C61 的 MSMS 圖譜 .............................................................................................135 圖八十三 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C21 的 MSMS 圖譜 .............136 圖八十四 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C14-C38, C42-C53, C54-C59 的 MSMS 圖譜 .............................................................................................137 圖八十五 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C3-C24, C6-C11 的 MSMS 圖譜138 圖八十六 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C60-C85 的 MSMS 圖譜 ...........139 圖八十七 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白雙硫鍵胜肽位置於 C28-C44, C43-C99 的 MSMS 圖譜 ................................................................................................................140. VI.
(9) 表目錄 表 1 蛋白質藥物 Bevacizumab 胺基酸序列 ............................................................141 表 2 蛋白質藥物 Trastuzumab 胺基酸序列 .............................................................142 表 3 本實驗所使用之蛋白水解酵素適用 pH 值範圍及切點整理表 ...........................143 表 4 Agilent 1100 series HPLC 層析梯度表 ............................................................144 表 5 Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC systems 層析梯度表 ..................145 表 6 Bevacizumab 各段 domain 的雙硫鍵鍵結 ........................................................146 表 7 Trastuzumab 各段 domain 的雙硫鍵鍵結 ........................................................147 表 8 蛇毒蛋白數據庫資訊 .......................................................................................148 表 9 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白之蛋白質列表 ..................................................................150 表 10 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白之蛋白質列表 ................................................................154 表 11 台南眼鏡蛇蛇毒蛋白各段雙硫鍵鍵結之胜肽 ..................................................158 表 12 新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白各段雙硫鍵鍵結之胜肽 .................................................164. VII.
(10) 中文摘要 驗證生物藥物的正確摺疊結構，以及正確雙硫鍵鍵結，越來越受到重 視。正確蛋白質構型可維持蛋白質活性，而蛋白質後轉譯修飾所產生的雙 硫鍵鍵結，主要扮演著維持蛋白質構型的角色。本研究中，利用雙甲基化 標記以及質譜鑑定方法，搭配自製軟體 RADAR 自動化計算篩選 a1 離子的 策 略 ， 將 RADAR 軟 體 應 用 於 鑑 定 蛋 白 質 藥 物 Bevacizumab 與 Trastuzumab 的雙硫鍵鍵結，以及台南與新竹兩地區的複雜眼鏡蛇蛇毒蛋 白的雙硫鍵鍵結。由於經雙甲基化標記胜肽後於 MSMS 質譜分析圖譜中， 將產生 a1 離子訊號增強現象，藉此現象可鑑定其雙硫鍵鍵結胜肽的 N 端 胺基酸殘基。RADAR 軟體可自動化與數據庫中含半胱胺酸之胜肽進行比 對，首先比對其 a1 離子，若符合 N 端胺基酸再比對其分子量，接著進一 步比對其離子碎片，藉此策略快速鑑定雙硫鍵鍵結。應用 RADAR 軟體自 動 比 對 其 a1 離 子 策 略 ， 已 成 功 鑑 定 出 蛋 白 質 藥 物 Bevacizumab 與 Trastuzumab 所有的雙硫鍵鍵結。另外，於台南眼鏡蛇蛇毒蛋白上鑑定得 到 18 個蛋白質的雙硫鍵鍵結；新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白上鑑定得到 17 個蛋白 質的雙硫鍵鍵結。針對雙甲基化反應使用之還原劑氰基硼氫化鈉，探討還 原劑濃度及反應時間是否會造成非預期雙硫鍵鍵結產生實驗中，證明還原 劑氰基硼氫化鈉不影響非預期雙硫鍵鍵結產生。本研究主要提供一個簡單 以及快速鑑定雙硫鍵鍵結的方法，不但可作為檢查蛋白質藥物結構品管工 具，同時也適用於鑑定複雜蛋白質混合物的雙硫鍵鍵結。. 關鍵字：質譜、雙甲基化標記、單株抗體、a1 離子、雙硫鍵、眼鏡蛇蛇毒、 蛋白質藥物. VIII.
(11) Abstract Increasing. interest. in. production. of. bio-pharmaceuticals. is. accompanied by an increasing need for verification of protein folding and correct disulfide bonding. Correct protein conformation is often essential to the protein’s activity, and post-translational modifications such as disulfide bonds have substantial roles in maintaining the native fold. In this study, we demonstrate a method that using dimethyl labeling, mass spectrometry and computational screening of a1 ions with customized software, RADAR, which was applied for assigning the disulfide-bonding network of protein pharmaceuticals Bevacizumab, Trastuzumab and complex protein mixture of Tainan and Hsinchu cobra snake venoms. Labeled peptides which exhibit enhanced a1 ion signals during MS/MS fragmentation, the N-terminal amino acids from disulfide-linked peptides can be determined. Customized software, RADAR, can perform the automatic a1 ion screening followed by searching for molecular weight match. further. comparing. the. fragment. ions. against. the. cysteine-containing peptides. All disulfide peptides in Bevacizumab and Trastuzumab were completely assigned, by the automatic a1 ion screening and RADAR. Additionally, eighteen unique protein disulfide bonds of Tainan cobra snake venom and seventeen unique protein disulfide bonds of Hsinchu cobra snake venom were successfully identified. To evaluate whether the disulfide bond scrambling caused by sodium cyanoborohydride, we compared different concentrations and reaction time for sodium cyanoborohydride used in dimethyl labeling IX.
(12) reaction. The result demonstrated that it would not affect the disulfide scrambling. This presented approach is simple and rapid, offering a quality examination tool for protein pharmaceuticals. It can be also a powerful tool to determine disulfide linkage of complex protein mixture.. Keywords: Mass Spectrometry, Dimethyl labeling, Monoclonal antibody, a1 ion, Disulfide bond, Cobra snake venom, Protein pharmaceutical. X.
(13) 縮寫 ACN. acetonitrile. CTX. cardiotoxin. CID. collision induced dissociation. DP. declustering potential. DP2. declustering potential 2. DTT. dithiothreitol. ECD. electron capture dissociation. ETD. electron transfer dissociation. ESI. electrospray ionization. FA. formic acid. FP. focusing potential. XI.
(14) HCD. high energy collisional dissociation. HPLC. high performance liquid chromatography. Ig. immunoglobulin. IAM. iodoacetamide. IAA. iodoacetic acid. IDA. information dependent acquisition. MALDI. matrix-assisted laser desorption ionization. MS. mass spectrometry. NEM. N-ethylmaleimide. NGF. nerve growth factor. NTX. neurotoxin. NMR. nuclear magnetic resonance spectroscopy. NOE. nuclear overhauser effect XII.
(15) PFF. peptide fragment fingerprinting. PMF. peptide mass fingerprinting. PTH. phenyl thiohydantoin. PITC. phenylisothiocyanate. PLA2. phospholipase A2. PEG. poly (ethylene glycol). Q-TOF. quadrupole time-of-flight mass spectrometer. RADAR. rapid assignment of disulfide linkage via a1 ion recognition. TFA. trifluoroacetic acid. TEAB. triethylammonium bicarbonate. TCEP. tris(2-carboxyethyl)phosphine. XIC. extracted ion chromatogram. XIII.
(16) 第一章 序論 第一節、前言 蛋白質在生物體內扮演許多功能，為生物體生命活動的基礎。當體內 擔任特定功能的蛋白質發生突變或異常時，抑或是某種蛋白質濃度過高或 過低時，都會導致疾病發生。而這也代表使用蛋白質作為治療藥物具有巨 大潛力。目前已核准上市的蛋白質藥物，分為抗體類藥物、生長因子、凝 血因子、介白素、干擾素與各種酵素，其中以抗體類藥物為最大宗。目前 已有 Enbrel、Remicade、Rituxan、Humira、Avastin、Herceptin、Lucentis、 Synagis 等 9 種抗體類藥物，其年銷售額超過 10 億美元，而全球抗體類 藥物銷售額佔所有生物藥物銷售額的 40％，抗體類藥物已成為市場成長率 最快的生物藥物產品。 由於蛋白質藥物專利逐步到期，給予在市場上具有極大需求的低價生 物仿製藥物上市的機會。但蛋白質藥物製造過程不穩定，生產不易。蛋白 質本身的三度空間結構，無法與原廠藥物百分之百相同，只能做到相似程 度，但這些極小的差異會影響藥物在人體裡的活性，進而影響藥效，故確 認蛋白質藥物結構是相當重要的課題。目前確認蛋白質藥物結構方法可經 由分子量精確分析、全序列鑑定分析、蛋白質轉譯後修飾 (例如磷酸化、 雙硫鍵、醣基化等) 、蛋白質身分鑑定等方式確認。但隨著生物仿製藥物 將逐步上市，市場需求量大增，快速確認每批次的藥物結構，藉此確認藥 物活性及效力的方法顯得相當重要，使得近年來開發各種熱門的蛋白質藥 物的品保及品管研究方法越來越受到矚目。本篇研究主要聚焦於雙硫鍵鍵 結分析，正確雙硫鍵鍵結可幫助蛋白質結構穩定摺疊扭轉形成緊密立體結 構，發揮蛋白質功能。而現今許多鑑定雙硫鍵鍵結方法須利用質譜透過酵 素水解蛋白質後，比對其還原前以及還原後之差異， 或經由 Edman 1.
