國立臺灣大學醫學院醫學檢驗暨生物技術學系 碩士論文
Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology College of Medicine
National Taiwan University Master Thesis
台灣地區神經母細胞瘤 ALK 基因多型性及 基因突變分析
Analysis of Genetic Polymorphisms and Mutations on ALK Gene in Neuroblastoma in Taiwanese Population
陳蔓潔
Man-Chieh Chen
指導教授：胡忠怡 博士 Advisor: Chung-Yi Hu, Ph.D.
中華民國 105 年 7 月
July, 2016
致謝
兩年的時間一下就過去了，能完成這篇論文首先要感謝我的指導教授胡忠怡 老師在實驗過程所給予的指導及建議，並且在老師身上學習到許多學術知識。感 謝台大醫院神經母細胞瘤照護團隊─許文明醫師、盧孟佑醫師、劉彥麟醫師、周 獻堂醫師以及張修豪醫師，提供我珍貴的神經母細胞瘤樣本以及病人臨床資料做 為研究材料並且讓我有機會參與神經母細胞瘤的國際研討會，使我受益良多。其 中特別感謝盧孟佑醫師、劉彥麟醫師在 committee 上的建議以及為我解決一些與 神經母細胞瘤相關的問題，還有助理楊彩姍學姊在檢體與臨床資料上的協助，對 於論文的完成有很大的幫助。感謝標靶課與 committee 時，林亮音老師、郭遠燁 老師、歐大諒老師以及顧雅真老師在研究過程中所給予的建議及論文完成的指導。
另外，感謝 R304 的成員們─佩蓉學姊、馨瑩學姊與佳瑋兩年來的照顧與實驗上 的幫助；文博帶給實驗室許多的歡樂及笑聲，還有新來的學弟妹─映辰、克巍，
很高興認識你們。最後，我要感謝我的家人─爸爸、媽媽、哥哥以及世彥，有你 們的支持和陪伴我才能順利完成學位，謝謝你們！
摘要
神經母細胞瘤(Neuroblastoma, NB)是源自於交感神經系統前驅細胞的胚胎性 惡性腫瘤。罹患第四期 NB 的病童即使遵循常規治療預後仍差，其五年存活率低 於 40%，亟待找出更有效的治療標的物。多年來在 NB 的研究都指出造成治療失 敗的特徵是腫瘤具有 MYCN 增幅。近年來許多研究認為 ALK (Anaplastic lymphoma kinase)可能是另一個與 NB 致病相關的重要基因：臨床上發現 high-risk NB 若高 度表現 ALK，其病患存活率低於不表現 ALK 者。造成 ALK 基因異常表現的原因 除了 ALK 基因 gain/amplification (12.2% / 1.5% in NB)，尚與 ALK 基因突變( 8% in NB)或其他未知原因有關。ALK 是一酪胺酸激酶接受器 (receptor tyrosine kinase)，
當 ALK 的 tyrosine kinase domain 發生突變(如：F1174、F1245 及 R1275)會造成 ALK 過度活化，誘導細胞趨於癌化。ALK 基因的調控經常與 MYCN 做連結，研究指出 ALK 的活化能促進 MYCN 表現；而 MYCN 亦能促進 ALK 轉錄表現。以 ALK 作 為標的物的小分子抑制劑 Crizotinb，臨床上已使用於有 ALK 轉位突變的非小細胞 肺癌(NSCLC)之治療。在細胞實驗及小鼠 xenograft 模型中 Crizotnib 皆能有效抑制 NB 細胞及腫瘤生長，使 ALK 抑制劑具潛力為 high-risk NB 提供有效的輔助治療。
然而，具有 ALK F1174 突變的轉殖小鼠 NB 動物模型中，Crizotinb 無法抑制腫瘤 發展，顯示 ALK 抑制劑對某些 ALK 突變的 NB 抑制效果不好；若改採用 ALK 小分子抑制物 TAE-684 則具有抑制 ALK F1174 突變的 NB 腫瘤。本研究目的為檢 查台灣地區神經母細胞瘤中 ALK 基因表現及突變情形。將目前收集到 34 位健康 成人 PBMC 以及 61 例 NB 病患檢體，針對 ALK 基因 Exon20~25 區域(kinase domain) 及與其相鄰之 Intron 部分分段進行 PCR，並進行核酸定序(Sanger’s sequencing)。
在 61 例 NB 樣本中發現 7 例(11.3%)有 ALK 突變：3 例為 F1174L 突變、3 例為 F1245 突變，1 例 A1274T 突變，未見到 R1275 突變；在 Exon20~25 中發現 6 個單一核 苷酸多型性(SNPs)(3 個 SNPs 位於外顯子之同義 SNPs；3 個 SNPs 位在 Intron20 及 Intron25)，此 6 個 SNPs 變異型基因分布頻率在 NB 腫瘤與正常 PBMC 無差異。
將 ALK 基 因 突 變 與 病 人 臨 床 資 料 進 行 分 析 ， 發 現 ALK 基 因 突 變 與 惡 性 NB(advanced stage、high risk、poorly differentiation、MYCN amplification)有關聯 性。腫瘤帶有 ALK 突變病患存活率較差(EFS：HR 4.2，p=0.0021；OS：HR 5.6，
p=0.0015)。並且在 advanced stage、high-risk NB 的次群分析中，帶有 ALK 突變的 腫瘤病患顯著有存活期較短。以 ALK 基因表現量與病人臨床資料進行分析，ALK 高度表現在腫瘤細胞分化程度低的 NB(UNB、PDNB)較顯著(p=0.0012)，其餘預 後因子皆與 ALK 表現量高或低較無關聯。而 ALK 基因表現量與 MYCN 基因表現 具有高度正相關(r=0.5831，p<0.0001)，但與 ALK 基因突變或基因多型性無顯著關 聯。分析 ALK 基因表現量與 NB 病人存活率，結果則顯示腫瘤中 ALK 表現量高 與病人存活率較差(EFS：HR 2.3，p=0.0600；OS：HR 4.8，p=0.0240)。透過本研 究一系列實驗數據與臨床資料的統計分析，我們得知：(1) ALK 基因突變常出現在 惡性神經母細胞瘤，病患的預後較差；在惡性(advanced stages, high risk)神經母細
胞瘤中， ALK 突變為造成疾病較快進展的重要因子。透過檢測病患腫瘤是否具
ALK 基因突變及為何種突變，能在診斷早期預測病人的預後及選擇何種 ALK 抑 制劑作為病患的輔助治療。(2) 不論 ALK 基因是否突變，神經母細胞瘤腫瘤皆可 能有 ALK 高度表現；而 ALK 的高表現量在 ALKWT及 ALKMut+病患中皆可發現。(3) 在 NB 腫瘤中 ALK 表現與 MYCN 表現呈顯著正相關。 (4) 腫瘤中 ALK 表現量高 為不良預後因子。(5)國人的 NB 病例帶有對 Crizotinib 具抗藥性的 ALK F1174L 突 變比例較國外為高，未來若要使用 ALK 抑制劑治療國人神經母細胞瘤，ALK 基 因 kinase domain 突變之篩檢將十分重要。
關鍵字：神經母細胞瘤、ALK 基因、突變，臨床預後。
Abstract
