第一章 序論
1.1 頭頸部癌症(Head and neck squamous cell carcinoma)之
頭頸部癌症（Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）
或其他人稱之口腔上皮細胞癌（Oral squamous cell carcinoma, OSCC）
是全球第八常見的癌症1,2。在台灣，癌症死因的排名中，頭頸部癌排 名第六；台灣每年每壹百萬人中約有兩千人死於口腔癌。根據統計，
國人吃檳榔、抽煙、酗酒的習慣和罹患口腔癌的機率有著高度的關聯
性 3,4,5。但要戒除這些不良的習慣是困難的。也是為什麼即使早期發
現口腔癌，加以治療，仍有一半以上的口腔癌病患其病程會繼續惡化
6，導致 HNSCC 末期的存活率仍然很不理想3。因此，尋找治療藥物 是迫切需要的。
1.2 訊息傳遞及轉錄因子 3 （Signal transducer and activator of transcription 3）之介紹
Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)是許多 生長因子與細胞激酶(cytokine)的重要訊息傳遞分子7。Jak/Stat 訊息 傳導路徑是許多 cytokines 和生長因子在接受到訊息後，結合細胞核
中特定的基因，以傳達出訊息8。以下介紹 STAT3 在細胞中是如何傳 遞訊息的：
當細胞膜上的接受器皆受到 cytokines 或生長因子的訊息時，
Jak/tyrosine kinase 2( JAK family protein kinases) 將啟動磷酸化，接著 磷酸化細胞質中的 STAT3。被磷酸化的 STAT3 會組合成 dimer，再進 入細胞核與特定的 DNA 片段結合，並轉錄這些 DNA 片段，使細胞 Tyrosine，另一個則是位於 727 序列的 Serine。不同的 cytokines 或生 長因子所傳遞的訊息，使 STAT3 磷酸化於不一樣的位置。目前的研 究發現，刺激 STAT3 磷酸化於 705 序列 Tyrosine 位置的 cytokine 為
Interleukin-611；而刺激 STAT3 磷酸化於 727 序列 Serine 位置的生長 因子為 EGFR12。
細胞中有許許多多錯綜複雜的訊息傳遞路徑，在抑制癌細胞生長 研究上 STAT3 深受矚目，主要歸因於 STAT3 所結合的這些特定的 DNA 片段。目前已證實的 STAT3 結合片段有：bcl-2、bcl-xL、mcl-1、
cyclin D1、VEGF13-17，這些片段與細胞的存活、週期的運轉有關。從 癌細胞的角度來看，bcl-2、bcl-xL、mcl-1 過度表現可幫助抑制癌細 胞發生凋亡；cyclin D1 的過度表現，可幫助癌細胞逃過細胞週期的檢 查點，使細胞週期繼續進行，使癌細胞增生；VEGF 的表現，則是促
成癌細胞周圍的血管新生，提供癌細胞生長的養分 7。由此可知，
STAT3 在癌細胞的增生中扮演著很重要的腳色。
1.3 Signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）與口 腔癌之關係
STAT3 在致癌基因傳遞訊息中是不可或缺的中間者，常常在許 多癌症中可看到 STAT3 不正常的持續活化 7,18-20，如：有 82%的前列 腺癌可發現 STAT3 的持續活化21；而在乳癌中，則是 70%22；在肺癌 中，則只有半數的癌細胞有此現象23。但是，在口腔癌中，卻是超過 90%以上的口腔癌病患 8，皆可發現 STAT3 不正常的過度活化。
在 2002 年 Cancer 期刊中報導臨床上罹患口腔癌的病患跟腫瘤內 STAT3 變化的統計調查。從 90 位口腔癌的病患檢體中，有 74 種品 系的口腔癌細胞被發現有不正常活化的 STAT3 表現量。在這些採樣 的病人中，有 74%的病患在癌症病程早期，就已經發現 STAT3 不正
常高度活化的情形24。同一年，在 Cancer research 的期刊中，也有學 者發現，若是在口腔癌細胞中 STAT3 磷酸化的程度越高，則病患的 存活率越低25。
由這些證據指出，STAT3 在治療頭頸部癌，是一個重要的指標。
1.4 第六白介素（Interleukin-6）誘導之 STAT3 路徑
Interleukin-6 是一個 cytokine 常與免疫調節發炎反應有關；也在 調節細胞凋亡、增生、血管新生和分化上扮演重要的角色26,27。先前 的 研 究 證 實 ， 在 頭 頸 部 癌 中 分 泌 interleukin-6 主 要 刺 激 STAT3 Tyrsine705 位置的磷酸化 11。
1.5 第六白介素與頭頸部癌症之關係
