摘要
磷是植物生長與發育所必須的大量元素，當植物面對養分不均衡時，會藉由 調 控 基 因 表 現 及 改 變 其 內 部 訊 號 傳 遞 來 面 對 逆 境 。 本 試 驗 為 了 瞭 解 蝴 蝶 蘭
Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’於缺磷逆境下的基因表現，分別給予植株不同濃度
的磷肥(0、0.16、1.61 mM)的肥料處理 8 週及 12 週，並自先前微矩陣分析的結果 中挑選 37 個蝴蝶蘭於缺磷下明顯表現改變的基因，利用反轉錄聚合酶連鎖反應加 以驗證。大部分葉片中的上調基因可以被驗證，其中以 PATC128122 於缺磷下增加 表現量的現象最明顯，但葉片中下調基因無法被確認；根部中的上調基因與下調 基 因 亦 無 法 被 驗 證 ， 基 因 於 缺 磷 植 株 下 的 表 現 量 與 對 照 組 無 差 異 。 其 中 ， PATC128122 蛋白質上具 RING 功能區塊，對於缺磷具專一性反應，不受缺氮、缺 鉀所誘導，並顯著於缺磷 12 週後在蝴蝶蘭的葉片和根部內提高表現。原位雜交結 果顯示 PATC128122 表現位置為根部的皮層細胞、葉片主脈的韌皮部。為了瞭解 PATC128122 的功能，利用含兩倍花椰菜嵌紋病毒 35S 啟動子的載體大量表現 PATC128122 於阿拉伯芥內，發現 35S::PATC128122 轉殖株栽種於不同磷濃度(250、
50、10 µM Pi)的條件下，其轉殖株的鮮重、無機磷濃度與外觀皆與野生型植株沒 有差異。
前言
蝴蝶蘭為附生性植物，對於養分缺乏具有極高的耐受性，可能與其光合作用 型態為 CAM 型，植株生長緩慢；或在器官的構造上具有一些特化的組織如根被，
幫助其快速吸收養分、避免流失養分；或是因為具有肥厚的根與葉片可貯存養分
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有關(Susilo and Chang, 2014; Zotz and Hietz, 2001; Zotz and Winkler, 2013)。另一方 面，蝴蝶蘭也可能在其本身內部的生理生化、分子層面的調控上，包含對於養分 的吸收、運移、貯存、養分分配上具有特殊的機制，且別於一般模式物種如阿拉 伯芥、水稻等。
目前蘭花的基因功能研究較少，可能與其非主流模式作物、生命週期長、基 因轉殖系統相對困難或基因體庫資料尚不健全有關，近幾年國內已陸續建構蘭花 基因表達資料庫，如 Orchidstra 或 OrchidBase 2.0 (Su et al., 2011; Tsai et al., 2013)。
相關研究以花朵形態、顏色、香味等居多，但幾乎無蝴蝶蘭與養分獲取與運用相 關的分子研究。游(2012)以缺乏不同濃度的氮、磷、鉀處理大白花蝴蝶蘭 Phal. Sogo Yukidian ‘V3’，儘管缺肥處理 8 週，蝴蝶蘭於外觀上不會顯現任何養分不足徵狀，
但以微矩陣(microarray)生物晶片技術可偵測到大量的基因產生變化，但微矩陣的 資料結果很龐大，需再進一步以其他技術進行驗證。
磷為植物生長與繁衍所必需的重要元素，且蝴蝶蘭於生殖生長期面臨缺磷逆 境可能導致抽梗率降低(游，2012; Yoneda et al., 1997)。植物在土壤中主要吸收無機 磷，但磷在土壤中常被固定而導致植物獲取不易，因此一般栽培上需要施加磷肥 補充，但磷肥開採自有限的磷礦石，因此，瞭解植物在缺磷逆境下的分子調控機 制將可提供未來永續農業發展之重要資訊。
因此本試驗主要從游(2012)微矩陣資料中，挑選數個缺磷逆境下的表現基因做 進一步地驗證，除了驗證微矩陣資料的正確性，並期望從中挑選出蝴蝶蘭特別於 缺磷逆境下表現的基因作功能性的探討。
材料方法 試驗材料
1. 蝴蝶蘭
蝴蝶蘭表現基因驗證的試驗中，使用的植物材料為《第三章 蝴蝶蘭於養分逆
