第三章 結果
第一節 親子分離實驗對新生老鼠的腎上腺結構並無影響
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第三章 結果
第一節 親子分離實驗對新生老鼠的腎上腺結構並無影響
欲觀察親子分離實驗是否會對新生老鼠的腎上腺結構造成改變，首 先將經過親子分離實驗的新生老鼠，分別在出生後第十四天與出生後 第二十一天做犧牲，然而因為新生老鼠在出生後十四天時過於幼小無 法進行灌流，所以犧牲後直接取出腎上腺，而出生後二十一天的新生 老鼠則需進行灌流。取出腎上腺進行切片染色後發現，在老鼠出生後 十四天時，撫摸組的腎上腺髓質結構與隔離組和控制組相比(圖 1)並 無任何太大差異，而相同的狀況也出現在老鼠出生後第二十一天時 (圖 2) ，顯示出親子分離實驗並不會對老鼠的腎上腺髓質的結構造成 改變。
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圖 1 P14
(A)控制組 TH (B) PNMT
(C)撫摸組 TH (D) PNMT
(E)隔離組 TH (F) PNMT
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圖 2 P21
(A)控制組 TH (B) PNMT
(C)撫摸組 TH (D) PNMT
(E)隔離組 TH (F) PNMT
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圖 1、2 將經過親子分離實驗的新生老鼠之腎上腺切片染色(染 TH 與 PNMT)。在老鼠出生後十四天(圖 1) ，發現撫摸組(圖 1C、1D)其腎 上腺的結構與控制組(圖 1A、1B)和隔離組(圖 1E、1F)相比，並無明 顯差異，且腎上腺髓質結構也無明顯改變;而在老鼠出生後二十一天 (圖 2)的觀察結果也與十四天相同，撫摸組(圖 2C、2D)與控制組(圖 2A、2B)和隔離組(圖 2E、2F)的腎上腺結構沒有太大的差別，腎上腺 髓質結構也無明顯改變，實驗結果得知親子分離實驗並不會對新生老 鼠之腎上腺髓質的結構造成影響。
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第二節 親子分離實驗對新生老鼠其腎上腺可製造腎上腺素之 chromaffin cells 的影響
壓力會刺激動物釋放腎上腺素與正腎上腺素，而釋放這兩種物質的 細胞主要為腎上腺髓質之 chromaffin cells，為觀察壓力對新生老鼠 腎上腺髓質發育的影響，因此本論文利用親子分離實驗來對新生兒老 鼠造成壓力，進而探討是否會對製造腎上腺素的 chromaffin cells 造 成影響。首先於新生老鼠犧牲時測量其體重，發現到在老鼠出生後第 十四天(P14)(圖 3A)、出生後第二十一天(P21) (圖 3B)以及出生後第 六十天(P60)時三組間並無明顯差異(圖 3C)，顯示親子分離實驗並不 會對新生老鼠的體重造成影響。而後將取出之新生老鼠的腎上腺於解 剖顯微鏡下剪取出腎上腺髓質後，經過酵素作用分離出 chromaffin cells，進行初代細胞培養，24 小時後隨即進行免疫螢光染色(染 Tyrosine Hydroxylase 與 PNMT，phenylethanolamine N-methyl transferase)，免疫螢光染色染出 chromaffin cells，後於顯微鏡下觀 察 TH (Tyrosine Hydroxylase)與 PNMT 的螢光呈色(圖 4); PNMT 為 將正腎上腺素轉為腎上腺素的酵素; 而 TH (Tyrosine Hydroxylase) 則是將酪胺酸(tyrosine)轉換成正腎上腺素時所需的前驅酵素;故可用 PNMT 來當作有能力製造腎上腺素的細胞數量指標，而腎上腺素和正 腎上腺素的合成均需有 TH 的存在，故可以用來當作所有能製造腎上
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腺素與正腎上腺素細胞的指標。將觀察到的 chromaffin cells 拍照後 (每個培養皿皆拍攝 200 顆)，利用分析軟體 Image J 檢測出每顆嗜鉻 細胞的面積與平均強度後，算出每顆 chromaffin cell 中 TH 與 PNMT 的強度(intensity) ，再利用 SPSS 統計軟體進行 Anova 分析後，發 現到在老鼠出生後第十四天時，將新生老鼠放置在手上操弄的撫摸組，
其每一 chromaffin cell 之 PNMT 與 TH 的比例明顯比分離一小時/天 (隔離組)與控制組來的高 (圖 5A)，藉此可推論在老鼠出生後第十四 天時撫摸組的腎上腺素比例可能高於隔離組與控制組，因其合成腎上 腺素的酵素(PNMT)增加，也可揭示當放置在手中時，對新生兒老鼠 造成較大的壓力;但在老鼠出生後二十一天(圖 5B)時撫摸組則與控制 組和隔離組沒有任何差異。造成新生兒老鼠在出生後十四天有差異而 出生後二十一天沒有差異的原因，推論可能原因為親子分離實驗只進 行到新生老鼠出生後第十四天，而在老鼠出生後十四天到二十一天間 則無任何操弄，導致新生老鼠在 P14~P21 期間可能受到母鼠的照顧 因而有了補償的結果，最後造成新生兒老鼠在出生後二十一天(P21) 時，實驗組(隔離組和撫摸組)與控制組間沒有顯著差異。而經過免疫 螢光染色後，觀察有染到 PNMT 的 chromaffin cells 細胞數量，發現 親子分離的操弄，並不會改變新生老鼠其腎上腺中可製造腎上腺素的 細胞數量(圖 6)，即實驗組(隔離組和撫摸組)與控制組間沒有顯著差