Neuroblastoma (NB) is an embryonal malignancy derived from precursor cells of the sympathetic nervous system. Children suffer from the stage 4 disease display a poor 5-years survival (less than 40%) even following multi-modality treatments. For years, studies of neurblastoma show that MYCN gene amplification consistently associated with treatment failure. Recently, anaplastic lymphoma kinase (ALK) has been evolved as an important factor in carcinogenesis of neuroblastoma. Previous studies showed that NB with high ALK immune reactivity was associated with clinical outcome. Aberration in ALK, including ALK gene gain/ amplification (12.2%/ 1.5% in NB), ALK gene mutations (8% in NB) and others, makes ALK the second most commonly mutated gene in neuroblastoma. ALK is a receptor tyrosine kinase, mutations on the tyrosine kinase domain of ALK (eg. F1174, F1245, and R1275), would cause ALK overactivation and predispose to carcinogenesis. ALK and MYCN showed regulatoty loop: ALK was able to stimulate MYCN promoter via activation of ERK signaling, and MYCN was found to bind onto ALK promoter region to regulate ALK transcription. Targeting to ALK, by small molecular inhibitor, Crizotinib has been applied in the treatment of NSCLC harboring ALK translocation. In cell experiments and mice xenograft model, crzotinib can also inhibit the growth of NB cell lines and NB tumors and make ALK inhibitors a potential effective adjuvant therapy for high-risk NB. However, in the MYCN-transgenic mice harboring ALK F1174 mutation, Crizotinib couldn’t inhibit the development of NB tumor, point out that Crizotinib is ineffective in inhibit ALK with certain mutation within kinase domain. ALK inhibitors have limitation in treatment. The goal of this research is to inspect the situation on ALK gene expression and mutations in neuroblastoma in Taiwan. 61 NB tumor samples sand PBMCs from 34 healthy adults were analyzed, PCR amplification of ALK gene fragments spanning exon20 to exon25 and theirs neighboring intronic regions, followed by Sanger’s sequencing, In 61 tumor DNA samples, 7 (11.3%) were found to have heterozygotic ALK mutation: 3 F1174L mutation, 3 with F1245 mutation, 1 with A1274T mutation, but there is no R1275
synonymous variants which located in exon20, 21 and23; the other 3 SNPs are intron variants, located in intron20 and 25. The allelic distribution of the ALK SNPs is not significantly different between NB tumors and normal PBMCs. We find that ALK mutation is associated with adverse clinical features (advanced stage, high risk, poorly differentiation, and MYCN amplification), and inferior survival (EFS: HR 4.2, p=0.0021;
OS:HR 5.6, p=0.0015). Subset analysis of advanced stage, high-risk NB showed that patient harboring ALK mutation displayed a shorter 5-year survival. Relative mRNA expression of ALK and MYCN were determinate by q-RT-PCR. ALK expression was found positively correlated with MYCN gene expression (r=0.5831, p<0.0001). High ALK expression was associated with undifferentiated/ poorly differentiated NB (p=0.0012), but not with ALK mutation, ALK genetic polymorphism, nor other clinical features. We found ALK high expression correlated with worse patients’ survival (EFS:
HR 2.3, p=0.0600; OS: HR 4.8, p=0.0240).
In Summary, we obtain information in our research: (1) ALK gene mutation occurs in NB with adverse clinical features. Further, ALK mutation is an important factor that cause faster disease progression in advanced stage and/or high-risk NB. Detection of ALK mutational spectrum in early diagnosis, could predict patients’ prognosis and choice suitable ALK inhibitor as adjuvant therapy in neuroblastoma. (2) ALK high expression could exist in ALK WT or mutant+ tumors. ALK high expression was not necessary found in ALKMut+ tumor. (3) ALK expression is highly correlated with MYCN expression in NB tumor, (4) High ALK expression in NB tumor predicts poor clinical outcomes. (5) ALK F1174L (known Crizotinib-resistant) is a prevalent type of mutation in NB in Taiwan. Screening ALK mutation to evaluate the use of ALK inhibitor as therapentics is very important for NB patients in Taiwan.