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境下的生長反應》缺乏氮、磷、鉀處理 8、12 週之蝴蝶蘭 Phalaenopsis Sogo Yukidian
‘V3’，其中試驗總共重複 4 次，分別於 101 年 10 月 7 日(Experiment 1, Expt. 1 )、
29 日(Expt. 2)及 11 月 5 日(Expt. 3)、9 日(Expt. 4)進行換盆，每個試驗重複下各處 理 3 棵植株，主要取其中正常施肥(+NPK)、低磷(0.1P)、缺磷(0P)處理下的植物，
進行無機磷濃度測定與表現基因驗證。植物栽培於中央研究院基因體中心日夜溫 30/25 oC、自然光照的人工氣候室。
原位雜交分析兩基因在蝴蝶蘭中的表現位置，使用的植物材料與《第四章 蝴 蝶蘭於缺磷下的形態解剖觀察》為同一批植物。植物栽培於臺灣大學日夜溫 30/25
oC、自然光照的人工氣候室。
2. 阿拉伯芥
本試驗使用之阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)為 Columbia-0 之野生株和 T2代之 後的 35S::PATC128122 轉殖株。植物栽培於室溫維持 22 oC、光週設定為 16 小時 日照的室內生長室。
試驗設計
1. 蝴蝶蘭基因表現驗證
蝴蝶蘭 Phal. Sogo Yukidian ‘V3’於正常施肥(+NPK)、低磷(0.1P)、缺磷(0P)處 理下 8 週、12 週，肥料處理分別施以 1.61、0.16、0 mM 之不同濃度的磷肥，各肥 料處理之詳細配方參照表 3.1，植株於取樣時間點進行生理資料調查後，便以酒精 消毒後的剪刀剪取蝴蝶蘭葉片及根部，葉片固定取樣由上往下數第一片成熟葉，
根部為選取由根尖往上 5 cm 內的組織。將組織剪成小塊狀後，以錫箔紙包裹，迅 速置於液態氮中冷卻固定，保存於-80 oC 低溫恆溫櫃中，而之後取每個試驗重複下 同一處理下的 3 棵植株，將 3 棵植物的組織(葉片或根部)混合一起，進行無機磷 (inorganic phosphate, Pi)濃度測定及 RNA 萃取。自微矩陣結果(游，2012)中挑選蝴 蝶蘭 Phal. Sogo Yukidian ‘V3’葉片與根部於缺磷下反應(Fold change 倍數大於 3)的 基因，以反轉錄聚合酶連鎖反應方法進行基因表現量驗證。
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2. 以原位雜交分析 PATC128122、PATC144588 在蝴蝶蘭中的表現位置
分別以正常施肥(+NPK)及缺磷(0P)條件給予蝴蝶蘭 Phal. Sogo Yukidian ‘V3’
共 21 週的處理，接著將蝴蝶蘭植株送至中央研究院南部生物技術中心，取樣部位 為蝴蝶蘭植株由上往下數第一片成熟葉中、位置在葉片長度一半的中肋(midtib)，
及盆內貼附於水苔的根(長度< 15 cm)，取樣位置為自根尖往上測量 0.5 cm、3 cm 處，接著，將組織包埋於石蠟中，另外，以 pGEM-T 載體構築 PATC128122、
PATC144588 的探針，後續組織切片及原位雜交之操作為委託南部中央研究院辜瑞 雪老師實驗室協助。
3. 過量表現 PATC128122 於阿拉伯芥在缺磷下的反應
構築基因 PATC128122 於 pMDC32 表現載體中，pMDC 載體具 2 倍的花椰菜 嵌紋病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S 啟動子，將過量表現質體以農桿菌轉 殖到阿拉伯芥 Arabidopsis thaliana Columbia-0，接著，植物種植於中央研究院的轉 殖溫室，收取第一代 T1轉殖株的種子，以 70%酒精、0.05% Triton X-100 震盪消毒 15 分鐘後，再以 95%酒精消毒 10 分鐘，播種於含有 Hygromycin B (20 µg·ml-1) (Sigma)的培養基中，培養基成分與濃度為修改自 Hogland’s 養液配方(Millner and Kitt, 1992)，以抗生素篩選第二代 T2植株，共種植 20 個 35S::PATC128122 轉殖品 系(Transgenetic lines)，收取種子並保存於 16 oC 乾燥箱中。