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異。
本論文將研究重點放在出生後十四天與出生後二十一天的新生老 鼠，觀察其腎上腺中腎上腺素與正腎上腺素的含量，在 SHRP 期間 (P14)與過了 SHRP(P21)中發現了新生老鼠對壓力的反應產生差異 (圖 5、8、9)，讓人不免好奇在 P21 中所觀察到的結果是否會與成鼠 的結果相符合，因為過了 SHRP 期間後，老鼠對壓力的反應將會大 幅增加，欲探討這個問題，本論文進行三個月成鼠的實驗，即用相同 親子分離的方式，將新生老鼠分成控制組、隔離組(一小時/天)與撫摸 組(十分鐘/天)，在 P2~P14 進行親子分離並於三個月時犧牲進行分析，
發現在 P90 時三組間 PNMT 與 TH 的比例並無顯著差異(圖 5D)。
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(C)
圖 3、親子分離實驗後測量新生老鼠的體重。新生兒老鼠經過親子分 離實驗後犧牲時體重，實驗將新生兒老鼠分為三小組(控制組、撫摸 組與隔離組)，(A)老鼠出生後十四天(P14)，(B)老鼠出生後二十一天 (P21)，(C)老鼠出生後六十天，P14、 P21 與 P60 在三組間皆無明 顯差異。
0 100 200 300 400 500 600
一胎三組iso day60 一胎三組han day60 一胎三組con day60
老鼠體重(g)
P60
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(A) (B)
(C) (D)
圖 4、chromaffin cells 在可見光及螢光下的細胞型態。在可見光下的 細胞型態(圖 A)，以及經過螢光免疫染色後，觀察染到 TH(圖 B)或 PNMT(圖 C)的 chromaffin cells，圖 D 可以看到有表現 PNMT 與沒 表現 PNMT 的 chromaffin cells。
‧
0 1~10 10~20 20~30 30~40 40~50 50~60 60~70 70~80 80~90 90~100
cell number
PNMT/TH(%)
0 1~10 10~20 20~30 30~40 40~50 50~60 60~70 70~80 80~90 90~100
cell number
PNMT/TH(%)
isolate handle control
PNM T in te n si ty (a re a*me an *1 00 0)
P14
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(D)
圖 5、經過親子分離實驗後分析新生老鼠 chromaffin cells 中 PNMT 與 TH 在各組中的相對含量。分析結果發現老鼠在出生後十四天時，
撫摸組 (放置在手中十分鐘/天)的 PNMT 與 TH 的比例高於隔離組(分 離一小時/天)與控制組(圖 A)，分析 chromaffin cells 當中 PNMT 螢光 強度發現，撫摸組的 PNMT 強度確實比控制組與隔離組高(p<0.05) (圖 C);而在老鼠出生後二十一天與九十天時，三組間則無明顯差異(圖 B，D)。
0 20 40 60 80 100
0 1~10 10~20 20~30 30~40 40~50 50~60 60~70 70~80 80~90 90~100
cell number
PNMT/TH(%)
P90
isolate control handle
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PNMT 的 chromaffin cells 細胞數量，即代表製造腎上腺素的chromaffin cells 細胞數量，在 P14(圖 A )與 P21(圖 B)時，三組間皆 無明顯差異，顯示親子分離操弄不會影響 chromaffin cells 中有表現 PNMT 與不表現 PNMT 間的細胞數量比例。
isolate handle control
PNMT positive cell numbers
P14
isolate handle control
PNMT positive cell numbers
P21
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第三節 親子分離實驗影響新生老鼠之腎上腺素與正腎上腺素的含量 雖然透過免疫螢光染色得知撫摸組的新生老鼠其 PNMT 在
chromaffin cells 中的表現量是較控制組高的，但不清楚是否真能讓 chromaffin cells 製造較多的腎上腺素，欲探討早期的親子分離是否 會造成腎上腺素與正腎上腺素含量的改變，首先同樣將老鼠分成三小 組，隔離組(isolate;與母鼠分離一小時/一天，P2~P14)、撫摸組(handle;