Keyword: Neuroblastoma, ALK gene, mutation, clinical outcome.
縮寫表
縮寫 全名
Ala (A) Alanine
ALCL Anaplastic large cell lymphomas ALK Anaplastic lymphoma kinase A-loop Activation loop
AUC Area under the ROS curve cDNA Complementary DNA CRC Colorectal cancer CT Computed tomography
DNB Ddifferentiating nerroblastoma EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EFS Event-free survival
ESCC Esophageal squamous cell carcinoma EtBr Ethidium bromide
EtBr Ethidium bromide FH Favorable histology Gly (G) Glycine
GN Ganglioneuroma GNB Ganglioneuroblastoma
HMGA1 High mobility group AT-hook 1
HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 HVA Homovanillic acid
ID2 Inhibitor of DNA binding 2 IDRF Image defined risk factors
縮寫 全名
IHC Immunohistochemistry Ile (I) Isoleucine
IMT Inflammatory myofibroblastic tumor
INPC International Neuroblastoma Pathology Classification INRGSS International Neuroblastoma Risk Group Staging System INSS International Neuroblastoma Staging System
IRB The Institutional Review Board LB Ligand-binding domain
LDH Lactate dehydrogenase Leu (L) Leucine
LIF Leukemia inhibitory factor
LTK Leukocyte receptor tyrosine kinase
MAM Meprin, A5 protein, and protein phosphatase μ MgCl2 Magnesium chloride
miBG Metaiodobenzylguanidine MK Midkine
MKI Mitosis-karyorrexis index MRI Magnetic resonance imaging
MYCN v-myc avian myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived
NaCl Sodium chloride NB Neuroblastoma NPM1 Nucleophosmin
NSCLC Non-small cell lung cancer NSE Neuron-specific enolase
縮寫 全名
ODC Ornithine decarboxylase OS Overall survival
PBMC Peripheral blood mononuclear cell PDNB poorly differentiated nerroblastoma Phe (F) Phenylalanine
PK Proteinase K
pNTs Peripheral neuroblastic tumors Pro (P) Proline
PT Pleiotrophin
PTK Protein tyrosine kinase qPCR Real-time PCR
RBCL Red blood cell lysis buffer RCC Renal cell carcinoma RMC Renal medullary carcinoma ROC Receiver operating characteristic RT-PCR Reverse Transcription-PCR
SDHA Succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A SDS Sodium dodecyl sulfate
SNP Single-nucleotide polymorphism TBE Buffer Tris-borate-EDTA buffer
TH-MYCN Tyrosine hydroxylase promoter-MYCN Thr (T) Threonine
TKD Tyrosine kinase domain
TM Transmembrane domain
縮寫 全名
Tris-Cl Tris base. HCl UD Undifined
UH Unfavorable histology
UNB Undifferentiated nerroblastoma Val (V) Valine
VMA Vanillylmandelic acid WT Wild type
目錄
致謝……… I
摘要……… II
Abstract……… IV 縮寫表……… VI
目錄……… X
表目錄……… XIV
圖目錄……… XV
附錄目錄……… XVI
第一章 緒論……… 1
1.1 神經母細胞瘤……… 1
1.1.1 神經母細胞瘤簡介……… 1
1.1.2 神經母細胞瘤的致病機轉……… 1
1.1.3 神經母細胞瘤的臨床表現……… 2
1.1.4 神經母細胞瘤的診斷與分期……… 2
1.1.5 神經母細胞瘤的病理特徵……… 3
1.1.6 神經母細胞瘤的治療……… 4
1.1.7 神經母細胞瘤的分子標記及預後指標……… 5
1.2 Anaplastic lymphoma kinase (ALK)基因……… 7
1.2.1 ALK 基因的簡介……… 7
1.2.2 ALK 基因的腫瘤學歷史……… 8
1.2.3 ALK 基因與神經母細胞瘤……… 9
1.2.4 ALK 基因的調控……… 10
1.2.5 ALK 抑制劑在神經母細胞瘤中的潛力……… 10
1.3 研究假說……… 11
第二章 研究目的與實驗設計……… 12
2.1 研究目的……… 12
2.2 實驗設計……… 12
第三章 材料與方法……… 13
[實驗材料]……… 13
3.1 臨床檢體……… 13
3.2 試劑、試藥、試劑套組與工作清單……… 13
3.2.1 試劑試藥清單……… 13
3.2.2 試劑套組……… 14
3.2.3 試劑配方……… 14
(a) DNA 製備……… 14
(b) Polymerase Chain Reaction (PCR)………. 15
3.2.4 聚合酶連鎖反應之引子序列……… 15
(a) ALK 基因……… 15
(b) Control gene……… 16
3.2.5 反轉錄聚合酶連鎖反應/即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應之引子… 16 (a) ALK 基因……… 16
(b) MYCN 基因……… 16
(c) Control gene……… 16
3.2.6 實驗儀器……… 17
3.2.7 軟體與網路工具……… 17
[實驗方法]……… 18
3.3 檢體 DNA、RNA 製備……… 18
3.3.1 傳統常規 DNA 萃取……… 18
