國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
59
第四章 討論
因新生老鼠隨著天數的增加，活動力也會隨著上升，且新生老 鼠對壓力的反應也較敏感，而欲進行的操弄時間為老鼠出生後十四天 至二十一天，此時正好過了 stress hyporesponsive period (SHRP) (P4~P14)，因此新生老鼠對壓力的反應勢必增強，將會對親子分離 實驗產生不確定的影響。以 HPLC 檢測新生兒老鼠其腎上腺組織中 腎上腺素含量的結果也顯示，在老鼠出生後十四天時，撫摸組中的新 生老鼠其腎上腺比控制組製造更多的腎上腺素(圖 8A)，但隔離組與撫 摸組間製造腎上腺素的含量並無顯著差異，而在 PNMT 含量相對於 TH 含量的比例上，隔離組低於撫摸組，推論可能原因為經過親子分 離後，撫摸組中新生老鼠受到持續觸碰的時間比起隔離組要多出很多，
而持續性的人為觸碰可能對新生老鼠產生較高的壓力刺激，而使新生 老鼠產生較多醣皮質素，因而導致 chromaffin cells 的 PNMT 表現量 增加，雖然撫摸組中雖有較多的 PNMT 表現，但所偵測到的腎上腺 素含量卻是與隔離組相當，推論可能原因為撫摸組中腎上腺素的代謝 量增加亦或是撫摸組中 PNMT 的活性不如隔離組，首先，為了探討 是否為腎上腺素代謝量增加，可利用 HPLC 將腎上腺素經 MAO (monoamine oxidase)與 COMT (catechol-O-methyltransferase)代 謝後的產物(分別為 dihydroxymandelic acid 與 metanephrine)含量
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
60
一併計算，而檢測 PNMT 的活性的方法為將新生老鼠腎上腺研磨後，
加入已知濃度的正腎上腺素後，利用 HPLC 檢測腎上腺素與正腎上 腺素的含量，便可得知隔離組與撫摸組中 PNMT 的活性是否有改變。
而隔離組在 PNMT 含量相對於 TH 含量的比例上與控制組沒有差異，
但卻製造比控制組更多的腎上腺素(p<0.05)，可能原因為隔離組新生 老鼠經過親子分離後對壓力的反應高於控制組，因而使隔離組中 PNMT 的效率增加，而製造比控制組更多的腎上腺素;此外，隔離組 與撫摸組所檢測到的腎上腺素含量沒有差異，但撫摸組卻在 PNMT 含量相對於 TH 含量的比例上高於隔離組(圖 5A)(p<0.05)，而觀察有 染到 PNMT 的 chromaffin cells 在所有 chromaffin cells 中所佔的百 分比(圖 19)，發現雖然隔離組與控制組(p=0.178)及撫摸組(p=0.23) 間沒有顯著差異，但因 error bar 過於大，所以不排除隔離組擁有較 高能製造腎上腺素的 chromaffin cells 比例之可能性，因而導致隔離 組在 PNMT 相對活性低於撫摸組的情況下，能夠製造與撫摸組相當 的腎上腺素。
在第二節結果中也探討到，腎上腺組織中腎上腺素的含量取決於 chromaffin cells 的數量增加或是 PNMT 的效率提高，而本論文已證 實親子分離操弄並不會改變可製造腎上腺素的 chromaffin cells 細胞 數量(圖 6)，且 chromaffin cells 的細胞大小在經過親子分離操弄後三
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
61
組間(隔離組、撫摸組與控制組)並無差異(圖 17)，所以 PNMT 的效率 增加很有可能是造成腎上腺素分泌量上升的原因。另外，以 HPLC 檢測經過親子分離的新生老鼠腎上腺組織，發現只有在老鼠出生後十 四天時出現差異，即撫摸組與隔離組比起控制組製造較多的腎上腺素，
但在正腎上腺素的含量上三組間沒有差異(圖 8B);而在老鼠出生後二 十一天時，腎上腺素與正腎上腺素的含量皆沒有差異(圖 9)，有趣的 是在老鼠出生後十四天時，隔離組與撫摸組的腎上腺素含量明明高於 控制組，且正腎上腺素含量無差異，但在 EP/(EP+NE)的比例上(圖 18)卻始終維持 80％，與控制組相同，而 80％的腎上腺素含量與 20
％的正腎上腺素含量正好符合正常老鼠體內腎上腺素與正腎上腺素 的比例，這個結果也與初代細胞培養的結果相符合，即細胞免疫染色 後有染到 PNMT 的 chromaffin cells 細胞數量約佔所有 chromaffin cells 的八成(圖 19)，顯示親子分離實驗對新生老鼠腎上腺之腎上腺 素與正腎上腺素含量的比例並無影響。而這個結果也間接證實需製造 較多的腎上腺素就必須有相對應含量的正腎上腺素，以維持體內腎上 腺素與正腎上腺素比例的恆定(Zigmond，1989)。此外，透過分析細 胞免疫染色中 chromaffin cells 的 TH 強度，發現可製造腎上腺素的 chromaffin cells (PNMT positive)中其細胞內 TH 的強度大於只能製 造正腎上腺素的 chromaffin cells (PNMT negative) ，顯示在腎上腺
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
62
髓質中可製造腎上腺素的 chromaffin cells 擁有較多的 TH 酵素(圖 20) 。
此外，本論文所做的隔離組與文獻所得到的結果不太一樣，即文獻 中指出隔離組對壓力的反應應當高於控制組(CRH、ACTH 與皮質酮 含量上升)，而皮質酮會促進 PNMT 的表現量上升，理論上在隔離組 中 PNMT 的含量會高於控制組，但在本論文得到的結果卻是隔離組 在 PNMT 的含量上與控制組相同，推論很大的原因為分離的時間不 夠長，文獻中隔離組一天與母鼠分離的時間高達 4~8 小時，而本論 文只分離 1 小時，因而使得隔離組的效果不明顯。