(17) sequencing 方法鑑定，這類方式過程繁瑣耗時，分析不易. 1,2. ，為了達到. 快速分析之需求，本研究於此提出簡單且快速分析雙硫鍵鍵結之方法。. 第二節、蛋白質結構 一、蛋白質功能 蛋白質是細胞的主要成份，在生物體內扮演許多功能。像是運輸代謝 物質功能，如血紅蛋白；催化作用的酶；參與生物體內的新陳代謝調劑作 用，如胰島素；還有許多結構蛋白被用於細胞骨架等的形成，如肌球蛋白； 另外免疫、細胞分化、細胞凋亡等過程中都有大量蛋白質參與。蛋白質能 否發揮其功能則取決於其空間結構是否摺疊正確，蛋白質結構若正確摺疊 即可特異性地與其它各類分子進行結合。蛋白質結合其他分子之區域稱為 結合位點，由於結構決定結合位點的形狀及化學性質，故結合能力與蛋白 質的三級結構密切相關，故研究蛋白質構型是否正確摺疊為非常重要的課 題。. 二、蛋白質結構 1.. 蛋白質一級結構 (primary structure) 蛋白質一級結構胺基酸經由胜肽鍵組成線性序列，其中包含後轉譯修. 飾 (post-translational modification)。胺基酸序列，則由 DNA 序列經轉錄 作用 (transcription) 形成 mRNA，mRNA 經由核醣體 (ribosome) 進行轉 譯作用 (translation) 決定胺基酸序列。 Anfinsen et al.利用核醣核酸酶 (ribonuclease) 研究變性及復性對其 活性影響。利用 8 M 尿素 (urea) 使核醣核酸酶分子摺疊結構展開，接著 使用乙基硫醇 (mercaptoethanol) 將四條雙硫鍵還原形成八個硫氫 基 (sulfhydryl group)。經還原後核醣核酸酶即失去活性。若移除尿素 (urea) 2.
(18) 及乙基硫醇 (mercaptoethanol) 後，置於適當緩衝液中，將八個硫氫基 (sulfhydryl group) 氧化形成四條雙硫鍵，復性後核醣核酸酶立即恢復自然 結構，恢復活性，且活性分子含量很高，表示平衡有利於折疊狀態。因此 Anfinsen 認為蛋白質一級結構決定其二級、三級結構，由一級結構經多次 型態轉換後，胜肽鏈朝向最低自由能 (free energy) 結構，自動摺疊成三 級結構 3。. 2.. 蛋白質二級結構 (secondary structure) 蛋白質胺基酸序列中，胜肽鏈鄰近胺基酸的羰基與另一胜肽鍵中醯胺. 基經由氫鍵產生交互作用，局部形成特定立體結構。例如因氫鍵作用力形 成-螺旋結構 (-helix) 4 以及 β-平板結構 (β-sheet)，另一種則為折曲結 構 (turn)，而兩二級結構之間連結則透過環形結構 (loop) 連接。 -螺旋結構 (-helix) 是由第 n 個胺基酸的羰基與 n+4 個胺基酸的醯 胺基形成氫鍵，幫助結構穩定性，螺旋結構繞一圈為 3.6 個胺基酸，其軸 長為 0.54 nm，每個胺基酸距離為 0.15 nm，此種螺旋結構為圓筒狀，排 列嚴密，使得螺旋結構中的氫鍵位能可達到最大。多數胺基酸，都可作螺 旋 結 構 單 位 ， 除 了 環 狀 結 構 的 proline 與 具 有 巨 大 支 鏈 valine 及 isoleucine。 β-平板結構 (β-sheet) 是經並肩方式排列形成平板結構，藉由分子 間氫鍵力量穩定平板結構，排列方向又分平行與反平行兩種，平行結構中， 肽鏈間彼此由胺基一端排列到羧基一端的相同方向，兩胺基酸間距為 0.65 nm，反平行結構中，相鄰各鏈彼此方向均不相同，兩胺基酸間距為 0.65 nm。 折曲結構 (turn) 主要用於改變蛋白質胺基酸序列於空間中方向，可連 結-螺旋結構 (-helix) 或β-平板結構 (β-sheet)，由第 n 個胺基酸的羰 3.
(19) 基與 n+3 個胺基酸的醯胺基形成氫鍵穩定結構。proline 為環狀結構，可 使蛋白質骨架形成轉彎構成折曲結構 (turn)。. 3.. 蛋白質三級結構 (tertiary structure) 單條多胜肽鏈形成的立體結構，由於多胜肽鏈間彼此緊密排列，胺基. 酸官能基間距離接近可相互作用，例如成對半胱胺酸間可形成雙硫鍵，雙 硫鍵為共價鍵，可幫助蛋白質結構穩定摺疊扭轉形成緊密立體結構，發揮 蛋白質功能。. 4.. 蛋白質四級結構 (quaternary structure) 多條多胜肽鏈形成的複合體結構，通常為一般蛋白質於生物體中的自. 然結構。一般蛋白質三級結構已具有生理功能，但一些複雜的生理反應則 需要蛋白質四級結構來完成。. 第三節、生物藥物 一、生物藥品介紹 生物藥物有別於傳統小分子藥物，性質複雜，一般分子量都相當大， 例如胰島素分子量超過 5 kDa、單株抗體分子量超過 100 kDa5。主成分包 括簡單胜肽 (20~30 個胺基酸)、蛋白質、抗體、疫苗、基因、血漿、細胞 甚至是動物組織，其結構、組成、生物活性都趨於複雜。 製造過程由生物細胞製造，例如 cell、E.coli、yeast 等 6，非化學合成。 早期生物藥品多由生物樣品萃取製造，像是從人 （血液或尿液） 或動物 器官 （如胰臟） 中萃取。但這種方法產率、產量都很低，來源不易取得， 成本非常高，而且各種傳染病盛行，很難保證藥物不被病原體污染。而現 今由於基因工程以及重組蛋白技術發展，以基因工程生產的藥物，利用生 4.
(20) 物細胞製造，可在實驗室中即作篩檢確保不受病原體污染。 生物藥物主要產品類別包含紅血球生成素 (erythropoietins, EPO)、干 擾 素 (interferons, IFN) 、 胰 島 素 (insulins) 、 單 株 抗 體 (monoclonal antibodies)、血液因子 (blood factors)、生長賀爾蒙 (growth hormones, GH) 、 介 白 素 (interleukins) 、 成 長 因 子 (growth factors) 、 治 療 疫 苗 (therapeutic vaccines)、細胞集落刺激因子 (colony stimulating factor, CSF)、其他蛋白質藥物 (other therapeutic proteins) 等。. 二、小分子藥物與生物藥物比較 1.. 小分子藥物 一般由化學合成製造，分子量為數百 Dalton，物理化學性質較單純，. 純度分析易檢測，大多於常溫下保存，存有生物性雜質可能性低，一般投 藥方式較多樣性例如透過口服、注射等。. 2.. 生物藥物 一般由生物細胞製造，分子量為數千至數十萬 Dalton，物理化學性質. 複雜，純度難以檢測，大多於低溫下保存，存有生物性雜質可能性高，一 般投藥方式大多為注射，與小分子藥物相比其特性在於生物藥物選擇性好、 具高特異性、產生副作用少，可應用於標靶治療。. 三、單株抗體 (monoclonal antibody) 免疫系統的 B 細胞受抗原活化後形成漿細胞，分泌出的蛋白質即為抗 體，又稱免疫球蛋白 (immunoglobulin, Ig)。 Immunoglobulin G 1 結構上，由四條多肽鏈組成，如圖一所示，兩條 重鏈 (heavy chain) 與兩條輕鏈 (light chain)，之間利用雙硫鍵 (disulfide 5.
