第三章 結果
3.5 EGCG 抑制 STAT3 蛋白之下游蛋白的表現
先前許多的研究已找出許多STAT3 轉錄的目標基因所產生出之 下游蛋白，例如: Bcl-2, VEGF, Mcl-1, and cyclin D113-17，而這些由 STAT3 所轉錄出來的下游蛋白質，大多與癌細胞的存活、增生有關9。
為了了解在處理 EGCG 之後對於 STAT3 所轉錄之基因其下游蛋白表 現量之影響，SAS、Cal-27 細胞們分別處理 0、12、24、36 小時的 20 μM EGCG，再收集各組細胞的總蛋白，使用西方點墨法觀察各組 STAT3 下游蛋白之變化。在 Figure.5 中可以觀察到，隨著 EGCG 處理 時間的增加，Bcl-2, VEGF, Mcl-1, and cyclin D1 這些 STAT3 轉錄的下 游蛋白表現量也逐漸下降。根據以上的結果得知，EGCG 在抑制 STAT3 磷酸化之後，也阻斷了 STAT3 下游的蛋白表現。
3.6 EGCG 抑制頭頸部癌中 Interleukin-6 誘導 STAT3 蛋白的磷酸化
先前的研究報告指出 interleukin-6 (IL-6)會藉由刺激 STAT3 Tyr705 位置的磷酸化而促進腫瘤細胞的存活與生長 28。並且，也有研
IL-6 來刺激自身的 STAT3 活化 11。因此，為了了解 EGCG 對於 IL-6 在頭頸部癌細胞中誘導 STAT3 活化之現象的影響，我們使用西方點 墨法來觀察STAT3 磷酸化的情形。SAS、Cal-27 細胞們在分別處理 0、
30、60、120、240 分鐘 20 μM EGCG 後，移除含有 EGCG 的培養液，
換成含有10 ng/ml Interleukin-6 的 DPBS 刺激 10 分鐘，再收集各組 細胞的蛋白，以西方點墨法來觀察 P-STAT3(705)蛋白量的變化。在 Figure.6a 中可觀察到，在沒有處理 EGCG 的組別裡，雖然可以明顯 看見IL-6 增強 P-STAT3(705)的表現量。但是在有處理 EGCG 的組別 中，我們仍然可以發現 P-STAT3(705)的表現量還是被抑制下來的。根 據以上的結果得知，EGCG 除了可抑制 STAT3 磷酸化之外，EGCG 也可以消除IL-6 在口腔癌細胞中誘導 STAT3 活化的能力。
3.7 EGCG 抑制由 Interleukin-6 所引發的細胞增生
先前的研究報告指出 interleukin-6 (IL-6)會藉由刺激 STAT3 Tyr705 位置的磷酸化而促進腫瘤細胞的存活與生長 28。所以，我們也 將 EGCG 對於 IL-6 在頭頸部癌細胞中誘導的細胞增生現象進行試 驗。SAS、Cal-27 細胞待貼盤後，先以無 FBS 的培養液培養 15 個小 時（消除FBS 中其他會刺激細胞增生的因子的干擾），再分別處理 0、
5 、 10 、 20 、 40 μM EGCG ， 各 組 同 時 加 入 10 ng/ml 濃 度 的 Interleukin-6 ，在處理 24 小時後，使用 MTT assay 分析各組的細胞 存活率。在 Figure.6b 中可觀察到，在沒處理 EGCG 的組別裡，可以 明顯看見IL-6 有刺激細胞增生的效果；而在有處理 EGCG 的組別中，
EGCG 仍然可以抑制頭頸部癌細胞的生長。
AG490 是公認抑制 STAT3 磷酸化的化合物 76；先前的研究指出 Curcumin 也會抑制 interleukin-6 所誘導之 STAT3 磷酸化 77；而 Apigenin 也是目前熱門的有抗癌活性的多酚類成分。所以，更近一步 的，我們將EGCG 與 Apigenin、AG490、Curcumin 一起比較抑制 IL-6 所誘導的細胞增生現象之效果。SAS、Cal-27 細胞待貼盤後，先以無 FBS 的培養液培養 15 個小時，再分別處理 20 μM EGCG、20 μM Curcumin、40 μM Apigenin、40 μM AG490，各組並同時加入 10 ng/ml 濃度的Interleukin-6 ，在處理 24 小時後，以 MTT assay 分析各組細 胞的存活率。Figure.6c，在與各組比較之下，可以發現 EGCG 抑制 IL-6 所誘導的細胞增生之效果是最有效的。
第四章 討論
許多研究已證實天然植物中的多酚類化合物有抑制癌細胞生長 或產生細胞毒性的作用。我們從植物中萃取出具有抗癌活性的天然化 合物來比較其抑制頭頸部癌症細胞的活性。以下簡單的介紹這些天然 物的背景：
TF1 、 TF2 、 TF3 、 5GG ： TF1 是 Theaflavin 的 簡 稱 、 TF2 是 Theaflavin-3-gallate的簡稱、TF3是Theaflavin-3,3’-digallate的簡稱，這 三個化合物們是從紅茶中萃取出的多酚類化合物；5GG則是有五個 Galloy機團的化合物，其化學名為Penta-O-galloyl-β-D-glucose。其中，
TF3與5GG已被證實可藉由抑制前列腺素活化前列腺素受器的功能，
以達到抑制前列腺癌的效果78。
Emodin(大黃素)是由中藥植物裡的大黃萃取出的天然化合物。
在中醫的使用上，主要用於瀉下、治療實熱便秘、食積停滯、腹痛、
急性闌尾炎、急性傳染性肝炎、血瘀經閉、牙痛、吐血、急性結膜炎、
水腫、淋濁等。外用可治療燒燙傷、化膿性皮膚病、癰腫瘡瘍等病症，