3.3.2 傳統常規 RNA 萃取……… 18
3.3.3 以 DNA、RNA 及蛋白質萃取套組萃取神經母細胞腫瘤樣本……… 18
3.3.4 cDNA 製備……… 19
(a) SuperScript® III First-Strand Synthesis System……… 19
(b) Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase……… 19
3.4 聚合酶連鎖反應引子設計……… 19
3.5 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)……… 19
3.6 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription-PCR, RT-PCR)………….. 20
3.7 聚合酶連鎖反應產物純化與定序……… 20
3.8 即時定量聚合酶連鎖反應……… 20
3.9 數據統計分析……… 20
第四章 結果……… 22
[臨床資料及檢體收案情形]……… 22
4.1 神經母細胞瘤預後因子與病患存活率之分析……… 22
4.2 ALK 基因突變及基因多型性分析……… 23
4.2.1 神經母細胞瘤病人腫瘤中 ALK 基因突變分析……… 23
4.2.2 ALK 突變基因型的表現……… 23
4.2.3 神經母細胞瘤病人 ALK 基因突變與預後分子相關性之分析……… 24
4.2.4 ALK 基因多型性分析……… 25
4.3 ALK 基因表現量分析……… 26
4.3.1 神經母細胞瘤中 ALK 基因表現量之分析……… 26
4.3.2 ALK 基因表現量與神經母細胞瘤預後因子之關聯性……… 27
4.3.3 ALK 基因表現量與 ALK 基因突變之關聯性……… 28
4.3.4 ALK 基因表現量與 ALK 基因多型性之關聯性……… 29
4.3.5 ALK 基因表現量與 ALK 組織化學染色之關聯性……… 29 4.3.6 ALK 基因表現量與 MYCN 基因增幅及其 MYCN 表現量之相關性分
析……… 29
4.4 ALK 基因變異及基因表現量與神經母細胞瘤病患存活率之分析……… 30
4.4.1 ALK 基因突變與神經母細胞瘤病患不良存活率具顯著相關性…… 30
4.4.2 ALK 基因多型性與神經母細胞瘤病患存活率之相關性……… 32
4.4.3 ALK 基因表現與神經母細胞瘤病患存活率之相關性……… 32
第五章 討論……… 33
第六章 參考文獻……….. 38
圖與表……… 52
附錄……… 80
表目錄
表一、 臺大醫院神經母細胞瘤病人臨床資料……… 53
表二、 61 例神經母細胞瘤病人腫瘤中 ALK 基因突變情形……….. 54 表三、 神經母細胞瘤病人 ALK 基因突變與預後分子之分析……….. 55 表四、 國人神經母細胞瘤腫瘤與健康成人 PBMCs 中 ALK 基因多型性分
布……… 56
表五、 ALK 基因表現量與神經母細胞瘤預後因子之統計結果…………... 57 表六、 ALK 基因表現量與 ALK 基因多型性之統計結果………. 58 表七、 ALK 基因多型性與神經母細胞瘤病患無事件存活率(EFS)之統計
結果……… 59
表八、 ALK 基因多型性與神經母細胞瘤病患整體存活率(OS)之統計
結果……… 60
圖目錄
圖一、 神經母細胞瘤預後因子與事件發生存活率(EFS)及整體存活率
(OS)之關係……… 61
圖二、 ALK 基因突變熱點之分佈情形……… 62
圖三、 帶有神經母細胞瘤病人腫瘤及細胞株 DNA 與 cDNA 樣本之 ALK 突變點核酸定序……… 63
圖四、 神經母細胞瘤病人腫瘤中 ALK 基因多型性之核酸定序結果……. 64
圖五、 ALK 免疫化學染色與 ALK 表現量之 ROS 曲線………. 66
圖六、 神經母細胞瘤病人腫瘤中 ALK 基因表現量分佈圖………. 67
圖七、 ALK 基因表現量與神經母細胞瘤預後因子之關係……….. 68
圖八、 ALK 基因表現量與 ALK 基因突變之分析……… 69
圖九、 ALK 基因表現量與 ALK 基因多型性之分析……… 70
圖十、 ALK 基因表現量與 ALK 組織化學染色之關聯性……… 71
圖十一、 ALK 基因表現量與 MYCN 基因表現量之關係……… 72
圖十二、 ALK 基因突變與神經母細胞瘤病患不良存活率相關……….. 73
圖十三、 ALK 基因突變與惡性神經母細胞瘤及病患不良存活率相關…….. 74
圖十四、 ALK 基因多型性與神經母細胞瘤病患存活率之相關性………….. 77
圖十五、 ALK 基因表現與與神經母細胞瘤病患存活率之相關性…………... 79
附錄
附錄一、 神經母細胞瘤的臨床表現………. 81
附錄二、 國際神經母細胞瘤分期系統 (International Neuroblastoma
Staging System, INSS)……… 82 附錄三、 國際神經母細胞瘤病理學分類 (International Neuroblastoma
Pathology Classification, INPC)………. 83 附錄四、 神經母細胞瘤影像限定之風險因子(Image defined risk factors,
IDRFs)……… 84 附錄五、 國際神經母細胞瘤風險群分期系統(International Neuroblastoma
Risk Group (INRG) Staging System………... 85 附錄六、 INRG Consensus Pretreatment Classification schema……… 86 附錄七、 ALK 基因結構、ALK 融合基因及 ALK 基因的腫瘤學歷史…… 87 附錄八、 以 NB 病患存亡與 ALK 表現量進行 ROC 作圖之靈敏度及特異性
結果………. 88
附錄九、 ALK A1274T 突變(rs45502292)位於 ALK 基因 TKD 活化位…… 89 附錄十、 ALK A1274 位點(rs45502292)在各物種間具高度相似性………... 90 附錄十一、 ALK 免疫組織化學染色與神經母細胞病患存活率之關聯性…… 91 附錄十二 以 ALK IHC 與 ALK 表現量進行 ROC 作圖及其之靈敏度和特異
性之結果………. 92
附錄十三 實驗步驟………. 93
第一章 緒論 1.1 神經母細胞瘤 1.1.1 神經母細胞瘤簡介
神經母細胞瘤是源自於交感神經系統的前驅細胞在發育過程中產生突變所導 致的惡性腫瘤，大約有一半的神經母細胞瘤源自後腹腔，好發於腎上腺髓質或交 神經節以腹部腫瘤形式出現，其餘則發生於胸部、頭部或骨盆之椎旁交感神經節
1-3。神經母細胞瘤是兒童第四種常見的癌症，佔所有兒童癌症發生率的 6-8%，僅 次於白血病(30-34%)、腦瘤或中樞神經系統方面腫瘤(19-25%)以及惡性淋巴瘤 (10-12%) 4-6。對於因惡性腫瘤死亡的案例中，神經母細胞瘤便佔了兒童致死率的 15% 1,7。世界各地報導的 NB 發生率皆類似，根據美國 National Cancer Institute 統 計，每年會出現 700 個新案例；新生兒患病率(prevalence)是 1/7000，年發生率則 為每百萬人中大約出現 10 個案例 8-12。而根據台灣兒童癌症基金會統計，神經母 細胞瘤的年發生率約 1/10,0000，每年會出現 30 個新案例13,14。神經母細胞瘤平均 發病年紀為 18 個月，大約有 40%患者於 1 歲以前發病、75%患者於 4 歲以前發病，
98%患者皆是 10 歲以前發病2,8。目前對於神經母細胞瘤的病因仍不明朗，但似乎 與後天環境因子無關。大部分病童腫瘤多為自發性產生，視為偶發性案例；只有 少數患者屬於家族遺傳，通常在相當小年紀便具有多灶性原發性腫瘤，視為家族 性案例1,15。
1.1.2 神經母細胞瘤的致病機轉