(21) bond) 所組成的 Y 型分子，共有 16 條雙硫鍵，4 條鏈間雙硫鍵、12 條鏈 內雙硫鍵，每個分子含有兩個與抗原結合的位點 Fab 區. 7,8. 。上下兩功能區分成. (antigen-binding fragment)、Fc 區 (crystalline fragment)。Fab. 區，較具有彈性，可以結合抗原的點位，是識別外來物的關鍵所在。Fc 區，較為剛硬，易於結晶，負責抗體之生物活性作用，可與補體結合，不 具抗體作用。當上述雙硫鍵鍵結產生異質性連結時，將導致抗原與抗體無 法專一性結合，使其失去活性或是效力降低 9,10。 哺乳動物的免疫球蛋白重鏈依據類型不同分、δ、ε、γ、μ 五種。依 據不同重鏈類型，抗體分為不同亞型依序分別為 IgA、IgD、IgE、IgG、IgM 11. 。人體免疫球蛋白中含量最高的抗體為 IgG，佔血液中抗體量的 70~75. ﹪作為抗菌、抗病毒，能有效地預防相應的感染性疾病。. 四、蛋白質藥物（protein pharmaceuticals） Bevacizumab 與 Trastuzumab 都為 IgG-like 的蛋白質藥物結構。如圖 二所示，具有兩條重鏈以及輕鏈，含有 16 條雙硫鍵鍵結，經由蛋白水解 酶水解後分別產生 CH1、CH2、CH3、VH、VL、CL、hinge region、H-L 等 domain。C 表示為 constant region，結構剛硬易於結晶區；V 表示為 variable region，結構具彈性的可變區。. 1.. AvastinTM 學術名稱為 bevacizumab，是 Genetech 利用基因重組技 術製成的單株抗體。癌細胞的血管新生牽涉到多種細胞激素的分泌， 其中血管 內皮 細胞 生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 為最主要的調控因子。研究發現 VEGF 在多種腫瘤，如腦瘤、 肺癌、乳癌、消化道腫瘤及泌尿道腫瘤等均有過度表現的現象，這種 情形也見於血液惡性疾病，如淋巴瘤、多發性骨髓瘤及白血病。而 6.
(22) bevacizumab 可選擇性地結合至人類血管內 VEGF，抑制 VEGF 與位 於內皮細胞表面上的受體結合，中和 VEGF 的生物活性降低腫瘤的血 管形成，使癌細胞在得不到養分的情況下逐漸死亡，抑制腫瘤的生長。 表 1 為 bevacizumab 序列，其蛋白質藥物序列參考自 drug bank (http://www.drugbank.ca/)。. 2.. HerceptinTM 學術名稱為 trastuzumab，是 Genetech 利用基因重組技 術製成的單株抗體，在 1998 年時通過 FDA 審查上市。由於乳癌患者 中，有 20~30%其癌細胞具有第二型人類表皮生長因子受體 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 的過度表現，此蛋白過度 表現將使得細胞分裂及增殖加快，造成腫瘤。Trastuzumab 可選擇性 地作用在腫瘤細胞 HER2 上，降低 HER2 蛋白的過度表現，進而減少 腫瘤細胞增生。表 2 為 trastuzumab 序列，其蛋白質藥物序列參考自 drug bank (http://www.drugbank.ca/)。. 第四節、眼鏡蛇毒液介紹 眼鏡蛇，又稱飯匙倩，為神經性毒蛇，分類上屬有鱗目 (Squamate) 蛇亞目 (Serpentes) 之蝙蝠蛇科 (Elapidae) 中的眼鏡蛇屬 (Naja)。台灣 眼鏡蛇 (taiwan cobra) 屬於中華眼鏡蛇的一支系，在中國東南部、越南北 部、台灣與海南島的眼鏡蛇都屬同一種，稱為中華眼鏡蛇 (chinese cobra)， 學名為 Naja atra。眼鏡蛇毒液組成可分為非蛋白類及蛋白類，排毒量 (envenomation) 每次約 20~570 毫克，毒液中含水量約 60~70%，毒液中 水份隨著飢餓程度而變化，排毒量與蛇毒成份也可能隨年齡 12、個體差異、 性別、咬物次數 13、地域 14 等因素而有所變化。. 7.
(23) 一、非蛋白質類組成 蛇毒毒液中主要包含黃素腺二核甘酸為 L-胺基酸氧化酵素 (L-amino oxidase) 所需輔酶，使蛇毒毒液呈泛黃。還有一些金屬離子如納、鉀、鈣、 銅、鎂、鋅等離子，這些離子主要為毒液中許多水解酵素所需要的，另外 還有一些少量游離胺基酸、脂類及醣類。. 二、蛋白質類組成 蛇毒毒液中主要蛋白成份包含心臟毒素 (cardiotoxin, CTX)、神經毒素 (neurotoxin,NTX)、磷脂水解酵素 A2 (phospholipase A2, PLA2)、神經生 長因子 (nerve growth factor, NGF) 及各類酵素。. 1.. 心臟毒素 (cardiotoxin, CTX) 主要為眼鏡蛇毒中含量最多的成份，主要由 60~63 個胺基酸組成，具. 有四條雙硫鍵。心臟毒素蛋白結構是由一個核心 (core) 結構和三個指環 狀 (three-finger) 結構組成. 15. 。台灣眼鏡蛇毒液中已知有許多心臟毒素同. 源蛋白，約佔蛇毒蛋白總量 40~50%，分子量介於 6500~7000 Da。目前 對於心臟毒素致死機制所知有限，有報導指出心臟毒素可能與磷脂水解酵 素 A2 共同作用加強毒性 16。. 2.. 神經毒素 (neurotoxin,NTX) 神經毒素為蛇毒毒液最毒成份，眼鏡蛇神經毒素屬於突觸後神經毒素. (postsynaptic. neurotoxin) ， 可 與 尼 古 丁 乙 醯 膽 鹼 受 體. (nicotinicacetylchol-ine receptor) 產生專一性結合，進而阻斷神經衝動傳 導，使動物麻痺及呼吸衰竭，是導致動物死亡最主要原因。神經毒素又可 分為長鏈狀神經毒素 (long chain neurotoxin) 及短鏈狀神經毒素 8. (short.
(24) chain neurotoxin) 兩種。長鏈狀神經毒素主要由 65~75 個胺基酸組成， 具有五條雙硫鍵；短鏈狀神經毒素主要由 60~62 個胺基酸組成，具有四條 雙硫鍵 17，兩序列極為相似，分子量約為 6700~7600 Da。. 3.. 磷脂水解酵素 A2 (phospholipase A2, PLA2) 此酵素廣泛存在於蛇毒、蜂毒、蠍毒和動物組織中，酵素本身可直接. 與紅血球細胞膜作用，產生溶血現象，所以也稱為溶血素。台灣眼鏡蛇的 磷脂水解酵素 A2 主要由 119 個胺基酸組成，毒液中存在大量的磷脂水解 酵素 A2，其功能具有多樣性，可幫助消化獵物，也會造成局部性肌肉壞死、 溶血、內出血等。. 4.. 神經生長因子 (nerve growth factor, NGF) 神經生長因子為交感神經及感覺神經神經元維持存活及進行分化所需. 重要蛋白。台灣眼鏡蛇中神經生長因子含量明顯高於一般神經生理所需劑 量 (約 5~10 ng/mL)，但目前對於毒液中為何存在大量神經生長因子原因 依然不清楚，目前已知神經生長因子於神經系統外亦有其他功能，例如可 促進組織胺分泌，增加血管通透性等。. 第五節、蛋白質結構鑑定 一、X-ray 繞射 (X-ray diffraction) 1914 年布拉格父子 (W. H. Bragg 及 L. W. Bragg) 提出利用 X-ray 繞 射確定晶體結構 18。 目前已有報導利用 X-ray 繞射確定蛋白質晶體結構 19，X-ray 原理是利 用帶電粒子減速過程中，釋放出的電磁波具高能量，其波長在 10-12~10-8 m 稱為 X-ray。利用 X-ray 確定晶體結構分析，主要利用光遇到阻礙物會產 9.
