蛋白質之電泳分析（SDS-PAGE）

實驗所使用的電泳裝置為Bio-Rad 蛋白質電泳槽，待鑄膠裝置組 合後，先加入分離膠體溶液（separating gel），再加入酒精將上層膠 壓平，待凝固後倒掉酒精並擦拭乾後加入集膠溶液（stacking gel），

插上齒梳，待膠體凝固後置於電泳槽中，注入電泳緩衝液（running buffer）。取50mg蛋白質樣本加入其1/5體積的 6× sample loading dye，

混勻後在99 ℃加熱5分鐘後，迅速置於冰上再注入樣本槽。先以80V 進行電泳，待藍色染劑跑到分離膠體時，將電壓調整為110V繼續電 泳，直到藍色染劑跑到膠體底部，關閉電源將膠體取出。

2.7 西方墨點法 （Western blotting）

實驗所使用的電泳裝置為Bio-Rad 濕式電泳轉漬槽，取出跑好 的SDS-PAGE 後，切除集膠體部份，膠片浸在轉漬緩衝液（Transfer buffer）中。取轉印紙（硝化纖維紙 nitrocellulose paper)切成膠片大

小，用甲醇浸潤，先鋪上三張濕潤的3M 濾紙，後鋪上濕潤的轉印

紙，疊上已濕潤的膠片，再鋪上三張濕潤的3M 濾紙。（注意！過

程需趕走氣泡），轉印紙那面位向正極，膠片那面位向負極，以 70 mv 轉印 3 小時。之後，將轉印紙放入 1x TBST 含 5% 脫脂牛奶，

室溫搖盪1 小時，以填塞沒有蛋白質轉印上去的空間。倒掉進行 Blocking 的牛奶，加入第一次抗體（1：1000 稀釋），置於室溫搖 擺1 至 2 小時或放置 4℃隔夜（超過 12 小時）。倒去第一次抗體或 回收重覆使用，以1 x TBST 清洗 5 分鐘三次。再加入第二次抗體（1：

1 x TBST 清洗 5 分鐘三次。最後將轉印紙浸泡於 ECL 試劑(Enhanced chemiluminescence)反應 1 分鐘，再將轉印紙以透明投影片夾住，黏 貼固定於壓片夾(cassette)中，在暗房操作以 X-ray film (Kodak)感光 得蛋白質訊號。

2.8 免疫螢光染色( Immuocytochemistry )

先將蓋玻片浸於99%酒精中，過火，小心置入 6 孔盤中(1 well 一片)，加入培養液3ml/well。再種入細胞，每 well 種 1×10⁵個細胞。

待24 小時細胞貼附後，換成含有 20μM EGCG 的培養液，培養不同 的時間後(0、15、30、60、120 分鐘)，將培養液吸乾。以 PBS 洗滌 三次，用4% paraformaldehyde/PBS 固定細胞 10~15 分鐘，吸去 4%

paraformaldehyde/PBS 並以 PBS 洗三次。至於冰上，加入 0.2%

TritonX-100 / PBS 20 分鐘，再用 PBS 洗三次，再加入 5% BSA/PBS、

室溫、1 小時。移去 5% BSA/PBS 後，加入第一次抗體（1：100，5%

BSA/PBS 稀釋），置於 4℃放置隔夜。第二天，回收第一次抗體，用 PBS 洗 3 次。再加入第二次抗體(1:200，1×PBS 稀釋)，避光置於 4℃

放置隔夜。隔日，移去第二次抗體，用PBS 洗三次。加入 1 ml DAPI(1:50000，1×PBS 稀釋)避光置於室溫反應 15 分鐘，用 PBS 洗

三次。滴取一滴封片液(Mounting medium)於載玻片中心，小心夾取

蓋玻片，將細胞貼附面朝下蓋於載玻片上。使用共軛焦雷射顯微鏡 (confocal laser scanning microscope)觀察並擷取影像。

2.9 統計分析

實驗結果以平均值標準差(mean ± SD)表示，使用 ANOVA(單因 子變異分析) 來決定實驗組與對照組之差異。 ＊表示p＜0.05；＊＊

表示p＜0.01；＊＊＊表示 p＜0.001，當 p 值小於 0.05 以下時，則認 為具統計上意義。

第三章 結果

3.1 EGCG 抑制頭頸部癌細胞的增生

首先，我們將四株頭頸部癌細胞株(SAS、Cal-27、Ca9-22、HSC3)

分別以0、5、10、20、40 μM 的濃度處理各種黃酮類(Apigenin、Rutin)、

多酚類(EGCG、TF1、TF2、TF3、Magolol、5GG)和其他類別(emodin、

Geniposide、Osthole)的抗癌天然化合物 24 小時，再使用 MTT assay 方 法來測定細胞存活率。在 Figure.1a 中，我們發現 EGCG 在三株頭頸 部癌細胞株(SAS、Cal-27、Ca9-22)中皆為最有效抑制癌細胞生長的 化合物。因此，進一步的將四株頭頸部癌症細胞株在 EGCG 處理下 的存活曲線整理於Figure.1b 中，SAS 的 IC50為5 μM；Cal-27 的 IC⁵⁰ 為15 μM；Ca9-22 的 IC50為20 μM，而 HSC3 細胞株在 EGCG 的處 理下無抑制細胞生長的現象，此特例我們將在之後的段落中研究與討 論。為觀察EGCG 處理後短時間內細胞中蛋白的變化，我們取 20 μM 此共同引起抑制生長的有效劑量，作為之後觀察細胞中蛋白變化的處 理劑量。