從 病 理 學 角 度 而 言 ， 神 經 母 細 胞 瘤 屬 於 周 邊 神 經 母 細 胞 腫 瘤 (peripheral neuroblastic tumors, pNTs)之一，其腫瘤中的細胞形態為小而藍的圓形細胞16。這些 細 胞 源 自 交 感 神 經 系 統 前 驅 細 胞 ， 為 交 感 腎 上 腺 譜 系 中 未 分 化 的 胚 胎 細 胞 (sympathogonia)。這些多能的胚胎細胞(pluripotent sympathogonia)遷移出神經嵴後 便形成交感神經節、腎上線髓質嗜鉻細胞以及副神經節，這也就是 pNTs 一般發生
的部位。然而，造成胚胎細胞(embryonal cells)持續存在進而於後來導致 pNTs 的機 制目前尚不明瞭。神經母細胞瘤的成因可能是具有缺陷的胚胎基因控制著神經嵴 的發育，進而造成胚胎細胞經歷不平衡增殖以及分化受擾17-19。這些缺陷造成正常 的遺傳分化程序受到干擾，導致早期或晚期分化受到阻礙。以病理組織學角度，
pNT 亞型便是依據腫瘤中細胞成熟度做區分，細胞形態可能以未分化的神經母細 胞為主或是具有大量完全分化的神經元細胞，其外圍受許旺細胞緻密間質包覆。
1.1.3 神經母細胞瘤的臨床表現
神經母細胞瘤在臨床上的表現差異很大，神經母細胞瘤腫瘤能夠沿著交感神 經系統而出現在任何部位(附錄一) 20，但主要發生在腎上腺髓質。原發腫瘤(primary tumor)若發生在脖子或上胸部會造成霍納氏綜合症(Horner’s syndrom)，其臨床表現 為上眼瞼下垂、瞳孔縮小以及無汗症；椎間神經母細胞瘤(Paraspinal neuroblastomas) 其腫瘤沿著脊柱延伸至椎間孔(intervertebral foramina)，使得脊髓受到壓迫造成癱瘓；
腹膜後大神經母細胞瘤(Large retroperitoneal neuroblastomas)腫瘤往往壓縮腎臟，而 引起高血壓；其他若腫瘤在眼窩會造成眼球突出形成瘀斑(俗稱浣熊眼)，在長骨則
會造成跛腳21。神經母細胞瘤一般是透過造血系統而轉移至周邊淋巴結以及骨髓，
而轉移至骨髓的腫瘤細胞將浸潤骨皮質。此外，神經母細胞瘤也會轉移至肝臟，
特別是罹患第 4S 期的神經母細胞瘤病患，腫瘤轉移致肝臟所涉及的影響便相當廣 泛，但是這樣的腫瘤一般很短暫，多半在未經治療下即自發性消退(spontaneous regression)。
1.1.4 神經母細胞瘤的診斷與分期
目前對於神經母細胞瘤的診斷與分期的歸類是以 International Neuroblastoma Staging System (INSS)分類為基礎。神經母細胞瘤一開始診斷的測試包含了以斷層 掃描(CT)或核磁共振攝影(MRI)評估原發腫瘤的大小和區域範圍以及是否侵犯至
其他器官。另外，miBG (metaiodobenzylguanidine，一種正腎上腺素的類似物)，可 被交感神經元選擇性地吸收，因此使用放射性碘元素(I131和 I123)進行標定，便能特 異性地偵測到神經母細胞瘤位置17,22。後續的診斷會藉由腫瘤組織的病理切片做確 認或是透過檢測病人尿液或血清中的兒茶酚胺(catecholamine)或兒茶酚胺代謝物，
如 多 巴 胺 (dopamine) 、 高 香 草 酸 (homovanillic acid, HVA) 及 香 草 扁 桃 酸 (vanillylmandelic acid, VMA)的濃度進行確認。大約 90%神經母細胞瘤腫瘤都會大 量分泌兒茶酚胺代謝物，因為未分化型腫瘤(undifferentiated tumor)缺乏將兒茶酚胺 轉換成 HVA 及 VMA 的酵素，因此尿液中 HVA 與 VMA 濃度會上升；而在分化不 良腫瘤(poorly differentiated tumor)中 VMA-HVA 比值經常偏低(ratio<1)，並表示預 後較差18,19,22,23
。
目前臨床上神經母細胞瘤的分期常使用 International Neuroblastoma Staging
System (INSS)18做為臨床醫師開刀時的依據，在不切除重要器官及不讓病患毀容情 況下將腫瘤切除，該分期如下所示：(另可見附錄二24,25)
Stage 1：屬於局部性腫瘤，可透過手術被完全切除且未出現淋巴結轉移現象。
Stage 2A：屬於局部性腫瘤，無法透過手術完全切除，未出現淋巴結轉移現象。
Stage 2B：屬於局部性腫瘤，不一定能透過手術完全去除，同側淋巴結具有轉移現 象，異側淋巴結則不會轉移。
Stage 3：腫瘤擴散範圍已跨過身體中線，但不一定有淋巴線轉移；或腫瘤只出現 在單側，但有淋巴結的遠端轉移；或腫瘤位在中線，並帶有兩側的淋巴結轉移。
Stage 4：腫瘤已轉移到遠端，如淋巴結、骨髓、肝臟、皮膚或其他器官。
Stage 4S：發病年紀小於一歲之病童，帶有 Stage 1 或 2 的局部性腫瘤，並且會特 異地轉移致肝臟、皮膚以及骨髓中。
1.1.5 神經母細胞瘤的病理特徵
神經母細胞瘤透過病理組織的觀察，藉由判定腫瘤中細胞分化程度進而與疾
病預後做連結，一般細胞分化程度越高，病患的預後也越好。
在 International Neuroblastoma Pathology Classification (INPC)中，以年齡為基 礎搭配組織形態學特徵，如神經膠間質(Schwannian stroma)發育程度、神經母細胞 (neuroblast)分化程度以及有絲分裂-核碎裂指數(mitosis-karyorrexis index, MKI)，將 pNTs 從預後好到預後差大致分成三大類22,26-28 (附錄三)：
(1) 神經節細胞瘤(ganglioneuroma)：細胞分化程度最高，其組織中神經膠間質佔 的比例最高(Schwannian-stroma-dominant)；最良性，預後最好。
(2) 神經節神經母細胞瘤(ganglioneuroblastoma)：細胞分化程度次之；依照結節 (nodule) 與 否 可 再 細 分 成 混 合 型 (intermixed) ， 組 織 中 富 含 神 經 膠 間 質 (Schwannian-stroma-rich)以及結節型(nodular)，組織中神經膠間質比例不一，
顯著、富含或鮮少都可能。
(3) 神經母細胞瘤(neuroblastoma)：細胞分化程度最低，組織中神經膠間質佔的 比例也最少(Schwannian-stroma-poor)；最惡性，預後普遍較差。神經母細胞瘤 可在向下細分成：未分化(undifferentiated)、分化不良(poorly differentiated)及分 化中(differentiating)，一般細胞分化程度越差，表示腫瘤越惡性。
1.1.6 神經母細胞瘤的治療
一般神經母細胞瘤的治療是依據腫瘤風險性而有所不同，主要遵循國際神經
母細胞瘤風險群分期系統(International Neuroblastoma Risk Group Staging System, INRGSS)29，此分類法只應用於手術前拍攝之影像結果做分類依據，不以術後結果 或是否擴散至淋巴結來歸類疾病分期。以此系統做疾病分期，需要具備判別影像 界定風險因子(image defined risk factors, IDRF) (附錄四)是否存在的相關知識。
INRG 分期系統初步將神經母細胞瘤分成 4 類(附錄五)：
Stage L1：屬於 low-risk neuroblastoma。腫瘤只出現在原發部位；在影像掃描，如 斷層掃描(CT)或核磁共振(MRI)中未發現 IDRFs。治療方法為觀察後以手術切除腫
瘤。此類病患的五年整體存活率高達 97% 30。
Stage L2：屬於 intermediate-risk neuroblastoma。腫瘤尚未擴散至原發部位及其鄰 近部位以外之區域；影像掃描可發現 IDRFs。通在在腫瘤切除前進行化學治療，而 化療的劑量及頻率依據臨床及腫瘤的生物學風險因子與病患對化療的反應進行微 調。近年來研究顯示對於一直沒有接受化療及腫瘤切除前觀察期的病患其三年整 體存活率約 96% 31，因此針對 stage L2 病患的治療原則是降低化療劑量及頻率來減 少副作用。
Stage M：屬於 high-risk neuroblastoma。腫瘤以遠端轉移至身體其他器官。治療強 度不斷加強，涵蓋了手術、化學治療、放射性治療、分化療法以及免疫療法，但 此類病患的五年存活率仍約 40%左右。
Stage MS：病患年紀低於 18 個月，而腫瘤轉移之部位只侷限於皮膚、肝臟、骨髓。