(25) 生繞射 (diffraction) 現象，當阻礙物上有一狹縫時，若波長 (λ) 大於狹縫 寬度 (D) 時，波將反彈回來，若波長短於狹縫寬度時則直接穿透，若波長 與狹縫寬度相當時，則產生繞射，此為產生繞射的基本原理。蛋白質晶體 中，每個分子就如同一個柵欄，當 X-ray 通過整齊重複排列的分子，產生 繞射現象。繞射光源彼此間又會形成干涉，產生干涉的原因是 X-ray 進入 晶體後，各層原子反射出來的路徑不同，造成不同光程。利用干涉產生的 干涉點可分析分子排列方式。剛好固體內原子與原子間的距離近似於 1 Å 接近 X-ray 的波長，故 X-ray 非常適合作為繞射光源。此方法應用於蛋白 質大分子結構鑑定上，由於其蛋白質結構遠比化學分子複雜，組成原子很 多，排列較不具對稱性，使得推測其排列位置更加困難。另一方面蛋白質 大分子結晶不易，且樣品需高純度，這都使 X-ray 在蛋白質結構鑑定上增 加許多困難度。. 二、核磁共振光譜 (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) 核磁共振光譜可於溶液環境下測得分子結構。因蛋白質主要都於溶液 環境下發揮功能，且結構通常具有彈性。若使用 X-ray 繞射必須先使蛋白 質形成晶體才能測得結構，但形成結晶可能與活化狀態的型態不同，故 X-ray 繞射得到的結構，並非完全正確的表現蛋白質於活性狀態下的構形， 因此利用核磁共振光譜測量蛋白質結構是非常有幫助的。 核磁共振光譜基本原理是將分子置入強大外磁場中，核磁距與外加磁 場相互作用，會吸收無線電波，這種電磁波被吸收的現象主要來自原子核 能階的躍升，從低能階自旋翻轉至較高能態，但處於高能階時不穩定，接 著會以光或能量的釋放回復至原來的狀態。由於核磁共振的性質隨核子種 類、外加磁場大小，或外圍電子雲及磁力線的總和而變化，針對同一種原 子，吸收的無線電波頻率，會隨原子本身在分子中環境的不同而變化，測 10.
(26) 量此變化可加以推斷該原子於分子中所處的位置，及相鄰同種類原子間的 距離，藉此了解整個分子的結構，根據 NOE (nuclear overhauser effect) 及其他數學分析方式來推算原子間距離及鍵結角度，配合電腦模擬即可測 得蛋白質分子結構。而利用核磁共振光譜法鑑定蛋白質結構，也有其缺點， 儀器設備昂貴且維護不易成本高，圖譜分析工作非常複雜且費時，往往需 耗費大量人力及時間，無法符合快速分析之需求。. 三、序列回溯結構法 利用串聯式質譜儀分析蛋白質結構，可透過各種方法使得離子碎裂， 得到離子碎片訊息。例如碰撞誘導裂解 (collision-induced dissociation)、 電子捕獲裂解. (electron-capture dissociation) 、 電 子 轉 移 裂 解. (electron-transfer dissociation) 等方法；以碰撞誘導裂解為例，其基本原 理是由惰性氣體與離子於碰撞室中進行碰撞，碎裂得到離子碎片圖譜，透 過拼湊蛋白質胺基酸序列，而得蛋白質結構 20,21。定序方法於第七節詳述。. 第六節、質譜儀介紹 質譜儀結構，基本元件分為離子源 (ion source)、質量分析器 (mass analyzer)、以及偵測器 (detector) 三部分，基本原理為利用分析物於離子 源中產生電離，形成不同質荷比的帶電離子，透過電位差，將離子引入質 量分析器中，接著質量分析器利用電場或磁場不同，使不同質荷比離子於 空間或時間上分離，再經聚焦後進入偵測器得到質譜圖。. 一、離子源 (ion source) 針對生化大分子質譜儀常用的軟性游離方法為電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI) 及 基 質 輔 助 雷 射 脫 附 游 離 法 11.
(27) (matrix-assisted laser desorptionIonization, MALDI)，由於此類游離技術 突破發展，使得液相層析串聯式質譜儀在蛋白質體學研究上扮演重要角 色。. 1.. 電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI) 1984 年 Fenn et al.22,23 首先將電噴灑游離法連結質譜，利用 poly. (ethylene glycol) (PEG) 所產生的多價電荷質譜訊號，證明分析物經電噴 灑後，會產生多價電荷形式。基本原理是利用施加電場的毛細管，當分析 物溶液通過施加高電壓毛細管流出時，高電壓使溶液中正負離子分離，施 加正電場時，溶液中負電荷離子往正極方向移動，正電荷離子受排斥力聚 集於毛細管口，最後累積於毛細管尖端形成帶電液滴，稱之泰勒錐 (Taylor cone)；若施加負電場，正負離子分離情況則相反。圖三，當施加於毛細 管的電壓夠大，流出液滴尖端產生的靜電斥力大於表面張力時，將從泰勒 錐尖端噴灑形成微小帶電液滴，產生電噴灑現象。接著帶電液滴透過電位 差引入質譜，然而帶電液滴飛行進入質譜時，因溶劑與空氣接觸導致體積 揮發變小，但液滴所帶電荷不變，使得液滴表面電荷密度升高，產生庫倫 斥力，當斥力大於表面張力時，帶電液滴則分裂成更小液滴，形成帶多價 電荷離子進入質譜儀分析 24。. 2.. 基 質 輔 助 雷 射 脫 附 游 離 法 (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 1988 年德國 Hillenkamp25 及日本 Tanaka26 分別提出基質輔助雷射脫. 附游離法，此游離法可使高分子量大分子游離化。基本原理利用分析物與 有機小分子基質 (matrix) 加以混合，將樣品與基質混合液點於金屬盤上， 靜置金屬盤待溶劑揮發，形成分析物樣品與基質共結晶，經過進樣系統送 12.
(28) 入質譜儀，以雷射光束照射共結晶點，結晶中的基質會吸收雷射光能量轉 移給分析物樣品，並透過高電壓作用使之游離為氣相離子，進入質譜儀分 析。由於基質輔助，可降低離子化分析物的雷射能量，避免因雷射強度太 強使分析物樣品斷為多個片段，藉此保留完整分析物片段。. 二、毛細管進樣系統 在蛋白質體學研究上，一般都是利用逆相層析搭配電噴灑游離法，逆 相層析溶劑不含鹽類，相容於電噴灑游離法，可直接連接質譜，而電噴 灑游離法又因具有 concentration-dependent 特性，故使用微量進樣系統， 不僅可分析微量樣品，也可增加質譜偵測的靈敏度。本研究中，我們改 良應用 Goodlet et al 提出 27 的 nanoLC 分流進樣系統，其系統如下所述。. 1.. 系統原理 系統組成利用 lab-made 的兩管柱組成。RP-LC column (100 mm, 75. m I.D., 3 m, 100 Å ) 本身即為噴灑進樣器，可縮短傳統上由層析管柱到 達噴灑進樣器時間，減少樣品產生擴散現象。Pre-column (20 mm, 100 m I.D., 5 m, 200 Å )，兩管柱利用 microtee 連接。於 microtee 下方利用一 段毛細管 (30 mm, 100 m I.D.) 連接提供高電壓的 metal union，藉由 liquid junction 作用使得 RP-LC column 帶電進行電噴灑游離。搭配毛細 管分流系統，使 binary pump 提供約 200 nL/min 流速，可達到微量進樣 提高靈敏度的效果 28,29。. 2.. 系統架設 實驗架設的毛細管分流進樣系統如圖四所示，其中包括 Agilent 1100. series HPLC、AB Sciex QSTAR XL mass spectrometer 上的六向閥、兩 13.
(29) 個 peek microtee (IDEX Health & Science, US)、連接高電壓的 metal union、pre-column (20 mm, 100 m I.D., 5 m, 200 Å )、RP-LC column (100 mm, 75 m I.D., 3 m, 100 Å )、提供背壓 (backpressure) 毛細管 (50 m I.D.) (IDEX Health & Science, US)。 系統於 load mode 時，如圖五所示，連接於質譜上六向閥是在打開的 位置，由於 RP-LC column 提供高背壓，所以分析樣品以及溶劑均通過 pre-column 直接進入廢液桶，分析樣品會先被 pre-column 抓住，並經過 溶劑沖洗一段時間，達到 on-line 去鹽效果。系統於 inject mode 時，如圖 六所示，此時連接質譜六向閥是在關閉的位置，分流通往廢液桶的管路打 開，溶劑將通過 RP-LC column，由於在 metal union 上提供高電壓，經 由 liquid junction，使通過 RP-LC column 的樣品及溶劑進行電噴灑游離。 此系統是利用 50 m I.D.毛細管進行分流，分流管路長度決定提供背壓以 及進樣流速。. 三、四極桿-飛行時間串聯式質譜儀 (quadrupole time-of-flight mass spectrometer, Q-TOF) 四極桿-飛行時間串聯式質譜儀廣泛應用於蛋白質體學研究中，現今主 要連結電噴灑游離源和基質輔助雷射脫附游離源兩種，電噴灑游離源一般 用於分析液態樣品，基質輔助雷射脫附游離源一般用於分析固態樣品。此 質譜儀結構包括兩段四極桿以及飛行時間質量分析器，可進行高質荷比串 聯質譜分析，如圖七所示。 四極桿質量分析器為四支平行排列電極棒構成；藉由改變電壓決定電 場大小，使離子通過四極桿。施加固定電位下，能使特定質荷比範圍離子 呈現穩定震動，通過四極桿；其他質荷比範圍離子因震幅軌道不穩定而撞 擊四極桿，使得無法通過四極桿。 14.