先前的研究報告指出 interleukin-6 會藉由刺激 STAT3 Tyr705 位 置的磷酸化而促進腫瘤細胞的存活與生長 11,28。並且，也有研究指出 HNSCC 細 胞 株 會 自 體 分 泌 (autocrine) 或 旁 分 泌 (paracrine) interleukin-6 來刺激自身的 STAT3 活化11。當 IL-6 結合在細胞表面的 接受器上時（JAK family protein kinases），在細胞質中未活化的 STAT3
STAT3 dimer 會和特定的基因片段結合例如：cyclin D1, Bcl-2，並轉 錄這些片段，而使頭頸部癌細胞達成增生、逃脫細胞凋亡…等目的11。
在臨床上的研究也發現 interleukin-6 與頭頸部癌相關的例子：在 頭頸部癌病患血中可以測量到高濃度的 interleukin-629；在頭頸部癌病 患從口腔轉移到淋巴節的腫瘤組織切片裡，可以觀察到 interleukin-6 被高度的轉錄 30； interleukin-6 會增進頭頸部癌細胞轉移侵犯骨頭
31；頭頸部癌病患 interleukin-6 的血中濃度越高，則其放射線治療阻 抗性也越高 32；將從頭頸部癌病患所取下的口腔癌細胞，在 primary culture 後，外加 interleukin-6 可發現促進頭頸部癌細胞生長之現象33。 由這些例子指出，interleukin-6 對於頭頸部癌病患的治療而言，
是一明顯的生物指標(biomark)，對研究頭頸部癌而言有相當的助益。
1.6 茶的介紹
茶在中國被當作日常飲料和天然的藥草已有幾千年的歷史，而在 世界上也是最常飲用的農產品之ㄧ，在植物分類上屬山茶科
（Theaceae）、山茶屬（Camellia），每年消耗數百萬公噸以上。一 般公認茶的原產地為中國雲南地區，之後才往亞洲其他氣候溫暖的地 方擴散。而對於飲茶的由來，依據中國古老的傳說，茶的效用是由神 農氏傳給平民百姓的【陸羽茶經:「茶之為飲，發乎神農氏」】。在
當時，茶主要是被當作藥品來服用，直到唐朝時期才漸漸成為一種日
草】則記載：「茶，炒煎飲，治熱毒赤白痢。」；而明代大醫學家李時
茶的成分很複雜，其主要活性成分有（一）黃烷酮醇類的兒茶素
（catechins），（二）酚酸類（gallic acid），（三）花青素類（anthocyanins），
（四）茶黃素（theaflavin），（五）生物鹼類（caffeine）等。而茶 多酚類化合物為茶葉中最廣泛研究的物質，其藥理特性較其他物質研 究的較為清楚，目前主要可分為四個方面：抗菌34、抗發炎35、影響 catecholamines 代謝36,37、抑制脂質過氧化（lipid peroxidation）38。
1.7 綠茶與抗癌之簡介
綠茶與紅茶雖然都是以相同的茶葉來源製造，但卻因為製造過程 不同，不但有不同的風味，對健康上的功效也完全不同。而綠茶之所 以能發揮健康功效，主要是因製程中保存了較多完整的、還原態的多 酚類，對人體健康上有更多保護的效果 39。在流行病學上，也早已有 調查證實，飲用綠茶可以降低食道癌的發生率40。而另一篇關於抽 菸、酗酒和飲茶的研究上更指出，飲用綠茶可以降低食道癌與胃癌的 發生率41。
綠茶含有許多有生物活性的多酚類，因此被考慮用於在抑制腫瘤 生成和抑制腫瘤生長上42。近幾年來，綠茶被廣泛的發現在許多不同 的癌症中有化學防治（chemopreventive）與化學治療
（chemotherapeutic）效果 43-50。綠茶中多酚類化合物主要是由 catechin compounds 所組成，而在許多先前的研究中發現 catechin compounds 才是酚類化合物中活性的部份51。目前認為 catechin compounds 在預 防與治療癌症上的功能大致上可分為，清除自由基、抗致癌物質、抑 制發炎反應。
清除自由基：catechin compounds 具有很強的抗氧化能力52，可 將細胞產生之過多的自由基清除，以防止這些身體來不及代謝的自由 基去攻擊 DNA，而造成細胞突變或癌化。因此，許多學者們認為 catechin compounds 可以有效降低 initiation stage 的發生，而達到預防 癌症的效果53。
抗致癌物質(Carcinogen)：catechin compounds 除了可間接的因降 低自由基的含量而阻斷致癌物質對身體的影響外，某些致癌物質甚至 是直接與 catechin compounds 進行反應 54，如 tea catechins 抑制
nitrosation reaction，便是因為 catechin compounds 與 nitrosating species 作用，大量降低了 N-nitro compounds 的量 55。
抑制發炎反應：許多報告指出 tea catechins 對於抑制