挑選 9 個對抗生素抗性(resistence rate)約 75%之 T2轉殖品系(transgenetic lines 1-5, 7, 8, 10, 16)，種子消毒後，播種於含有 Hygromycin B (20 µg·ml-1)、0.8% agar 的培養基中，先以抗生素篩選具抗性之植株，之後轉移到含不同磷濃度(250, 50 or 10 µM KH2PO4)、1.2% agar 的培養基，pH 值約 5.7，培養皿為直立式栽培，另外，
種植阿拉伯芥 Columbia-0 之野生株(wild type)於不含抗生素之培養基，之後同樣轉 移至 3 種磷濃度條件下。此試驗重複 2 次，第一次阿拉伯芥經過抗生素篩選 7 天、
不同磷濃度處理 8 天(15-day-old)，第二次阿拉伯芥經過抗生素篩選 5 天、不同磷 濃度處理 6 天(11-day-old)，每處理共 5 盤培養皿，每培養皿共 10 棵 35S::PATC128122
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轉殖株，總共 9 個轉殖品系。試驗結束後收取野生株與轉殖株之植體，進行表現 型(phynotype)觀察拍照、Pi 濃度與 RNA、蛋白質層次之基因表現測量。
除了上述中生長天數較少的阿拉伯芥(組織培養條件下)試驗，另外，挑選 5 個 T2轉殖品系(transgenetic lines 1, 2, 3, 5, 7)與野生株，播種於含有 Hygromycin B (20 µg·ml-1)、0.8% agar 的培養基中 6 天(野生株無抗生素篩選)，再轉移至直立式含 250 µM KH2PO4、1.2% agar 的培養基 3 天，接著移至含 250 µM KH2PO4的水耕培養 (hydroponic culture)條件下 4 天，最後分別給予不同磷濃度(250, 50 or 10 µM KH2PO4)之養液 7 天(20-day-old)，平均每 2-3 天更換一次養液，試驗結束後，收取 樣本植體進行表現型(phynotype)觀察拍照與 Pi 濃度測量。
無機磷濃度分析(Inorganic phosphate assay)
分析植體內無機磷的方法為參考前人研究(Ames, 1966; Chiou et al., 2006)。植 物組織秤重後，每鮮重 1 mg 的組織加入 10 µL 的 1%冰醋酸(Glacical acetic acid, EMSURE, Darmstadt, Germany)，以高速組織均質機(2010 Geno/Grinder, SPEX SamplePrep, NJ, USA)將樣本震盪打碎，混合均勻後置於 42 oC 烘箱中培養 30 分鐘，
之 後 ， 樣 本 在 室 溫 下 以 高 速 離 心 機 (Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland)10000 rpm 轉速離心十分鐘，取 10 µL 的上清液置於 96 孔盤，並加入 50 µ L 的 1%冰醋酸及 140 µL 的磷萃取液(0.35% NH4MoO4、0.86 N H2SO4、1.4%
L-ascorbic acid) (Sigma)，以震盪混合器(Eppendorf Mixmate, Hamburg, Deutschland) 充分混合後再置於 42 oC 烘箱中培養 30 分鐘；另外，以 KH2PO4配置含 0、5、10、
25、50 nmole Pi 的標準品，樣本與標準品以盤式全波長光譜儀(Eon™ Microplate Spectrophotometer, BioTek, VT, USA)測定 820 nm 波長下的吸光值，最後以標準品 繪製標準曲線，再計算樣本的 Pi 濃度與含量。