(30) Q-TOF 最前端構造為三段四極桿 Q0 連結 Q1、Q2，之後進入飛行時間 質量分析器。Q0 四極桿主要具有 ion guide 功能，為一段維持 RF-only mode 的四極桿。Q1 四極桿，運行時可選擇 RF-only mode 或 DC mode，於 RF-only mode，主要功能是使離子通過；於 DC mode，可篩選特定質荷 比範圍的離子通過。Q2 四極桿主要作為碰撞室，維持 RF-only mode，腔 室內填充少量惰性氣體分子 (例如氮氣或是氬氣)，可增加四極桿傳送離子 效率，也可與待測離子互相碰撞後產生離子碎片。 離子通過 Q2 後，經加速電壓加速進入飛行時間質量分析器，飛行時間 質量分析器裡不施加任何場壓，待測離子於飛行管中將加速電壓的位能轉 變為動能飛行，根據離子質量大小不同，分別在不同時間抵達偵測器。藉 由已知分子質量以及飛行時間校正即可換算待測離子的質量。在 Q-TOF 中採用反射型飛行時間質量分析器，藉由一系列環電極形成的離子鏡 (ion mirror) 設計 30，彌補相同質量離子於起始動能差異或空間方向散亂分佈， 可校正相同質量離子在不同時間抵達偵測器的情況，增加訊號解析度。一 般三段式四極桿儀器只能到達 3000 解析度，但 Q-TOF 的解析度可達到 1000031。 Q-TOF 的離子偵測器採用一套微通道片 (MCP)，類似脈衝式離子源 儀器的偵測器，基本原理是利用離子進入通道撞擊管壁產生數個電子逸出， 逸出電子在通道內反覆撞擊，經第二片 MCP 通道產生更大量電子，再由 底部金屬片承接大量電子，產生脈衝電流，經電流轉換輸送至訊號收集器 (TDC) 上，產生質譜圖。 四、四極桿-靜電場軌道阱串聯式質譜儀 (high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer, Q-Exactive) 四極桿-靜電場軌道阱串聯式質譜儀其主要結構包括一段四極桿質量 15.
(31) 分析器、C 型離子阱 (C-trap)、高能量碰撞反應室 (high energy collisional dissociation cell, HCD cell) 以 及靜 電 場軌 道 阱質 量 分 析 器 (orbitrap mass spectrometer)，如圖八所示 32。 一般藉由四極桿改變電壓決定電場大小，使離子通過四極桿，接著經 過八極桿，其作用是使離子聚焦送入 C 型離子阱。C 型離子阱可將分散的 相同離子聚集，可提高離子進入軌道阱後分辨不同離子的能力。經由 C 型 離子阱可送入高能量碰撞反應室進行高能碰撞產生碎片離子，接著將離子 碎片送回 C 型離子阱，導入軌道阱中分析離子。軌道阱質量分析器基本原 理是藉由離子進入軌道阱中受到中心電極之高靜電場力影響，離子將產生 特定震盪頻率，頻率與質荷比相關，藉由傅立葉轉換方式將離子訊號轉換 成質譜圖，其解析度高達 140000，而傅立葉轉換的特點產生的背景訊號 低，使得儀器可提供高解析度質譜分析。. 第七節、蛋白質身份鑑定 一、Edman degradation 早期鑑定蛋白質身份序列仰賴 Edman degradation1,33,34 方法，此方法 利用 PITC (phenylisothiocyanate) 試劑與待測胜肽 N 端胺基酸基團，於 鹼性環境下反應，生成 PTC 衍生物，接著加入酸，進行合環反應，胜肽 N 端將選擇性切下一個胺基酸，其餘肽鏈於酸環境下不穩定將繼續反應，形 成穩定 PTH-胺基酸。使用高效能液相層析儀或電泳法分析生成之 PTH胺基酸，可鑑定出 N 端胺基酸。經每次反應，於 N 端切下一個胺基酸，可 鑑定出 N 端胺基酸序列。此方法雖然已有自動化儀器可自動分析，但經多 次循環反應後，反應效率降低，通常只能反應 30 個循環。若需可靠鑑定 出胜肽鏈胺基酸每次形成 PTH-胺基酸效率需大於 99%以上。由於此條件 限制，對於肽鏈較長的多肽，可利用酵素將肽鏈切成小片段胜肽再進行胺 16.
(32) 基酸結構鑑定，最後在拼湊出原始肽鏈胺基酸序列。. 二、應用質譜鑑定蛋白質序列方法探討 1.. 胜肽質量指紋 (peptide mass fingerprinting, PMF) 胜肽質量指紋法 (peptide mass fingerprinting, PMF)35，一般將蛋白質. 經純化或分離等前處理步驟後，利用蛋白水解酶 (例如 trypsin、Glu-C、 Lys-C) 進行水解反應 (digestion) 後，由於特定蛋白水解酶會辨認特定胺 基酸，例如 typsin 辨認 arginine 與 lysine 的羧基 (C-terminal) 產生切點， 可將蛋白質水解成胜肽，每段胜肽片段因胺基酸組合不同造成質量不同， 隨著蛋白質不同水解後的胜肽片段也不同，具有特異性。搭配搜尋引擎， 利用電腦資料庫中已知蛋白質序列所對應的胜肽質量作比對，以統計方法 可找出最可能產生此胜肽質量分佈蛋白質，藉此鑑定蛋白質身份。. 2.. 胜肽碎片指紋 (peptide fragment fingerprinting, PFF) 胜肽質量指紋法是利用蛋白水解酶水解蛋白質後，產生特異性胜肽質. 量作為資料庫，此方法遇到複雜混合物無法確認時，可利用胜肽碎片指紋 法 (peptide fragment fingerprinting, PFF)36,37，使用串聯式質譜儀進行分 析，以常見碰撞誘導解離 (collisional-induced dissociation, CID) 為例， 利用蛋白水解酶將蛋白質水解成胜肽片段，進入質譜分析。第一段質量分 析器先選取特定質荷比的胜肽 (m/z) 作為前驅離子，進入碰撞氣室後前驅 離子與惰性氣體產生碰撞，將動能轉變成內能，造成前驅離子碎裂，離子 碎片進入第二段質量分析器而得碎片質譜圖。胜肽在質譜氣相環境中容易 在胜肽鍵斷裂，碎片離子片段命名a、b、c 系列離子屬斷裂在不同位置胺 端 碎 片 (N-terminal fragment) ， x 、 y 、 z 則 為 羧 端 碎 片 (C-terminal fragment)，數字表示胺基酸的排列順序，如圖九所示。利用同系列的碎片 17.
(33) 間的質量差距 (例如y1、y2、y3．．．)，可計算出該胜肽前驅離子的部分 甚至全部序列，以此序列和資料庫中的理論蛋白質序列比對，除了得到胺 基酸排列組合後的胜肽質量，還多了胜肽碎片得到特定的一段或多段胜肽 序列，此方法的專一性及正確率遠高於胜肽質量指紋法，故常用於蛋白質 身份的確認或後轉譯修飾結構鑑定。 第八節、應用質譜鑑定蛋白質雙硫鍵方法探討 雙硫鍵鍵結正確與否與蛋白質結構息息相關，雙硫鍵鍵結異常，將導 致蛋白質功能喪失失去活性。目前已經有許多利用質譜分析雙硫鍵的方法 被報導過. 1,38-40. 。基本上可分為還原態鑑定法與非還原態鑑定法，還原態. 鑑定法 41,42 基本作法是將蛋白質還原，雙硫鍵斷裂後，使得兩個半胱胺酸 上接上氫，使胜肽鏈分子量多 2 Da，比較還原前與還原後圖譜間差異，即 可分析雙硫鍵鍵結，此方法不適用於具有多條雙硫鍵的複雜蛋白質。非還 原態鑑定法，則是不進行蛋白質還原步驟，在雙硫鍵無斷裂情況下分析， 例如已有報導利用化學標記法搭配質譜鑑定雙硫鍵鍵結或是使用電子轉 移裂解方法 (electronic transfer dissociation, ETD) 在非還原態下分析雙 硫鍵鍵結 43-45。. 下列將對過去使用還原態與非還原態鑑定雙硫鍵鍵結方法作簡單介紹 一、還原態鑑定法 Yen et al.提出部分還原差異烷基化法分析雙硫鍵鍵結 46，利用 TCEP 試劑部分還原雙硫鍵後接上烷基化試劑 NEM，接著使用 DTT 試劑完全還 原雙硫鍵後接上烷基化試劑 IAM。透過分析成對含有 NEM 與 IAM 的胜肽 鏈即可判斷雙硫鍵鍵結位置。Liu et al.提出利用部分還原差異烷基化法分 析雙硫鍵鍵結強度. 47. ，將雙硫鍵部分還原後接上烷基化試劑 18. 12. C-IAA，接.