若將 INRG 分類系統結合臨床指標(INSS、發病年紀)、病理組織學指標(腫瘤 細胞分化程度)、遺傳學指標(MYCN 增幅、腫瘤細胞 DNA 套數)，用於預測腫瘤生 長及治療成效。這些指標被用於定義疾病的風險性，而將神經母細胞瘤進一步歸 類成 very low-risk、low-risk、intermediated-risk 以及 high-risk 四類。(附錄六)
1.1.7 神經母細胞瘤的分子標記及預後指標
除了前面所提到以病童發病年紀、INSS 分期以及病理組織分類做為神經母細 胞瘤的預後指標(prognostic markers)外，近年來漸漸也重視腫瘤中的基因變化，探 討其分子層面的改變，藉此輔助預測神經母細胞瘤病患的治癒前景。目前被認為 與神經母細胞瘤相關性高，能作為預後指標的分子標記(biomarkers)有：
1. MYCN 增幅 (MYCN amplification)：MYCN 增幅的定義是每個二倍體基因組 (diploid genome)中含大於 10 個套數(copy numbers)。據研究顯示神經母細胞瘤 之中大約 25%比例有 MYCN 增幅現象9,32-35。第 2、3、4、4S 期的病患若具有 MYCN 基因增幅，在疾病進展時間以及整體存活率的多元回歸分析中都強烈
預示有較差的預後。與神經母細胞瘤相關的兩種染色體變化：染色體 17q 增 加(gain)及染色體 1p 缺失(deletion)常伴隨 MYCN 基因增幅，並與疾病預後不
良有關 36-38。由於 MYCN 為一轉錄因子，因此可透過調控基因表現進而影響
細 胞 功能。 MYCN 基因能夠增加 MYCN 細胞途徑相關基因的表現，如 HMGA1(與癌症轉移有關)39、ID2(抑制細胞分化及增加細胞增生)40,41、ODC(參 與 polyamine 合成，基因位在 MYCN 附近，因此 MYCN 增幅常伴隨 ODC 增
幅)42,43、p53(抑癌基因)44等；或是降低交感神經元晚期分化發育相關基因表現
(如 LIF)45，因此透過偵測這些基因的表現能用於預測神經母細胞瘤不良預後
46。透過 MYCN 基因剔除的小鼠在胚胎時期便死亡，且觀察到小鼠神經元數量 減少，證實了 MYCN 對神經元發育成熟的重要性47,48。而 1997 年由 W.Weiss 發展出的 TH-MYCN 轉殖基因小鼠49，能自發性產生與人類神經母細胞瘤相似 度高的腫瘤，證實 MYCN 基因參與神經母細胞瘤的發生及發展，因此常被用 於 MYCN-amplified NB 相關之研究。
2. 節段性染色體變化(Segmental chromosome changes)：節段性染色體數目的變 化可用於預測不能切除且不具 MYCN 增幅的幼兒型神經母細胞瘤之復發。所 有神經母細胞瘤病患若發病年紀較晚、疾病分期較晚期、復發風險性較高以 及疾病結果較差者，有較多數量的染色體斷點50-54。
3. 全染色體變化(Whole chromosome changes)：細胞中的 DNA index，也就是套 數(ploidy)，能透過流式細胞儀(flow cytimetry)進行偵測。神經母細胞瘤細胞的 DNA index 若與正常細胞相同(DNA index=1)，稱做二倍體(diploid)；若細胞中 DNA index 增加(DNA index>1)則稱作超二倍體(hyperdiploid)。對嬰幼兒而言，
超二倍體細胞與神經母細胞瘤早期分期較有關係，對化療的反應較好，通常 比二倍體細胞有更良好的預後。但染色體套數並不適用於預測年紀大的孩童 之預後。55
4. ALK 突變(ALK mutation)：未分化淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase ,
ALK)是位在細胞表面的酪胺酸激酶受器(receptor tyrosine kinase)，只會在發育 中的胚胎以及新生兒大腦中大量表現。ALK 的胚系突變(germline mutations)是 造成遺傳性神經母細胞瘤的主因，而後天 ALK 的體細胞活化性突變(somatic activating mutations)也被發現是神經母細胞瘤的癌化原因。而 ALK 突變比例佔 神經母細胞瘤病患的 8%，並且與高風險性神經母細胞瘤的較低存活率有高度 相關性56。
5. 神經滋養因子受器(Neurotrophin receptors)：通常表現在正常神經細胞及一些 神 經 母 細 胞 瘤 細 胞 表 面 。 透 過 此 受 器 讓 細 胞 辨 識 神 經 滋 養 因 子 (Neurotrophin)─nerve growth factor ， 為 類 激 素 化 學 物 質 (hormone-like chermicals)，能輔助神經細胞成熟。若神經母細胞瘤腫瘤擁有某些神經滋養因 子受器，特別是 TrkA，則具有較好的預後。
6. 血清指標(Serum markers)：神經母細胞瘤細胞能釋放鐵蛋白(ferritin)至血液中，
病患血中鐵蛋白濃度高者預後較差。神經母細胞瘤細胞亦能製造神經元特異 性烯醇酶(Neuron-specific enolase, NSE)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)，因此血中 NSE、LDH 濃度上升與病患不良預後有關。
1.2 Anaplastic lymphoma kinase (ALK)基因 1.2.1 ALK 基因的簡介
未分化淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因是一種蛋白質酪胺酸 激 酶 (protein tyrosine kinase, PTK) 基 因 ， 擁 有 一 個 單 一 穿 膜 結 構 區 域 (single transmembrane domain, TM)，人類的 ALK 由 1620 個胺基酸構成57-59。ALK 蛋白胞 外部分包含 2 個 MAM (meprin, A5 protein, and protein phosphatase μ) domain 及 1 個 假 想 的 配 體 結 合 區 域 (ligand-binding domain, LB)59,60( 附 錄 七 ) 。 ALK 在 PTK superfamily 系統進化樹裡相對孤立，與 ALK 激酶區域(kinase domian)具最高度序 列相似的是白血球酪胺酸激酶(leukocyte receptor tyrosine kinase, LTK；79%相似度)。
在成人體內只有中樞神經系統能低量表現 ALK，而其他組織器官則未偵測到 ALK 表現 61。有鑑於這樣的基因表現分佈，ALK 因此被認為在神經系統發育過程中扮 演重要角色。由於 ALK 的結構及其表現的分佈，暗示著它的功能應是位在細胞表 面上提供特異性配體結合的受器，並且調控著神經細胞的增殖與分化。ALK 的天 然配體仍不明確，目前被認定最可能為哺乳類動物 ALK 受體的 2 個配體是生長因 子 pleiotrophin 及 midkine62,63，但此說法仍具有爭議64，對 pleiotrophin 及 midkine 的生物意義也尚不清楚。事實上，ALK 基因可透過基因重組，如轉位(translocation)、
翻轉(inversion)與其他基因產生融合蛋白或透過基因突變使得 ALK 構形改變，導 致 ALK 能夠不透過配體刺激便能持續活化(ligand-independent activation)65。
1.2.2 ALK 基因的腫瘤學歷史