蝴蝶蘭葉片與根部的樣本為 3 棵植株的組織混合在一起，秤取鮮重約 1 g 的組 織後研磨，因此每處理下的重複數為 1；阿拉伯芥地上部與地下部的樣本為每個培 養皿中 10 棵植株混合在一起，每處理下共 3 個培養皿；水耕培養下的阿拉伯芥則
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每處理下 5 重複，每重複 1 棵。
總核醣核酸萃取(Total RNA isolation)
1. 蝴蝶蘭
蝴蝶蘭 RNA 萃取方法為參考前人研究(Su et al., 2011; 2013b)，利用 CTAB (hexadecyltimethylammonium bromide)方法萃取蝴蝶蘭葉片與根部 RNA。至-80 oC 低溫恆溫櫃中取出蝴蝶蘭葉片與根尖樣本並快速秤取 1 g 的組織(3 棵植物的組織 混合在一起)，使用預冷的研缽與杵於液態氮中將組織研磨至細緻粉末，以預冷藥 杓將粉末括入 50 mL 全新離心管 (Labcon North America,CA, USA)中，加入 10 ml 預熱於 65 oC 的萃取緩衝液中，緩衝液含 2% (w/v) CTAB、2% 2-mercaptoethanol、
20 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、100 mM Tris (pH 7.5)、2 M sodium chloride (NaCl) 及 1% (w/v) PVP 40 (polyvinylpyrrolidone 40)中，接著，快速震盪混 合均勻後，置於 65 oC 中 15 分鐘，每 5 分鐘搖晃一次。
在 室 溫 下 以 冷 凍 高 速 離 心 機 (Centrifuge 5810 R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland)離心 3000 ×g 十分鐘，取上清液到另一個離心管中，加入等體積的 chloroform : isoamyl alcohol = 24:1 (v/v)，搖晃均勻後，室溫下離心 8000 ×g 十五分 鐘，再重複上一個步驟，取上清液並加入等體積的 chloroform : isoamyl alcohol = 24:1 (v/v)，於室溫下離心 10 分鐘，接著，小心吸取上清液到新的離心管中，加入 0.33 倍體積的 8 M lithium chloride (LiCl)，將樣品置於 -20 oC 的冷凍庫中隔夜，進 行 total RNA 的沉澱。
隔日於 4 oC 下離心 8000 ×g 30 分鐘，去除上清液，再加入預冷的 75% ethanol (Merk)，輕輕潤洗沉澱物，於 4 oC 下以 8000 ×g 離心 10 分鐘，倒掉乙醇，再以預 冷的 100% ethanol (Merk)潤洗一次沉澱物，同樣於 4 oC 下離心 10 分鐘，最後，盡 量去除所有液體，將離心管倒置於試管架上自然風乾約 30 分鐘，以適量的 RNase-free ddH2O 回溶 RNA，放置於-80 oC 下保存。使用超微量分光光度計 (NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific INC., Wilmington, DE,
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USA)，設定波長為 260 nm (OD260nm)，進行 RNA 濃度定量，並比較 OD260nm / OD280nm
之比值，當數值介於 1.8-2.0 之間，表示樣本純度足以進行後續試驗。
2. 阿拉伯芥
將阿拉伯芥地上部(平均鮮重為 25 mg)於液態氮下快速震盪打碎後，加入 1 mL
將阿拉伯芥地上部(平均鮮重為 25 mg)於液態氮下快速震盪打碎後，加入 1 mL