(34) 著完全還原雙硫鍵後接上烷基化試劑. 13. C-IAA。比較胜肽上接上. 與 13C-IAA 比例可分析雙硫鍵鍵結強度，若接上. 12. C-IAA. 12. C-IAA 比例較高表示該. 雙硫鍵強度較弱，13C-IAA 比例較高表示該雙硫鍵強度較強。利用部分還 原差異烷基化法鑑定雙硫鍵鍵結，可應用於含許多鄰近半胱胺酸，且分子 量較大之蛋白質，能有效解決於非還原態下蛋白質無合適水解酵素切點， 使得水解後之胜肽分子量過大，造成質譜鑑定上困難。但部分還原差異烷 基化法，也有其缺點，實驗時需配合嚴謹實驗條件，於特定條件下還原特 定蛋白質一條或是少量雙硫鍵，此步驟極為關鍵，需透過許多測試得到最 佳化還原條件，將耗費大量時間及成本，若雙硫鍵鍵結具有相似的還原速 率時，將非常難以處理。實驗中使用不同烷基化試劑進行烷基化反應時， 必須在實驗步驟中進行去鹽或是置換溶劑步驟，以去除第一次使用之烷基 化試劑，此步驟將增加雙硫鍵鍵結胜肽損失可能性。. 二、非還原態鑑定法 Zhang et al.利用比較非還原與還原後雙硫鍵鍵結胜肽之 HPLC-UV 圖 譜，收集還原與非還原態下譜峰具差異之胜肽樣品溶液，接著利用 Edman sequencing 方法鑑定含有 di-PTH-cysteine 衍生物胜肽 1，成功鑑定出 IgG4 雙硫鍵鍵結位置。Coockrill et al.利用相同方法應用比較非還原與還原後雙 硫鍵鍵結胜肽之 HPLC-UV 圖譜以及質譜搭配 edman degradation 方法 2， 成功鑑定一級結構序列上相近與相鄰半胱胺酸，使得蛋白水解酵素無法有 效切割分離的胜肽並進一步應用於分析 IgG2 與 IgG4 雙硫鍵鍵結 48。利用 此方法鑑定雙硫鍵鍵結需大量樣品，若樣品含許多雙硫鍵鍵結時，特別是 胜肽產生 miss cleavage 情況時，將造成 LC-UV 圖譜或是質譜圖譜複雜難 以解釋。Edman degradation 方法是有其限制的，隨著反應循環次數增加 使得降解效率降低，而實驗過程中也易造成非預期雙硫鍵鍵結產生。 19.
(35) Wallis et al.提出利用 pepsin 蛋白水解酵素，於含有 50% H2O18 環境 下進行水解反應 49，對於水解產生的 C 端羧基進行穩定同位素標記。胜肽 中含有不同數目的雙硫鍵會產生不同的同位素質量分佈圖，藉由同位素質 量分佈圖可判斷胜肽含有幾條雙硫鍵鍵結，但同位素質量分佈圖會使圖譜 複雜化解釋不易，不利分析且 H2O18 試劑昂貴。 Xu et al.利用質譜搭配 MassMatrix 搜尋軟體分析雙硫鍵鍵結胜肽， MassMatrix 可自動比對雙硫鍵鍵結胜肽經 CID 碎裂後的碎片離子，確認 其雙硫鍵鍵結。但此方法最多只考慮兩條雙硫鍵鍵結胜肽，對於含複雜雙 硫鍵鍵結樣品不適用 50。 Desaire et al. 利 用 LC/ESI-FTICR 質 譜 儀 搭 配 碰 撞 誘 導 解 離 (collision-induced dissocation, CID) 分析 HIV-1 envelope protein 雙硫鍵 鍵結 51，成功鑑定所有雙硫鍵鍵結，包含異質性雙硫鍵連結，但此方法需 搭配高解析質譜儀，其儀器設備昂貴，且產生 MSMS 碎片圖譜非常複雜， 需耗費大量時間及人力解釋圖譜。 利用雷射游離方式可促使雙硫鍵鍵結斷裂 52，應用此特性鑑定雙硫鍵 鍵結方法也已經被報導。Schnaible et al.經由MALDI-in-source decay將雙 硫鍵鍵結胜肽R1-S-S-R2裂解為R1-SH與R2-SH，利用質譜譜圖所得之訊號 峰滿足m/z (peak A) + m/z (peak B) - m/z (H2 + H+) = m/z (peak C) 方程 式方法，即可確認利用雙硫鍵連結之胜肽 (peak A與peak C) 與其前驅離 子 (peak C) ，作一次篩選，接著再由個別胜肽碎片離子確認其雙硫鍵鍵 結53，使用MALDI鑑定雙硫鍵鍵結胜肽方法也有其缺點，由於使用MALDI 可快速分析特性，上機時樣品通常未作前處理，而樣品中鹽類容易降低樣 品與基質共結晶效率，進而影響分析結果，另外有時游離能力強物質可能 會抑制游離能力弱物質，導致分析物訊號變弱。 電子捕獲裂解 (electron capture dissociation, ECD) 與電子轉移裂解 20.
(36) (electron transfer dissociation, ETD) 技術已廣泛應用於分析蛋白質修飾 上 54-56。而近年來利用電子轉移裂解 (electron transfer dissociation, ETD) 57. 作為新興胜肽碎裂方式的報導越來越多。電子轉移裂解一般利用. fluoranthene 作為陰離子與前驅離子互相作用，經由電子轉移使胜肽碎裂， 與碰撞誘導解離 (collision-induced dissocation, CID) 形成 b、y 系列離子 碎裂模式不同，在電子轉移裂解中胜肽除了會碎裂成 c、z 系列離子以外， 還會造成雙硫鍵斷裂 58，由於斷裂方式不同，使得電子轉移裂解技術非常 適合應用於研究蛋白質體學後轉譯修飾。 Karger et al.提出利用電子轉移裂解技術分析雙硫鍵鍵結方法 43,44,59， 利用電子轉移反應使雙硫鍵硫原子帶電形成自由基，造成雙硫鍵斷裂，使 雙硫鍵連結胜肽分離。雙硫鍵斷裂後胜肽離子進一步經過 MS3、MS4．．． MSn 作 CID 得到胜肽碎片資訊。利用這些氣相碎裂反應可取代使用化學還 原方法，不須額外樣品處理，可縮短分析時間，此方法可應用於具有較大 片段雙硫鍵鍵結胜肽上。但目前此方法對於未知雙硫鍵鍵結位置的蛋白質 樣品作分析時，因無法由質譜所鑑定得到龐大圖譜數挑選出與雙硫鍵鍵結 胜肽相關之圖譜，鑑定困難，且其 MSMS 圖譜複雜，需耗費人力以及時 間解釋圖譜。 Desaire et al. 提 出 利 用 電 子 轉 移 裂 解 技 術 搭 配 萃 取 離 子 層 析 圖 (extracted ion chromatogram, XIC) 鑑定雙硫鍵鍵結方法 45，透過電子轉 移裂解反應使雙硫鍵連結胜肽分離，利用 XIC 圖譜比對含半胱胺酸胜肽經 液相層析時沖堤出時間，若時間相同則表示兩段胜肽是經由雙硫鍵鍵結的。 此方法對於簡單分析物雖然不需解釋圖譜碎片，可節省分析時間，但對於 複雜樣品分析時，需要耗費時間及人力推算可能的鍵結。 過去已有利用化學標記修飾胜肽，搭配質譜鑑定分析，使標記胜肽於 MSMS 圖譜中 a1 ion 訊號增強，藉此幫助比對圖譜時經常缺少 b1 ion 訊 21.