ALK 基因在腫瘤學領域首次出現是 Morris 等人於 1994 年66在未分化大細胞淋 巴瘤(anaplastic large cell lymphomas, ALCL)中發現染色體 5q35(nucleophosmin, NPM1)與染色體 2p23(含未知的 PTK 基因)發生轉位(translocation)，該 PTK 基因便 被命名為 anaplastic lymphoma kinase (ALK)基因。NPM1 基因胺基酸末端與 ALK 基 因的催化區域(catalytic domain)發生聯結形成融合蛋白(fusion protein)。透過 NPM1 的二聚化(dimerization)，使得 NPM1-ALK 融合蛋白得以活化65。下一個與 ALK 聯 結的疾病是炎性肌纖維母細胞瘤(inflammatory myofibroblastic tumor, IMT)，除了腫 瘤中 ALK 表現增加，亦發現 TPM3-ALK、TPM4-ALK 融合蛋白67。而 TPM3/4-ALK 融合蛋白也在食道鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)68與腎癌 (renal cancer)69中發現。而 2007 年 Soda 等人在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)則發現 2 號染色體短臂(2p)因為發生翻轉(inversion)，使得 EML4 基 因與 ALK 基因形成 EML4-ALK 融合基因70，約佔 NSCLC 病患 6%。其他腫瘤也有 發現 ALK 融合基因，例如在大腸直腸癌(Colorectal cancer, CRC)中有 EML4-ALK 與 C2orf44-ALK 融合基因，腎細胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)71、腎髓質癌(Renal
medullary carcinoma, RMC)72中則發現 VCL-ALK 融合基因。(附錄七)
1.2.3 ALK 基因與神經母細胞瘤
2008 年 Mosse 研 究 團 隊 15 對 家 族 性 神 經 母 細 胞 瘤 (familial/germline neuroblastoma)進行單一核苷酸多型性投影(single nucleotide polymorphism mapping) 搭配核酸定序發現 3 個位在 ALK tyrosine kinase domain 的突變(R1192P, R1275Q, G1128A) 。而透過 high-risk NB 的 染 色 體 套 數 分 析 (chromosome copy number analysis)，發現 high-risk NB 常發生 ALK 基因 gain 或 amplification，並且藉由核酸 定序發現 ALK gain/amplified high-risk NB 中，ALK tyrosine kinase domain 也有 ALK 活化性突變發生(M1166R, I1171N, F1174I/L, F1245V/C, I1250T, R1275Q 等 8 個)，
這類在 ALK tyrosine kinase domain 隨機發生突變的神經母細胞瘤，稱作偶發性神 經母細胞瘤(sporadic neuroblastoma)15,73-75。2014 年 Bresler 等人分析 1596 例確診為 神經母細胞瘤的樣本中發現 126 例(8%)有 ALK 基因突變，這些突變分布於 tyrosine kinase domain 的 16 個位置，其中 3 個突變熱點(hotspots)的突變人數為 F1174：38 人(30%)、F1245：15 人(12%)及 R1275：54 人(43%)，共佔 NB ALK 突變案例總數 的 85%。神經母細胞瘤中 ALK 基因變異(genetic aberration)除了 ALK 基因活化性突 變外，尚有 ALK 基因的 gain (12.2%，copy number 為 3-10 copies)或 amplification (1.5%，copy number 為>10 copies)。
研究顯示 ALK 基因發生變異(基因突變或基因增幅)的神經母細胞瘤病患，無 事 件 存 活率 (EFS) 與 整 體 存 活率 (OS) 皆 比未 發 生 基因 變 異 者低； 進 一 步分 析 high-risk NB 病患，則 ALK 基因變異的病患存活率亦低於未發生 ALK 基因變異者
56。由 R2 資料庫(Tumor Neuroblastoma-Kocak-649 custom-ag44kcwolf)則可見 ALK 基因過度表現會造成神經母細胞瘤病患存活率下降76。而有些第 4 期神經母細胞瘤 案例是未發生 ALK 基因突變或增幅，但具有 ALK 高度表現77，因此 NB 腫瘤中 ALK 基因表現量高對於評估神經母細胞瘤的預後也相當重要。
1.2.4 ALK 基因的調控
神經母細胞瘤中，ALK 基因的調控常與 MYCN 基因做聯結，因為兩者位在人 類染色體 2p 鄰近區域(ALK：2p23、MYCN：2p24)，故 ALK 基因增幅經常伴隨 MYCN
基因增幅59,78,79。由 Schönherr 等人的研究發現 ALK 能透過透過活化下遊 ERK 訊
息傳遞途徑刺激 MYCN promotor 進行轉錄進而促進 MYCN 表現80。而 Hasan 等人 提出 ALK promoter region 上有 non-canonical E-Box 的結構座落於轉錄起始位的上 游，並且證明 MYCN 基因能藉由與 ALK promotor 上的 non-canonical E-Box 結合來 促進 ALK 基因的轉錄表現7。
1.2.5 ALK 抑制劑在神經母細胞瘤中的潛力
以 ALK 作為標的物的小分子抑制劑 Crizotinb (PF-02341066) 於 2011 年經美國 FDA 核准，臨床上已使用於有 ALK 轉位突變的非小細胞肺癌(NSCLC)之治療，
Crizotinib 的作用機制是結合至 ALK 的 ATP 結合位，藉由與 ATP 競爭來阻斷 ALK 的 autophosphorylation，進而抑制 ALK 持續活化。由於神經母細胞瘤中出現的 ALK 基因突變，會造成 ALK 結構改變，促使 ALK 由 inactive form 轉變成 active form，
增加 ATP 與 ALK 的 ATP 結合位親和力，導致 ALK 得以產生 ligand-independent activation。這使得許多研究團隊也寄望於將 ALK 抑制劑應用於治療神經母細胞瘤。
根據 Heukamp 等人於 2012 年的研究81，Crizotinib 在細胞實驗及小鼠 xenograft 模 型中皆能有效抑制 NB 細胞及腫瘤生長，使 ALK 抑制劑具潛力為 high-risk NB 提 供有效的輔助治療。
然而，某些 ALK 基因突變對於 Crizotinib 的感受性較低，表示 ALK 抑制劑對 於某些 ALK 突變的神經母細胞瘤而言抑制效果不好。眾所皆知的 Crizotinib-resistant ALK 突變是 F1174L56,59，其它對 Crizotinib 感受性差的 ALK 突變如 G1128A、I1171N、
Y1278S 等56。Heukamp 等人的研究81顯示具有 ALK F1174L/MYCN double-transgenic mice 的 NB 小鼠模型中，Crizotinib 無法抑制腫瘤發展；採用實驗用的 ALK 小分
子抑制物(如：TAE-684)則具有抑制 ALK F1174L 突變的 NB 腫瘤。以相同劑量的 TAE-684 及 Crizotinib 處理 ALK F1174L-mutated NB cell，發現 TAE-684 更能減少 細胞的 viability。將 ALK F1174L-mutated NB cell 皮下注射於裸鼠所長出的腫瘤，
同樣以 TAE-684 及 Crizotinib 治療，發現 Crizotinib 無法抑制 ALK F1174L-mutated tumor 生長，但 TAE-684 則能有效抑制腫瘤生長。這意味著那些對於 Crizotinib 感 受性較低的 NB 病患，其他 ALK 抑制劑對於 NB 治療將有幫助。
1.3 研究假說
ALK 表現與惡性神經母細胞瘤有關，使用 ALK 抑制劑可能為病患提供有效的 輔助治療。由於某些 ALK 突變對 Crizotinib 感受性較低，加上 Crizotinib 是昂貴的 標靶藥物，因此以 NB 腫瘤中 ALK 基因的表現狀況及 ALK 基因突變作為預測病患 對 Crizotinib 感受性的指標，可望能協助醫師判斷採取 ALK 抑制劑為神經母細胞 瘤病患治療的參考。