3.2 EGCG 促使頭頸部癌細胞細胞週期停滯於 G1 期並誘導細胞凋亡

在前面的實驗中，找到了最有效抑制頭頸部癌細胞生長的天然物 EGCG，而許多研究 EGCG 的報告中，皆指出 EGCG 在許多不同品系

的癌症細胞中能引起許多的抗癌效果，如：細胞週期停滯於 G1 期

23,24,25、誘導癌細胞的凋亡^71-74 …等。為了驗證是否這些 EGCG 的抗

癌效果一樣也發生在頭頸部癌細胞中，我們將SAS、Cal-27 細胞分別 以20 μM EGCG 處理 0、12、24、36、48 小時，使用流式細胞儀去分 析其細胞週期的變化。在 Figure.2 中，不論是在 SAS 或是 Cal-27 細 胞中，在處理 12 小時 EGCG 之後，都可以發現停滯於 G1 期細胞的 比例明顯的升高，也可以看到凋亡的癌細胞比例隨著處理時間的變長 也逐漸變多。

3.3 EGCG 促使細胞週期停滯 G1 期、細胞凋亡之相關蛋白的表現

經細胞層面的方法證實，也進一步的使用西方點墨法來檢查是否 在蛋白的分子層面上也是如此。將 SAS、Cal-27 細胞分別以 20 μM EGCG 處理 0、12、24、36、48 小時，再收集各組之細胞總蛋白，使 用西方點墨法觀察其蛋白變化。在Figure.3a 中，發現與停滯於 G1 期

的上升。與細胞凋亡相關的Caspase 3、Caspase 9、PARP 等蛋白，當 細胞凋亡時這些蛋白會出現裂解態(Cleaved form)，而隨著處理 EGCG 時間的變長也可觀察到這些蛋白裂解態的上升。

3.4 EGCG 抑制頭頸部癌細胞中 STAT3 蛋白的磷酸化

先前的研究中指出，癌細胞中持續活化的 STAT3 和癌細胞的存 活、增生是有相關性的¹⁸。且在眾多品系的癌症病患中，大於90%比 例的口腔癌病患中可以發現STAT3 過度活化的現象 ⁸，此情形在其他 的癌症病患中卻非如此⁷⁵。使我們想探究，EGCG 對頭頸部癌細胞株 的抑制活性，是否跟 STAT3 有所關聯? 因此，我們用西方點墨法來 觀察 EGCG 對於頭頸部癌細胞中 STAT3 磷酸化的影響。將 SAS、

Cal-27 細胞分別處理 0、5、10、20、40 μM EGCG 1 小時，在 Figure.4a

中可以看到隨著 EGCG 處理劑量的提高，不論是在 ser727 位置 (P-STAT3(727))或是 try705 位置(P-STAT3(705))磷酸化的 STAT3 其表 現量越來越少。在Figure.4b 中，SAS、Cal-27 細胞分別處理 0、15、

30、60、120、240 分鐘 20 μM 的 EGCG，隨著處理時間的延長，STAT3 的磷酸化表現量也逐漸的下降。在 Figure.4c 中，我們再利用免疫螢 光染色法以共軛焦雷射顯微鏡(confocal laser scanning microscope)來

觀察細胞層面的變化。Figure.4c 中，我們將 SAS、Cal-27 細胞用 20 μM EGCG 分別處理 0、15、30、60、120 分鐘，並使用免疫螢光染色法 來觀察 P-STAT3(705)的表現量(綠色螢光) (藍色螢光則是細胞核的

EGCG 後可觀察到 STAT3 明顯的移動至細胞核外。

3.5 EGCG 抑制 STAT3 蛋白之下游蛋白的表現

先前許多的研究已找出許多STAT3 轉錄的目標基因所產生出之 下游蛋白，例如: Bcl-2, VEGF, Mcl-1, and cyclin D1^13-17，而這些由 STAT3 所轉錄出來的下游蛋白質，大多與癌細胞的存活、增生有關⁹。

為了了解在處理 EGCG 之後對於 STAT3 所轉錄之基因其下游蛋白表 現量之影響，SAS、Cal-27 細胞們分別處理 0、12、24、36 小時的 20 μM EGCG，再收集各組細胞的總蛋白，使用西方點墨法觀察各組 STAT3 下游蛋白之變化。在 Figure.5 中可以觀察到，隨著 EGCG 處理 時間的增加，Bcl-2, VEGF, Mcl-1, and cyclin D1 這些 STAT3 轉錄的下 游蛋白表現量也逐漸下降。根據以上的結果得知，EGCG 在抑制 STAT3 磷酸化之後，也阻斷了 STAT3 下游的蛋白表現。