(37) 號而無法確認胜肽 N 端胺基酸的方法已被報導過。Fales et al.利用二乙烯 碸與胜肽反應增強圖譜中 a1 ion 訊號 60。Liu et al.利用碘乙醯胺與胜肽反 應，同樣也於圖譜中增強 a1 ion 訊號 61。 Huang et al.開發一套簡單、快速、自動化鑑定雙硫鍵鍵結方法 62。實 驗成功鑑定出含多條雙硫鍵 hPAP 蛋白的雙硫鍵鍵結位置，原理是利用雙 甲基化標記搭配質譜鑑定雙硫鍵鍵結胜肽時，雙硫鍵鍵結胜肽於 MSMS 圖 譜 中 出 現 a1 ion 訊 號 增 強 的 現 象 ， 經 由 自 動 化 比 對 雙 硫 鍵 鍵 結 custom-made 軟體 RADAR，將圖譜中 a1 ion 與數據庫中胜肽 N 端胺基酸 進行比對，若胜肽 N 端胺基酸符合，再比對胜肽的分子量及碎片離子，透 過 a1 ion 比對 N 端胺基酸作一次篩選，去除許多與雙硫鍵鍵結胜肽不相關 之圖譜達到快速分析雙硫鍵鍵結效果。利用此方法鑑定蛋白質雙硫鍵鍵結， 實驗操作過程簡單成本低廉，並可自動化快速分析圖譜，不需耗費大量時 間及人力解釋圖譜，非常適合分析雙硫鍵鍵結。. 第九節、實驗原理 一、雙甲基化反應 雙甲基化反應具有便宜、反應快速完全特性、曾經被用於蛋白質定量 分析 63。 雙甲基化反應標記於胜肽鏈的 N 端與 lysine 側鏈上的胺基基團上，若 胜肽鏈 N 端為 proline，由於胺基團為二級胺，故產生單甲基化反應。胜 肽與 formaldehyde-H2 反應，增加 28 Da 的質量差；與 formaldehyde-D2 反應，增加 32 Da 的質量差。若胜肽進行單甲基化則與 formaldehyde-H2 反應，增加 14 Da 的質量差；與 formaldehyde-D2 反應，增加 16 Da 的質 量差。 標記上雙甲基化的胜肽以質譜進行分析，於 MSMS 圖譜中其 a1 離子 22.
(38) 訊號強度將明顯提升 64，利用此現象可藉由 RADAR 軟體比對提升訊號強 度的 a1 離子以及對應的分子量，快速鑑定雙硫鍵鍵結 62。. 二、烷基化試劑與蛋白水解酶使用 過去有許多報導表示蛋白質若存在自由的硫醇基以及暴露於鹼性環境 pH > 7 易產生非預期雙硫鍵鍵結的現象 1,46,51，故實驗一開始即利用 TEAB (triethylammonium bicarbonate) buffer 於 pH 7 環境下進行反應，並使用 NEM (N-ethylmaleimide) 與自由的硫醇基反應，防止雙硫鍵鍵結錯接。且 TEAB buffer 不會與 formaldehyde 反應，故不須經由 speedVac dry，置 換溶劑可大幅縮短時間。 使用高效能液相層析搭配質譜儀分析胜肽有其分子量限制，一般最適 合偵測的範圍為 1000~5000 Da 間，分子量太小胜肽不易被層析分離管柱 抓住，而分子量超過此範圍的胜肽，則不易游離帶電。而選用蛋白水解酶 上需考量水解後的胜肽片段大小是否適合於質譜分析、是否具有高度專一 性、以及適合酵素反應的 pH 值範圍，若於鹼性範圍可能導致非預期雙硫 鍵鍵結產生。實驗中所使用的酵素包含 trypsin、Glu-C、Lys-C、thermolyisn， 其切點與適用 pH 值範圍如表 3。. 三 、 RADAR (rapid assignment of disulfide linkage via a1 ion recognition) 本研究所使用 RADAR (rapid assignment of disulfide linkage via a1 ion recognition) 軟體為黃聖聿博士等人所開發的自製軟體 62。主要工作原 理如圖十所示，藉由比對標記雙甲基化的胜肽 a1 離子訊號，進行一次篩選， a1 離子符合 N 端胜肽後，再進一步與理論胜肽分子量比對，進行二次篩選， 符合則為相關胜肽，透過兩道篩選過程，可過濾許多不相關的胜肽，接著 23.
(39) 再進一步比對碎片離子，此種比對方法可減少分析圖譜時間，達到快速且 自動化分析。 圖十一為 RADAR 軟體介面，A 區域可選取實驗所使用的蛋白水解酶 的切點位置，並選擇切於胜肽 N 端或 C 端位置；B 區域可鍵入樣品序列或 含樣品序列文字檔以及酵素切點是否遇到 proline 不切，missed cleavage 數目以及使用試劑為 formaldehyde-H2 或是 formaldehyde-D2；C 區將產 生理論胜肽序列；D 區為搜尋參數設定並可導入實驗數據檔案 (mgf 或 pkl 格式) 以及產生報告檔輸出路徑；按下 a1 Screening 時進行 a1 離子比對， 接著按下 Run 比對胜肽分子量及產生碎片離子；最後於 E 區產生分析結 果顯示比對目標胜肽的序列、分子量、離子碎片等資訊。 目前 RADAR 軟體持續更新版本，v3.0.0.1 版本介面為圖十二所示， 增加了一些新功能以及參數設定值，可加快分析速度，並可用於鑑定蛋白 質混合物樣品上，下列將挑選幾個較重要新增功能說明。. 功能說明 1.. User Defined amino acid. 可利用 Abbr 自行定義修飾基團，可將自行定義 Abbr 插入樣品序列中所修 飾位置。 2.. Exclude cross chain disulfide bond. 此功能用於混合物樣品，具多個蛋白。勾選後不考慮不同蛋白質間 (不同 鏈之間) 可能互相連結的雙硫鍵。 3.. Spectrum Grouping. 此功能將分子量相同的胜肽，同時含有數個 MSMS 圖譜時，只顯示 a1 離 子訊號最強的胜肽為代表，可減少搜尋時間。. 24.
(40) 參數功能說明 1.. Intensity ratio cutoff: 設定訊號低於最高 a1 離子的多少百分比 cutoff。. 2.. Maximum chain number: 選擇含雙硫鍵胜肽最多由幾個鏈組成。. 3.. Fragment tolerance: 設定碎片離子分子量的差值。. 4.. Peptide intensity couoff: 設定胜肽訊號強度低於多少百分比 cutoff。. 5.. a1 tolerance: 設定 a1 離子分子量差值。. 6.. Mass tolerance: 設定胜肽分子量差值 (可選擇單位為 Da、ppm)。. 7.. Fragment Intensity cutoff: 設定離子碎片訊號強度低於多少 cutoff。. 8.. RT seconds tolerance: 設定滯留時間差值，在此時間內相同分子量胜 肽視為相同胜肽，只出現一個鑑定結果。. 9.. Spectrum grouping peptide tolerance: 設定使用 spectrum grouping 功能的胜肽差值。. 第十節、研究動機 由於蛋白質藥物專利逐步到期，低價生物仿製藥物將陸續上市，蛋白 質藥物的品管與品保分析研究越來越受重視。而驗證蛋白質摺疊結構正確 舉否，將可透過蛋白質藥物的雙硫鍵鍵結確認，以確保藥物安全問題。近 來有許多分析方法已被報導。目前藥廠使用鑑定蛋白質藥物雙硫鍵方法， 過程繁瑣耗時。本研究利用黃聖聿博士於 2008 年分析化學期刊，發表的 策略分析雙硫鍵鍵結 62。原理是將蛋白質水解成胜肽後進行雙甲基化反應， 搭配 custom-made 軟體 RADAR 搜尋，藉由比對雙甲基化後胜肽於 MSMS 圖譜中訊號增強的 a1 ion 及胜肽分子量確認雙硫鍵鍵結。實驗過程簡單， 搭配 RADAR 軟體可自動化分析，符合藥廠所需鑑定策略。. 本研究分為三個部分 25.
