蛋白質藥物雙硫鍵鍵結分析

實驗設計搭配使用三種蛋白水解酵素 trypsin + Glu-C、thermolysin、

Lys-C 水解 Bevacizumab 與 Trastuzumab 兩蛋白質藥物，經由 trypsin + Glu-C 水解後產生六個 domain (CH2、CH3、CL、VH、VL、hinge region) 理論分子量範圍皆適合質譜分析，除了 CH1 domain 理論分子量約為 8000 Da，分子量太大不利於質譜分析。藉由 thermolyisn 水解後 CH1 domain 分子量約為 700 Da，落於適合質譜分析的分子量範圍。使用 Lys-C 是由 於利用 trypsin + GluC 水解其 H-L domain 分子量太小，不利於分析，經 Lys-C 水 解 H-L domain 分 子 量 為 1356.49 Da 較 適 合 質 譜 分 析 。 Bevacizumab 與 Trastuzumab 兩蛋白質藥物序列十分相近，分別運用三 種蛋白水解酶水解，只有 VH、VL domain 具有差異性，聯集後可鑑定出 8 個 domain 的雙硫鍵鍵結。

二、RADAR 搜尋結果

1. Bevacizumab (使用 trypsin + Glu-C 水解酵素)

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使用 trypsin + Glu-C 水解酵素水解時，預期產生 CH2、CH3、CL、

VH、VL、hinge region 等 6 個 domain 的雙硫鍵鍵結。圖十五為Bevac izumab 於 pH 7 環境下，經蛋白水解酶 trypsin + Glu-C 水解與雙甲基化反 應後藉由 RADAR 軟體比對結果。結果產生 CH3、CL、VL、Hinge 等 4 個 domain 的雙硫鍵鍵結，缺乏 CH2 與 VH domain 的雙硫鍵鍵結。藉由 調整參數至 missed cleavage 2，圖十六為調整參數後 RADAR 比對結果，

產生 CH2、CH3、CL、VL、Hinge 的雙硫鍵鍵結，得到 CH2 與 VH domain 鑑定結果。綜合兩次結果可達到 6 個 domain 的雙硫鍵鍵結。

2. Bevacizumab (使用 thermolysin 水解酵素)

使用 thermolysin 水解酵素水解時，預期得到 CH1 domain 的雙硫鍵 鍵結。圖十七為 Bevacizumab 於 pH 7 環境下，經蛋白水解酶 thermolysin 水解與雙甲基化反應後藉由 RADAR 軟體比對結果。結果產生 CH1、CH2、

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基化反應後經由 RADAR 軟體比對。分析結果得到 CH3、CL、VH、VL、

Hinge 等雙硫鍵鍵結，缺乏 CH2 domain。調整 RADAR 參數至 missed cleavage 2 再次比對，圖二十為調整參數後 RADAR 比對結果，產生 CH2 domain 的雙硫鍵鍵結。綜合兩次結果可達到 6 個 domain 的雙硫鍵鍵結。

5. Trastuzumab (使用 thermolysin 水解酵素)

使用 thermolysin 水解酵素水解時，預期得到 CH1 domain 的雙硫鍵 鍵結。圖二十一為 Trastuzumab 於 pH 7 環境下，經蛋白水解酶 thermolysin 水解與雙甲基化反應後藉由 RADAR 軟體比對結果。結果產生 CH1、CH2、

1. Bevacizumab

圖二十三為 Bevacizumab 經蛋白水解酶水解產生 CL domain 的 MSMS 圖譜，胜肽序列為*SGTASVVCLLNNFYPR, *VYACE，m/z 為

41 碎片離子。圖譜中若含有- 2 Da 表示形成 cysteine-thioaldehyde；+ 32 Da 表示形成 cysteine persulfide；- 34 Da 則是形成 dehydroalanine⁶⁶。圖二 十四到圖三十為 Bevacizumab 經蛋白水解酶水解後產生含雙硫鍵胜肽的 MSMS 質譜圖，分別是 CH1、CH2、CH3、VH、VL、H-L、hinge 等 domain，

圖中大多訊號峰皆可成功標記，證明利用 RADAR 軟體比對結果可信度 高。

2. Trastuzumab

圖三十一為 Trastuzumab 經蛋白水解酶水解產生 CL domain 的 MSMS 圖譜，胜肽序列為*SGTASVVCLLNNFYPR, *VYACE，m/z 為 796.10 (3+)，分子量符合理論分子量 2385.08 Da。圖譜中產生兩個訊號 提升的 a₁離子分別為 104.14 Da 與 92.10 Da，確認 N 端為 Ser 與 Val 兩 胺基酸。將圖譜中 b、y 離子與理論 b、y 離子進行比對，確認鑑定結果正 確 性 ， 圖 中 大 部 分 訊 號 峰 皆 可 成 功 對 應 。 圖 三 十 二 到 圖 三 十 八 為 Trastuzumab 經蛋白水解酶水解後產生含雙硫鍵胜肽的 MSMS 質譜圖，

分別是 CH1、CH2、CH3、VH、VL、H-L、hinge 等 domain，圖中大多 訊號峰皆可成功標記，證明利用 RADAR 軟體比對結果可信度高。

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四、結果與討論

此段主要討論 RADAR 參數設定及藉由雙硫鍵胜肽的 MSMS 圖譜離子 碎片驗證 RADAR 鑑定結果的可信度討論。

1. Bevacizumab

分析 Bevacizumab 的 8 個 domain 的雙硫鍵鍵結，使用 trypsin + Glu-C 預期雙硫鍵鍵結胜肽，例如圖十四上*VTCVVVDVSHE, *VYACE 的雙硫鍵 鍵結即為非預期雙硫鍵鍵結胜肽，而關於非預期雙硫鍵鍵結將於第三節中 探討。

2. Trastuzumab

利用 RADAR 軟體自動分析 Trastuzumab 於 8 個 domain 的雙硫鍵鍵

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結，使用 trypsin + Glu-C 水解酵素實驗中，預期得到 6 個 domain 的雙硫 鍵鍵結，而比對結果缺乏 CH2 domain 結果，可能產生錯誤切割現象，故 調整 missed cleavage 參數為 2，則得到 CH2 鑑定結果。使用 thermolysin 水解酵素實驗中，成功鑑定得到 CH1 domain 的雙硫鍵鍵結。使用 Lys-C cyanoborohydride) 進行探討，證明此還原劑是否將造成雙硫鍵斷裂，進 而使得非預期雙硫鍵鍵結產生。

在此實驗挑選兩個蛋白質分別為 lysozyme 以及 ribonuclease A，兩蛋 白分子量分別為 14.4 kDa 與 13.7 kDa，皆含有四條雙硫鍵鍵結，其蛋白 質序列資料皆參考自 uniport (http://www.uniprot.org/)。由於兩蛋白皆符合 雙硫鍵鍵結數較少，複雜度低，故在此挑選兩蛋白質進行實驗探討，兩樣 品分別使用 trypsin 與 trypsin + Glu-C 酵素水解，lysozyme 在 trypsin only 環境下即可鑑定出四條雙硫鍵鍵結，而 ribonuclease A 則須使用 trypsin +