3.6 EGCG 抑制頭頸部癌中 Interleukin-6 誘導 STAT3 蛋白的磷酸化

先前的研究報告指出 interleukin-6 (IL-6)會藉由刺激 STAT3 Tyr705 位置的磷酸化而促進腫瘤細胞的存活與生長 ²⁸。並且，也有研

IL-6 來刺激自身的 STAT3 活化 ¹¹。因此，為了了解 EGCG 對於 IL-6 在頭頸部癌細胞中誘導 STAT3 活化之現象的影響，我們使用西方點 墨法來觀察STAT3 磷酸化的情形。SAS、Cal-27 細胞們在分別處理 0、

30、60、120、240 分鐘 20 μM EGCG 後，移除含有 EGCG 的培養液，

換成含有10 ng/ml Interleukin-6 的 DPBS 刺激 10 分鐘，再收集各組 細胞的蛋白，以西方點墨法來觀察 P-STAT3(705)蛋白量的變化。在 Figure.6a 中可觀察到，在沒有處理 EGCG 的組別裡，雖然可以明顯 看見IL-6 增強 P-STAT3(705)的表現量。但是在有處理 EGCG 的組別 中，我們仍然可以發現 P-STAT3(705)的表現量還是被抑制下來的。根 據以上的結果得知，EGCG 除了可抑制 STAT3 磷酸化之外，EGCG 也可以消除IL-6 在口腔癌細胞中誘導 STAT3 活化的能力。

3.7 EGCG 抑制由 Interleukin-6 所引發的細胞增生

先前的研究報告指出 interleukin-6 (IL-6)會藉由刺激 STAT3 Tyr705 位置的磷酸化而促進腫瘤細胞的存活與生長 ²⁸。所以，我們也 將 EGCG 對於 IL-6 在頭頸部癌細胞中誘導的細胞增生現象進行試 驗。SAS、Cal-27 細胞待貼盤後，先以無 FBS 的培養液培養 15 個小 時（消除FBS 中其他會刺激細胞增生的因子的干擾），再分別處理 0、

5 、 10 、 20 、 40 μM EGCG ， 各 組 同 時 加 入 10 ng/ml 濃 度 的 Interleukin-6 ，在處理 24 小時後，使用 MTT assay 分析各組的細胞 存活率。在 Figure.6b 中可觀察到，在沒處理 EGCG 的組別裡，可以 明顯看見IL-6 有刺激細胞增生的效果；而在有處理 EGCG 的組別中，

EGCG 仍然可以抑制頭頸部癌細胞的生長。

AG490 是公認抑制 STAT3 磷酸化的化合物 ⁷⁶；先前的研究指出 Curcumin 也會抑制 interleukin-6 所誘導之 STAT3 磷酸化 ⁷⁷；而 Apigenin 也是目前熱門的有抗癌活性的多酚類成分。所以，更近一步 的，我們將EGCG 與 Apigenin、AG490、Curcumin 一起比較抑制 IL-6 所誘導的細胞增生現象之效果。SAS、Cal-27 細胞待貼盤後，先以無 FBS 的培養液培養 15 個小時，再分別處理 20 μM EGCG、20 μM Curcumin、40 μM Apigenin、40 μM AG490，各組並同時加入 10 ng/ml 濃度的Interleukin-6 ，在處理 24 小時後，以 MTT assay 分析各組細 胞的存活率。Figure.6c，在與各組比較之下，可以發現 EGCG 抑制 IL-6 所誘導的細胞增生之效果是最有效的。

第四章 討論

許多研究已證實天然植物中的多酚類化合物有抑制癌細胞生長 或產生細胞毒性的作用。我們從植物中萃取出具有抗癌活性的天然化 合物來比較其抑制頭頸部癌症細胞的活性。以下簡單的介紹這些天然 物的背景：

TF1 、 TF2 、 TF3 、 5GG ： TF1 是 Theaflavin 的 簡 稱 、 TF2 是 Theaflavin-3-gallate的簡稱、TF3是Theaflavin-3,3’-digallate的簡稱，這 三個化合物們是從紅茶中萃取出的多酚類化合物；5GG則是有五個 Galloy機團的化合物，其化學名為Penta-O-galloyl-β-D-glucose。其中，

TF3與5GG已被證實可藉由抑制前列腺素活化前列腺素受器的功能，

以達到抑制前列腺癌的效果⁷⁸。

Emodin(大黃素)是由中藥植物裡的大黃萃取出的天然化合物。

在中醫的使用上，主要用於瀉下、治療實熱便秘、食積停滯、腹痛、

急性闌尾炎、急性傳染性肝炎、血瘀經閉、牙痛、吐血、急性結膜炎、

水腫、淋濁等。外用可治療燒燙傷、化膿性皮膚病、癰腫瘡瘍等病症，

水腫、淋濁等。外用可治療燒燙傷、化膿性皮膚病、癰腫瘡瘍等病症，