從本研究中，我們在 61 例 NB 腫瘤中發現 7 例有發生 ALK 基因突變，搭配臨 床資料進行比對，發現 ALK 突變與惡性神經母細胞瘤：advanced stage、high risk、
poorly differentiation, MYCN amplification 相關(表三)。而且 ALK 基因突變與 NB 病 患預後差(EFS 及 OS 皆低)有統計上顯著差異(圖十二)。 釋，而Sanger’s sequencing 的靈敏度為 20%，可能因此偵測不到。
本研究中利用 Sanger's sequencing 檢查 ALK 的 kinase domain，除了檢視神經 母細胞瘤中常出現的 3 個 ALK 基因突變熱點(F1174、F1245、R1275)，同時也可檢 出是否出現其他 ALK 突變。從結果表二可知：61 例腫瘤中共發現 7 例發生突變 (11.3%)，其中 3 例為 F1174 突變(3/7，42.9%)、3 例為 F1245 突變(3/7，42.9%)，
以及 1 例未曾在神經母細胞瘤被報導過的 A1274 突變(1/7，14.3%)；F1174 及 F1245 佔所有突變的 85.7%。與 2014 年 Bresler 等人發表於 Cancer Cell 的報告56(1,956 例 神經母細胞瘤中發生 ALK 突變比例為 8%；而 3 個突變熱點分別佔所有 ALK 突變 之比例為 F1174：30%、F1245：12%、R1275：43%，共佔所有突變的 85%)相比，
我們發現 ALK 突變發生率較國外報告略高，且 ALK 突變集中於 advanced NB，可 能是因本研究中所收集的樣本中 advanced NB 比例(50/76，65.8%)較 Bresler 等人的 研究對象(216/476，46.0%)高之故。在國人的神經母細胞瘤中，ALK 突變以 F1174L、
F1245 為主，並未發現 R1275 突變，與國外統計差異較大。目前許多研究顯示若
ALK 發生 F1174L 突變，則對 ALK 抑制劑 Crizotinib 有抗性，對藥物的感受性較差
56,59，因此若未來 ALK 抑制劑可用於國人神經母細胞瘤病患，ALK 基因突變檢測
相當重要，對於具有 ALK F1174L 突變的病例，可預期病患使用 Crizotinib 的標靶 治療效果不好，必須考慮改用第二代 ALK 抑制劑如 Certinib、Alectinib 做為病患 的輔助治療。
在神經母細胞瘤腫瘤編號 254 所發現的 A1274 基因變異(圖三 c)，我們暫將其 認定為突變而非 SNP 的理由在於：(1) 此基因變異只發現於病患，未發生在健康 人。(2) 於 Ensembl 基因資料庫(CANCER-GENOME, EVA-EXAC, PERLEGEN database)有記載(rs45502292)，屬於 mis-sense variant，單一核苷酸由 G 置換成 A，
而導致第 1274 號胺基酸由丙胺酸(alanine)變成蘇胺酸(threonine)；而此基因變異發 生頻率極低，G allele: A allele=12,1411:1 (EVA-EXAC database)。(3) 根據 NCBI 基 因資料庫(MMDB─Entrez's ‘Structure’ database)查詢到 ALK 3D 結構，此基因變異 座落的位置為 ALK tyrosine kinase domain 的 ATP binding site、active site 以及 activation loop (A-loop)(附錄九)，皆是參與 ALK 活化的重要位置。(4) 根據在 NCBI 基因資料庫(Conserved Domain Database, CDD)查詢 ALK 基因第 1274 號胺基酸 alanine 位於 ALK A-loop，此位點在不同物種間的 ALK A-loop 序列具有高度相似性，
顯示若此位點發生基因變異應具有重要意義(附錄十)。(5) 依照發病年紀(44.5 個月，
3.71 歲)與疾病分期(Stage 4)，此腫瘤屬於惡性神經母細胞瘤。然而，此基因變異 也具有不排除為 SNP 的理由：(1) 此基因變異目前在神經母細胞瘤未曾被報導過，