【內經、傷寒論、金匱要略】。現今，有許多研究發現Emodin 在前列 腺癌79、胃癌80上有誘導細胞凋亡的活性。
Apigenin(芹菜素)常見於春黃菊（Camomile）、柑橘類的植物中，
蘋果、西洋芹（parsley）、羅勒（basil）、龍蒿（tarragon）、胡荽葉 用。目前，在抗癌活性的研究上，已發現Rutin 藉由活化 macrophages 來抑制NO 的產生，進而抑制 TNF-α 的產生84,85。
（Cnidium monnieri (L.) Cuss）的果實中。在中醫的使用上，用於治
Cal-27、Ca9-22 存活分析中， EGCG 對三株頭頸部癌細胞皆具最有 效的抑制作用，也讓我們發現 EGCG 廣效的明顯抑制頭頸部癌細胞
期69,92,93、誘導癌細胞的凋亡 67,71-73等。在 Figure.2 中 Flow cytometry
細胞週期分析；與Figure.3a、Figure.3b 中，使用西方點墨法檢查停滯 G1 期之相關蛋白(p21、p53、p73)、細胞凋亡相關的 Caspase 3、Caspase 9、PARP 的表現量，證實 EGCG 抑制頭頸部癌細胞生長，是藉由誘 化表現量也逐漸下降（Figure.4c），而處理 EGCG 後，STAT3 也明顯 的移動至細胞核外（Figure.4d）。此外，由西方點墨法實驗發現STAT3 路徑下游蛋白表現量也下降（Figure.5）。從 Figure.4 到 Figure.5 的結 果，說明 EGCG 確實抑制了 STAT3 訊息的傳遞，其主要作用點，是
細胞內 STAT3 磷酸化蛋白的表現量，發現 EGCG 的處理並不會展現 抑制 HSC3 細胞中 STAT3 磷酸化（Figure.7）。此結果証實 EGCG 抑 制頭頸部癌細胞增生的效果，的確是因為抑制了 STAT3 路徑的關係 而達成的。
最近的研究報告指出 interleukin-6 會藉由刺激 STAT3 Tyr705 位 置的磷酸化而促進腫瘤細胞的存活與生長28。另有研究指出頭頸部癌 細胞株會自體分泌(autocrine) 或旁分泌 (paracrine) IL-6 來刺激自身 的 STAT3 活化 11。為了進ㄧ步測試 EGCG 抑制 STAT3 路徑與 interleukin-6 的存在是否相關聯（Figure.6a），以MTT assay（Figure.6b）
測試 EGCG 抑制細胞增生的效果。結果證實，在 EGCG 處理下，可 以抑制interleukin-6 促進頭頸部癌細胞的增生。
此外，研究報告中指出AG490 是抑制 STAT3 磷酸化的化合物76； Curcumin 是也有抑制 interleukin-6 所誘導 STAT3 磷酸化之活性 77； Apigenin 是目前抗癌活性的多酚類成分，在許多研究中常與 EGCG
一起比較抗癌活性。進一步，我們將 EGCG 與 Apigenin、AG490、
Curcumin 一起用於比較抑制 interleukin-6 所誘導的細胞增生現象。觀 察到EGCG 在 interleukin-6 所誘導的細胞增生，是最有抑制效果的化 合物（Figure.6c）。
Figure.1 與 Figure.6c 的結果指出，EGCG 除了在抑制頭頸部癌細
胞增生是最好的化合物之外，對於interleukin-6 在頭頸部癌細胞上誘 取下的口腔癌細胞，在primary culture 後，外加 interleukin-6 可發現 促進頭頸部癌細胞生長之現象33；且臨床上，也有許多例子證實頭頸 部癌病患 interleukin-6 的血中濃度的高低與其治療的難易度 32、癌細 胞轉移的機率30,31也有直接的關係；再加上本研究中，我們對於EGCG 可以抑制interleukin-6 在頭頸部癌細胞上的作用之發現，間接的說明 EGCG 在臨床上用於治療頭頸部癌病患，可能有好的預期與潛力。
已有研究指出了 EGCG 在癌細胞上的接受器（67-kDa laminin receptor）94； 在 多 發 性 骨 髓 瘤 細 胞 中 ，EGCG 也是因為 laminin receptor，而有選擇性的抑制癌細胞的生長以及誘導凋亡，卻對正常 細胞的生長卻沒有任何影響60。而在頭頸部癌細胞的研究裡，也有人 發現 laminin 的表現量與頭頸部癌細胞的惡性度成正比 95。這些證據 意味著， EGCG 對於治療頭頸部癌症，或許也如同多發性骨髓瘤細
胞，是有特異性（有分別性）的抑制癌細胞的生長。
而未來研究計畫的部份：在EGCG 抑制 STAT3 訊息傳遞上，可 追尋路徑上游Jak/Tyk2 與 EGCG 的關係，以更確定 EGCG 抑制 STAT3 訊息傳遞的作用點；除了有 HSC3 細胞株的反證外，也可以用轉殖 (transfect)的技術，抹除頭頸部癌細胞 STAT3 的表現，更進一步的探 討EGCG 和 STAT3 的作用關係；對於，處理 EGCG 無效的 HSC3 細 胞株，也許是因為HSC3 與實驗中其他的頭頸部癌細胞株比起來，是 比較末期、惡性度比較高的細胞株，其細胞中許多機制也早已突變、
無功能96,97。所以無法單單只用EGCG 一個化合物來抑制，或許在治
療這種惡性度比較高的頭頸部癌細胞上，可往複合藥物療法的方向考 慮98。
第五章 參考文獻
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