放置手上撫摸十分鐘/一天，P2~P14)與控制組(control) ，在老鼠出 生後十四天與二十一天進行犧牲，取出腎上腺後，將裝有腎上腺的離 心管加入 200ml 的 0.1N 過氯酸研磨後，抽取出上清液以 HPLC 檢測，
可計算出所製造的腎上腺素與正腎上腺素的含量(圖 7) 。而經過親子 分離實驗的新生老鼠在 P14 的情況下發現，隔離組與撫摸組中的新 生老鼠，比起控制組，其腎上腺含有較多的腎上腺素(圖 8A)(p＜0.05)，
但三組間在正腎上腺素的釋放上沒有甚麼差異(圖 8B)，而在撫摸組中 的實驗結果符合之前本論文的實驗:即在新生老鼠出生後十四天，該 組 PNMT 含量相對於 TH 含量的比例高於隔離組與控制組，但為何 隔離組在 PNMT 含量相對於 TH 含量的比例與控制組相同的情況下 會含有比控制組更多的腎上腺素，推測可能原因為經過親子分離實驗 的老鼠(隔離組與撫摸組)比起沒有經過親子分離實驗的老鼠(控制組) 較容易感到緊張，故導致隔離組的腎上腺素製造量大於控制組。此外，
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雖然隔離組與撫摸組製造腎上腺素的含量沒有差異，但在本論文之前 的實驗發現到:經過親子分離實驗後，撫摸組的新生老鼠，其 PNMT 在 chromaffin cells 染到的強度高於同一胎中的其他兩組(分別為隔離 組與控制組)(圖 5A)，而造成撫摸組腎上腺組織中的腎上腺素含量高 於其他兩組，可能的原因有兩個，一為腎上腺髓質中可製造腎上腺素 的 chromaffin cells 數量增加，一為 PNMT(合成腎上腺素的酵素)的 效率提高。而第一個可能的原因，本論文在第二節已透過實驗證明(圖 6)，製造腎上腺素的 chromaffin cells 數量不會因為親子分離操弄而 有所改變，而分析能製造腎上腺素的 chromaffin cells 在所有
chromaffin cells(200 顆)中所佔的比率(圖 17)，發現隔離組與其他兩 組相比，似乎擁有較高的能製造腎上腺素 chromaffin cells 的比率，
但經 Anova 統計分析後，發現隔離組與控制組(p=0.178)及撫摸組 (p=0.23)間沒有顯著差異。顯示隔離組能夠製造與撫摸組無差異的腎 上腺素含量，可能為 PNMT 的效率提高所造成的結果。而在老鼠出 生後二十一天的情況下發現，不管在隔離組、撫摸組還是控制組的新 生老鼠，其腎上腺素(圖 9A)的含量沒有差異，與本論文之前對於一胎 三組 P21 的實驗相符合，即 PNMT 與 TH 的比例在三組間沒有差異;
而在正腎上腺素(圖 9B)的釋放量上三組間仍沒有差異。造成 P14 與 P21 的結果不同的原因可能為，因新生老鼠的 SHRP 時期為 P4~P14，
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故新生老鼠超過 P14 以後，體內對壓力的反應可以正常的回應，因 而在 P14 與 P21 出現不同結果，而 P21 三組間無差異，顯示三組間 可能對壓力有著相同的反應。為探討幼年的親子分離實驗是否會影響 老鼠成鼠後的行為，本論文將經過親子分離的老鼠於 P60 進行 EPM 行為測試，但並沒有發現顯著的差異(圖 10A)，且三組間腎上腺素與 正腎上腺素也無顯著差異(圖 10B、C)，顯示親子分離實驗並不會對 老鼠其腎上腺發育有所影響。
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圖 7、經過親子分離實驗後檢測新生老鼠腎上腺中腎上腺素與正腎上 腺素的含量。以 HPLC 檢測的結果可發現正腎上腺素約在六分多鐘 時出現，而腎上腺素則在十分鐘時顯現。
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iso han con
EP( μ g/m l)
iso han con
NE( μ g/m l)
P14 NE含量
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iso han con
EP( μ g/m l)
iso han con
NE( μ g/ml )
P21 NE含量
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百分比6~10min open arms 百分比6~10min close arms
百分比
iso han con
EP( μ g/m l)
iso han con
NE( μ g/m l)
P60 NE含量
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圖 10、經過親子分離實驗後，待老鼠成長至 P60 後進行 EPM，發現 三組間並無明顯差異(圖 A)，於 open arms 中撫摸組與控制組
圖 10、經過親子分離實驗後，待老鼠成長至 P60 後進行 EPM，發現 三組間並無明顯差異(圖 A)，於 open arms 中撫摸組與控制組