inflammatory56與 hyperplasia57具有相當的活性。發炎反應會導致細胞 產生 hyperplasia 的現象，長期處於 hyperplasia 下的細胞，可能會導 致 tumor promotion，這種情形在皮膚癌、血癌中尤其明顯。目前認為，
tea catechins 抑制發炎反應的作用，是因其明顯降低白介素 mRNA 的 表現量的關係58。
近幾年來的研究發現，(-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)是
catechin compounds 中最主要、最有效的抗氧化活性多酚類成分，所 以有非常多研究綠茶機轉的學者們開始專注於
(-)-Epigallocatechin-3-gallate 的探討。
1.8 表沒食子兒茶素沒食子酸脂（EGCG）之抗癌背景介紹
(-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)是綠茶中主要的活性多酚類 成分，也擁有抑制癌化因子的潛力59。EGCG 在許許多多不同的癌症 中陸陸續續的被發現其抗癌效果，例如：在前列腺癌中，EGCG 藉由 活化 p53 蛋白並抑制 MDM2 蛋白來誘使癌細胞凋亡；在多發性骨髓 瘤細胞中，EGCG 藉由調控 LR1 蛋白，抑制骨髓細胞的癌化，並使 骨髓瘤細胞週期停滯且凋亡60。EGCG 在許多不同的癌細胞上產生的 抗癌機制，主要的機轉為：抑制血管新生61、藉由調控生長因子來抑 制癌細胞增生62-65、抑制氧化傷害66、誘導癌細胞凋亡 67,68、使細胞週 期停滯69。而且，更重要的是，已有研究證實，EGCG 是有選擇性的 抑制癌細胞的生長以及誘導凋亡，但對於正常細胞的生長卻沒有任何
影響70，使得我們對 EGCG 更加好奇並投身於 EGCG 研究。
1.9 實驗動機
綠茶的抗癌活性成分 EGCG 在許多的癌細胞上都有發現不同的 功效，而即使流行病學研究已指出綠茶可降低口腔癌的罹患率，但是 EGCG 對於抑制口腔癌細胞的詳細機轉還未被清楚的研究。在得知 STAT3、IL-6 和頭頸部癌的增生、癌化有高度相關的背景下，我們著 手研究 EGCG 是否對於由 IL-6 誘導的 STAT3 路徑有所影響。以確定，
是否 EGCG 也將是個可用於治療頭頸部癌症的新希望。
第二章 材料與方法
2.1 實驗材料
1. Osthole、Magolol、Geniposide、Emodin 得自於林慧怡老師實驗室，
China Medical University (Taichung, Taiwan)。
2. Ritin、TF1、TF2、TF3、5GG 得自於林仁混老師實驗室，National Taiwan University (Taipei, Taiwan)。
3. Apigenin 、 (−)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)，購自Sigma公司。
4. Interleukin-6購自Santa Cruz Biotechnology公司。
5. Anti STAT3、PhosphoSer727-STAT3與β-actin antibody，購自Cell Signaling Technology, Inc.公司。
6. PhosphorTyr705-STAT3 antibody購自Santa Cruz Biotechnology公司。
2.2 細胞培養
2.2.1 細胞株
本研究之實驗細胞SAS、Cal-27、Ca9-22、HSC3等頭頸部癌症細 胞株皆由高銘欽老師實驗室所贈。
SAS: 培 養 於 90% 的 DMEM ( Dulbecco Modified Eagle Medium)，包含有10%的FBS（fetal bovine serum）、1%青黴素與鏈
黴 素 的 混 合 抗 生 素 （100× stock solution ： Penicillin 50U/ml ； Streptomycin 50 μg/ml, Gibco）
Cal-27 ： 培 養 於 90% 的 DMEM ( Dulbecco Modified Eagle Medium)，包含有10%的FBS（fetal bovine serum）、1%青黴素與鏈 黴 素 的 混 合 抗 生 素 （100× stock solution ： Penicillin 50U/ml ； Streptomycin 50 μg/ml, Gibco）
Cal-27 ： 培 養 於 90% 的 DMEM ( Dulbecco Modified Eagle Medium)，包含有10%的FBS（fetal bovine serum）、1%青黴素與鏈 黴 素 的 混 合 抗 生 素 （100× stock solution ： Penicillin 50U/ml ； Streptomycin 50 μg/ml, Gibco）