而唯一出現過的記錄是 2007 年 Greenman 等人報導 ALK A1274T 發生於一名罹患 大腸腺癌(colorectal adenocarcinoma) 的 75 歲男性並定義其為基因變異型(germline variant)85。(2) 關於本病例神經母細胞瘤預後指標，除了病患發病年紀較晚以及屬 於 Stage 4 外，沒有 MYCN 增幅、追蹤 21.9 個月未發生疾病復發或死亡。此外腫 瘤 ALK 相對表現為低量。雖然目前我們暫將 ALK A1274T 基因視為與神經母細胞 瘤相關之突變，但後續應做一些實驗進一步證實目前的說法。例如：(1) 取得腫瘤
編號 254 此病患的其他組織(如周邊血液、口腔黏膜細胞)，同樣以 PCR 搭配核酸 定序方式確認該基因變異是否出現在一般組織中，以確定是否為 germline mutation，
若是，則應該考慮檢測父母或其他親屬，查詢相關家族病史。(2) 製造帶有此突變 的 plasmid，transfect 至 NB 細胞後，偵測 ALK 下遊訊息傳遞分子(如 ERK)是否因 而活化。(3) 可進行一系列細胞功能性試驗(functional assay)：在 ALK 無突變的 NB 細胞中製造此突變(例如 site directed mutagenesis)，與對照細胞是否產生與腫瘤癌 化相關特性之改變，如 colony formation、migration、invasion、xenograft tumor formation 等。
以 ALK 基因突變與 ALK 基因表現量分別探討神經母細胞瘤病患的無事件存活 率及整體存活率，其結果顯示有 ALKMut+組相較於 ALKWT組與病患五年存活率較低 具有高度正相關(EFS：HR 4.2，95% CI 2.6-78.4，p=0.0021 及 OS：HR 5.6，95% CI 3.7-230.0，p=0.0015)(圖十二)。但本研究中 ALKMut+組造成病患存活率較低，雖然 可能與具 ALK 突變的病患多為第 4 期、high risk 及 MYCN 增幅有關；然而，進行 advanced stage NB(n=37)及 high-risk NB(n=30)次群分析，帶有 ALK 突變的腫瘤，
病患之五年存活率與存活時間中位數皆較 ALK 未發生突變為低(圖十三 a,b)，顯示 ALK 突變對於惡性神經母細胞瘤是促進疾病進展因子。在所有 NB 腫瘤中 ALK 基 因表現高/低與病患五年存活率之分析中，雖然 ALK 高表現組傾向較差存活，但統 計上無顯著差異(EFS：p=0.1406 及 OS：p=0.1192)，而本研究中個案無論 ALK 高 度或低量表現，病患的五年存活率皆僅剩 40%左右(圖十五)，可能原因有：(1) 本 研究中收集的樣本多為 advanced NB (50/76，65.8%)有關，advanced NB 病患預後 本來就差，因此研究結果無法顯示 ALK 相對高或低表現量與病患存活率之關聯性。
(2) 根據 2015 年 Regairaz 等人發表的研究86，說明神經母細胞瘤腫瘤有 ALK 基因 表現並非導致 NB 癌化的關鍵，能表現活化態 phospho-ALK 才更重要。我們進一 步進行初診斷 NB 腫瘤(尚未經過化療)中 ALK 高/低表現與病患之存活分析，發現 ALKhigh組 EFS 的五年存活率(42.8%，存活時間中位數 23.0 個月)低於 ALKlow組
(60.5%，存活時間中位數 91.3 個月)(HR：2.3，95% CI：1.0-6.2，p=0.0600)；而
ALK 高度表現；且 MYCN 能透過與 ALK 的 promotor region 結合來增加 ALK 的轉 錄表現。Schönherr 等人80則提出 ALK 訊息傳導可活化 ERK，從而啟動 MYCN 的 promoter。我們看到 ALK 表現在有 MYCN 增幅 NB 中較無 MYCN 增幅 NB 腫瘤中 較高(但統計尚未達顯著差異)，但 ALK 與 MYCN 表現呈顯著正相關，結果支持 Hasan, Schönherr 等人的論點(圖十一)。在本計畫中，ALK 表現只在分化不良的 NB 腫瘤 中顯著較高(圖七、表五)，並且腫瘤中 ALK 高表現與病人不良預後有顯著關聯(圖 十五)。透過在網路可及的國際癌症資料庫分析，ALK 高表現的確與 NB 的不良臨 床預後相關，且以往在細胞實驗及腫瘤移植小鼠模型中都看到 ALK 抑制劑可以抑 制腫瘤的發生，ALK 抑制劑搭配現行的治療對於 NB 腫瘤(尤其是高危險性或帶有 ALK 突變的惡性神經母細胞瘤)仍具有相當大的潛力。此外，由於國人的 NB 病例 帶有對 Crizotinib 具抗藥性的 ALK F1174L 突變比例較國外為高，未來若要使用 ALK 抑制劑治療國人神經母細胞瘤，ALK 基因 kinase domain 突變之篩檢將十分重 要。