(41) 1.. 分析蛋白質藥物雙硫鍵鍵結 使 用 蛋 白 質 藥 物 為樣 品 ， 利 用 雙 甲 基化 搭 配 custom-made 軟 體. RADAR 策略簡單快速分析雙硫鍵鍵結。由於先前實驗室謝育廷學長已利 用此方法鑑定蛋白質藥物 Trastuzumab 雙硫鍵鍵結，分析出七段雙硫鍵胜 肽。在此篇研究中除了分析蛋白質藥物 Bevacizumab 雙硫鍵鍵結以外並 接續使用 Lys-C 及 thermolysin 兩蛋白水解酵素，分別去分析 Trastuzumab 的 H-L 與 CH1 兩段胜肽位置 65。. 2.. 探討雙甲基化還原劑是否造成非預期雙硫鍵鍵結 根據先前實驗觀察到非預期雙硫鍵鍵結胜肽，推測可能由於雙甲基化. 還原劑影響非預期雙硫鍵鍵結產生，故在此實驗將利用不同濃度氰基硼氫 化納. (sodium cyanoborohydride) 試劑及不同反應時間觀察試劑是否影. 響雙硫鍵鍵結產生非預期雙硫鍵鍵結胜肽。. 3.. 分析蛇毒蛋白混合物的雙硫鍵鍵結 目前尚未有自動化分析蛋白質混合物雙硫鍵鍵結方法被報導過，在本. 研究中將使用蛇毒蛋白混合物為樣品，搭配雙甲基化與 RADAR 軟體策略， 藉此證明自動化分析蛋白混合物雙硫鍵鍵結策略之可行性。. 26.
(42) 第二章 實驗材料 第一節 1.. 實驗樣品. Bevacizumab (recombinant monoclonal antibody AvastinTM from Genetech). 2.. Trastuzumab (recombinant monoclonal antibody HerceptinTM from Genetech). 3.. Lysozyme (Sigma-Aldrich). 4.. Ribonuclease A (Sigma-Aldrich). 5.. Tainan cobra snake venom (來自台南縣歸仁鄉世界蛇王教育農場). 6.. Hsinchu cobra snake venom (來自國立清華大學). (蛇毒蛋白皆由國家衛生研究院感染症與疫苗研究所宋旺洲博士所提供). 第二節. 實驗藥品. 1.. Endoproteinase Glu-C (New England Biolabs). 2.. Endoproteinase Lys-C (Roche). 3.. Endoproteinase Thermolysin (Sigma-Aldrich). 4.. N-ethylmaleimide (Sigma-Aldrich). 5.. Porcine trypsin (Promega). 6.. Sodium acetate (Sigma-Aldrich). 7.. Sodium cyanoborohydride (Sigma-Aldrich). 8.. Urea (J.T.Baker) 27.
(43) 第三節. 實驗試劑. 1.. Acetonitrile (Merck). 2.. Formaldehyde-D2 (Sigma-Aldrich). 3.. Formic acid (J.T.Baker). 4.. Hydrochloric acid (J.T.Baker). 5.. Methanol (Mallinckrodt Baker). 6.. Sodium hydroxide (J.T.Baker). 7.. Triethylammonium bicarbonate (Applied biosystems/MDS Sciex). 第四節. 實驗儀器. 1.. 超純水系統 (Millipore Direct-Q3). 2.. 震盪器 (Scientific Industries, G-560). 3.. 乾浴槽 (Major Science, MD-02N-110). 4.. 酸鹼度計 (METTLER TOLEDO, EL20). 5.. 電磁加熱攪拌機 (IKA WERKE, C-MAG HS7). 6.. 桌上型離心機 (WHALE, pc-200). 7.. 超音波震盪洗淨器 (DELTA, DC150H). 8.. 微量天平 (METTLER TOLEDO, AL104). 9.. AB Sciex QSTAR XL mass spectrometer. 10. Agilent 1100 series HPLC (Agilent) 11. Thermo Scientific Q Exactive mass spectrometer 12. Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 Rapid Separation LC (RSLC) systems. 28.
(44) 第三章 第一節. 實驗方法. 蛋白質藥物水解及胜肽鏈雙甲基化反應. 一、 Buffer: 50 mM triethylammonium bicarbonate pH 7 with urea Enzyme: trypsin + Glu-C Sample: Bevacizumab; Trastuzumab 1.. 取 50 g 濃度 25 g/L 的 sample，加入 10 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，再加入 7 M urea。. 2.. 加入 0.7 L 100 mM NEM，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 3.. 加入 44 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，確保溶液 pH 值為 7。. 4.. 加 入 2 L trypsin (w/w 50:1) ， 放 置 於 水 浴 槽 中 ， 37 ℃ 下 水 解 overnight。. 5.. 加 入 2.5 L Glu-C (w/w 20:1) ， 放 置 於 水 浴 槽 中 ， 37 ℃ 下 水 解 overnight。. 6.. 接著加入 61.2 L 100 mM sodium acetate pH 5，調整 pH 值到 5。. 7.. 加 入 4% (v/v) formaldehyde-D 2 3.1 L， 600 mM sodiumcyan -oborohydride 3.1 L，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 二、 Buffer: 50 mM triethylammonium bicarbonate pH 7 with urea Enzyme: Lys-C Sample: Bevacizumab; Trastuzumab 1.. 取 50 g 濃度 25 g/L 的 sample，加入 10 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，再加入 7 M urea。. 2.. 加入 0.7 L 100 mM NEM，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 3.. 加入 44 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，確保溶液 pH 值為 7。 29.
(45) 4.. 加 入 10 L Lys-C (w/w 50:1) ， 放 置 於 水 浴 槽 中 ， 37 ℃ 下 水 解 overnight。. 5.. 接著加入 66.7 L 100 mM sodium acetate pH 5，調整 pH 值到 5。加 入 4% (v/v) formaldehyde -D 2 3.1 L， 600 mM sodiumcyan -oborohydride 3.1 L，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 三、 Buffer: 50 mM triethylammonium bicarbonate pH 7 with urea Enzyme: thermolysin Sample: Bevacizumab; Trastuzumab 1.. 取 50 g 濃度 25 g/L 的 sample，加入 10 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，再加入 7 M urea。. 2.. 加入 0.7 L 100 mM NEM，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 3.. 加入 44 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，確保溶液 pH 值為 7。. 4.. 加入 2 L thermolydin (w/w 25:1)，放置於水浴槽中，37℃下水解 overnight。. 5.. 接著加入 58.7 L 100 mM sodium acetate pH 5，調整 pH 值到 5。加 入 4% (v/v) formaldehyde -D 2 3.1 L， 600 mM sodiumcyan -oborohydride 3.1 L，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 第二節. 非預期雙硫鍵鍵結探討. 一、 Buffer: 50 mM triethylammonium bicarbonate pH 7 Enzyme: trypsin Reducing agent: 300、600、1200 mM sodium cyanoborohydride Sample: lysozyme 1.. 取 400 g 濃度 25 g/L 的 sample，加入 136 L 濃度 50 mM TEAB 30.
(46) pH 7。 2.. 加入 8 L 100 mM NEM，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 3.. 加入 120 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，確保溶液 pH 值為 7。. 4.. 加 入 16 L trypsin (w/w 50:1) ， 放 置 於 水 浴 槽 中 ， 37 ℃ 下 水 解 overnight。. 5.. 將水解後樣品分成三管各 80 L，加入 80 L 100 mM sodium acetate pH 5，調整 pH 值到 5。. 6.. 加入 4% (v/v) formaldehyde-D2 4 L，接著三個分管分別加入 300、 600 、1200 mM sodium cyanoborohydride 4 L，靜置室溫下反應 30 分鐘、60 分鐘、120 分鐘、overnight，並於四個反應時間分別取 出 20 L sample。. 7.. 反應完成後加入 4% (v/v) formic acid 調整 pH 值至 3。. 二、 Buffer: 50 mM triethylammonium bicarbonate pH 7 Enzyme: trypsin + Glu-C Reducing agent: 300、600、1200 mM sodium cyanoborohydride Sample: ribonuclease A 1.. 取 400 g 濃度 25 g/L 的 sample，加入 136 L 濃度 50 mM TEAB pH 7。. 2.. 加入 8 L 100 mM NEM，靜置室溫下反應 30 分鐘。. 3.. 加入 120 L 濃度 50 mM TEAB pH 7，確保溶液 pH 值為 7。. 4.. 加 入 16 L trypsin (w/w 50:1) ， 放 置 於 水 浴 槽 中 ， 37 ℃ 下 水 解 overnight。. 5.. 加 入 40 L Glu-C (w/w 20:1) ， 放 置 於 水 浴 槽 中 ， 37 ℃ 下 水 解 overnight。 31.
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