相對於本論文將重點放在新生老鼠腎上腺的發育，觀察其製造腎上 腺素與正腎上腺素的含量，而這些賀爾蒙被釋放後是經由血液運送到 下游的組織中，因而觀察新生老鼠血液中腎上腺素與正腎上腺素的含 量，可進一步有效分析壓力對新生老鼠所造成的影響，此外也可分析 血液中醣皮質素的含量，藉此觀察親子分離所造成的壓力在三組間 (隔離組、控制組與撫摸組)的差異。此外，因在 SHRP 期間新生老鼠 的醣皮質素含量低於非 SHRP 期間的新生老鼠，所以檢測 P14 與 P21 新生老鼠血液中醣皮質素的含量為一值得探討的方向。
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
63
每個腎上腺髓質中的 chromaffin cell 約包含 10000 個 chromaffin
granules，且依照表現 PNMT 與否又分成可釋放腎上腺素的
chromaffin cells(細胞內chromaffin granules 包含腎上腺素或正腎上
腺素，但兩者不同時存在同一 chromaffin granules 中)與只能釋放正 腎上腺素的
chromaffin cells(細胞內chromaffin granules 不含腎上腺素) (Cynthia G Zoski，2007)。當有壓力存在時，交感神經系統便會
透過 splanchnic nerves 刺激腎上腺髓質釋放腎上腺素與正腎上腺素，此時這些 chromaffin granules 便會透過胞吐作用分別釋放腎上腺素
與正腎上腺素
，但真實釋放的含量是多少則須個別討論，但唯一確定 的是壓力存在時，血清中腎上腺素與正腎上腺素的含量確實會增加。此外，chromaffin cells 釋放出腎上腺素與正腎上腺素後，勢必透過 一些路徑來生成一些新的腎上腺素與正腎上腺素，如 ACTH 與交感 神經系統可以藉由增強 TH 與 DBH 的活性來生成新的腎上腺素前驅 物，且 ACTH 能夠透過刺激醣皮質素來增強 PNMT 的表現量，藉此 提高腎上腺素的含量。在文獻中也發現 IMO stresss 兩小時能夠增加 Vesicular monoamine transporters 2(VMAT2) mRNA 的表現量，但 對 VMAT1 則沒有影響(VMAT1 表現在兩種 chromaffin cells 中，而 VMAT2 只表現在只能釋放正腎上腺素的 chromaffin cells 中)，且 VMAT2 的 turnover number 為 VMAT1 的三倍，顯示出在只能釋放正
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
64
腎上腺素的 chromaffin cells 中其正腎上腺素可以更有效率地回到 chromaffin granules 中以利下次的釋放(Andrej，2010)。而正腎上腺 素經胞吐作用釋放至突觸間隙後，居然有約 90%的正腎上腺素可以 被回收回神經末端，加上一些被代謝掉的正腎上腺素，實際上隨著血 液運送至作用目標可能不到 5% 。在壓力存在的情況下，可推測腎 上腺素在體內需求量較正腎上腺素多，且腎上腺素在 chromaffin
granules 中的補充是透過生成新的腎上腺素
，而正腎上腺素則是回收 大於生成。而此一現象在本論文中可以用來解釋為何新生老鼠在受到 壓力的狀況下，正腎上腺素的含量始終維持固定，而腎上腺素的含量 卻能提高。‧
圖 17、親子分離不影響新生老鼠腎上腺髓質中 chromaffin cells 的細 胞大小。以分析軟體 Image J 分析 chromaffin cells，發現經過親子 分離的新生老鼠 P14(圖 A)與 P21(圖 B) ，在隔離組、控制組與撫摸 組三組間 chromaffin cells 的細胞大小皆無明顯差異。
0 0.02 0.04 0.06
isolate handle control
area
chromaffin cells細胞大小
P14
0 0.02 0.04 0.06
isolate handle control
area
chromaffin cells細胞大小
P21
‧
iso han con
EP/(EP+NE)*100 (%)
iso han con
EP/(EP+NE)*100 (%)
一胎三組
P21
‧
圖 19、有染到 PNMT 的 chromaffin cells 在所有 chromaffin cells 中 所佔的百分比。從圖 6 得知有染到 PNMT 的 chromaffin cells 的細胞 數量，計算在所有 chromaffin cells 中所佔的百分比，發現能製造腎 上腺素的 chromaffin cells 約佔所有 chromaffin cells 的八成。
0
isolate handle control
PNM T p os iti ve ch roma ff in cell s/t ot al ch roma ff in cell s % P14
0
isolate handle control
PNM T p os iti ve ch roma ff in cell s/t ot al ch roma ff in cell s %
P21
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
68
(A)
(B)
(C)
‧
isolate handle control
TH intensity (area*mean*1000)
TH(PNMT negative) TH(PNMT positive)
P14
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
N a tio na
l C h engchi U ni ve rs it y
70