第二章 研究目的與實驗設計 2.1 研究目的
本研究的目的是檢查台灣地區神經母細胞瘤中 ALK 基因表現及突變情形。(1) 透過 qRT-PCR 偵測 ALK 基因的表現；(2) 以 sanger‘s sequencing 檢測 ALK 基因突 變。
2.2 實驗設計
本研究主要分成三部分：(1) NB 腫瘤中 ALK 基因突變及基因多型性分析、(2) NB 腫瘤中 ALK 基因表現量分析、(3) 驗證 ALK 基因表現以及 ALK 基因突變與在 神經母細胞瘤的臨床意義。
(1) 從 NB 病患腫瘤萃取 DNA 用於分析 ALK 基因突變與基因多型性；而從健康 人 PBMC 萃取 DNA 則做為與 NB 病人 ALK 基因序列做比對的控制組。將針 對 ALK 基因 tyrosine kinase domain 中 Exon20 到 25 部分分段進行 PCR 後，
做Sanger‘s sequencing，來偵測 ALK 基因突變。
(2) 從 NB 病患腫瘤萃取 RNA 逆轉錄成 cDNA 後利用 real-time PCR 檢測腫瘤組 織中 ALK 基因表現量。
(3) 統計國人神經母細胞瘤中 ALK 突變發生頻譜與 ALK kinase domain 區域基因 多型性分布。
(4) 分別探討 ALK 基因突變與 ALK 基因表現量與 NB 預後指標，如 INSS 疾病分 期、INPC 病理學分類、INRG 風險評估、MYCN 增幅與否，以及 ALK 免疫 化學染色結果進行統計分析，並以圖或表方式呈現。
第三章 材料與方法 [實驗材料]
3.1 臨床檢體
本研究中使用的神經母細胞瘤臨床檢體來自 2007 年至 2014 年在臺灣大學附 設醫院診斷、治療並於手術時取下之腫瘤樣本，所有樣本取得經由病患/家長知情 簽名同意用於 NB 相關研究，並且經人體試驗暨研究倫理委員會(The Institutional Review Board, IRB)審核通過。本研究共使用了 15 個神經母細胞瘤病患腫瘤 cDNA 以及 64 個病人腫瘤組織(其中有 3 例腫瘤組織無法提取足夠 DNA、RNA 樣本以及 2 例 cDNA 樣本品質無法符合分析要求)；而實驗中所使用之控制組檢體則為 34 個 健康成人血液檢體。病人腫瘤組織及健康對照組周邊血液單核白血球將萃取 DNA 及 RNA，並以 RNA 製備出 cDNA。
3.2 試劑、試藥、試劑套組與工作清單 3.2.1 試劑試藥清單
品名 廠牌 Cat. No
Agarose AMRESCO 0710-500G
Chloroform* MERK 1.02445.1000
EDTA MERK 1.08418.0250
EtBr# Flow Laboratories 16-891-49
Ethanol MERK 1.00983.2500
Isopropanol MERK 1.09634.2500
MgCl2 SIGMA M-2670
NaCl Mallinckrodt AR 7581-05
Proteinase K MERK 1.07393.0010
SDS AMRESCO 0227-500G
Sucrose SIGMA S-7903
TBE Buffer AMRESCO 0478-2PK
Triton X-100 SIGMA T-9284
Tris-Cl AMRESCO 0826-1KG
*毒化物；#致癌物
3.2.2 試劑套組
品名 廠牌 Cat. No.
NucleoSpin TriPrep Kit MACHEREY-NAGEL 740966.50
GeneAmp® 10X PCR Buffer I ABI│Life Technology N808-0129
TRIzol LS Reagent ambion│Life Technology 10296-010
SuperScript III First-Strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen│Life Technology 18080-051 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase Thermo Scientific #K1671 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Scientific #K0221 DreamTaq DNA Polymerase Fermentas│Thermo Scientific #EP0702
10mM dNTP Mix Fermentas│Thermo Scientific #R0192
REPLI-g Mini Kit Qiagen 150023
QuantiTect Whole Transcriptome Kit Qiagen 207043
PCR/Gel Clean UP Kit Favorgen FAGCK001-1
Bio-100 Mass DNA Ladder Protech Technology Enterprise M1-100T Nuclease/EtBr Terminator Protech Technology Enterprise PT-R475-500ml
3.2.3 試劑配方 (a) DNA 製備
5X RBC Lysis Buffer
材料 終濃度
Sucrose (MW=342.3) Triton X-100
MgCl2-6H2O (1M Stock) Tris-Cl (1M Stock, pH7.5)
1.6 M 5% (v/v)
25 mM 60 mM 滅菌後，至於 4℃保存
5X Proteinease K Buffer
材料 終濃度
NaCl
EDTA (pH8.0)
0.375 M 0.12 M 以0.45μM 濾膜過濾後，室溫保存
Proteinease K Stock
材料 用量 Proteinase K
10mM Tris-HCl, pH7.5
100 mg 10 ml 分裝後-20℃保存
Proteinase K Mixture (700μl for each reaction)
材料 體積 (μl)
5X Proteinase K Buffer Proteinase K (10 mg/ml) 10% SDS
ddH2O
160 40 80 420 使用前配製
(b) Polymerase Chain Reaction (PCR) 10X PCR Buffer
材料 終濃度
10X DreamTaq Buffer MgCl2
KCl (NH4)2SO4
20mM
GeneAmp® 10X PCR Buffer I MgCl2
KCl
TrisHCl, pH8.3 Gelatin
15mM 500mM 100mM 0.01%
於-20℃保存
3.2.4 聚合酶連鎖反應之引子序列 (a) ALK 基因
Name Primer sequence Amplicon
size
SNPs in the amplicon Exon20 ALK I19.1 ATGCTCGCAGGCCATGTTGC
301 bp
rs146074150, rs4622670, rs2276550 ALK I20.2 GTCTGCGGTGCTGTGAT AAC
Exon21+22 ALK I20.1 CCAGCTGCCTCATTATTGTG
413 bp rs3795850 ALK I22.2 CTTGGAGATATCGATCTGTT AG
Exon23 ALK I22.1 TTTGCCCAGACTCAGCTCAG
221 bp COSM28055, rs56247462 ALK I23.2 TGGCACAACA ACTGCAGCAA AG
Exon24 ALK I23.1 CTGACAAGCTCCTCGTCAGT
188 bp rs281864720, COSM28493 ALK I24.2 CAGATCAGCGACAGGATGAC
Exon25 ALK I24.1 GCCGTTGTACACTCATCTTCC
201 bp rs45502292, rs3738868 ALK I25.2 CTGAGGTGGAAGAGACAGGC
(b) Control gene
Name Primer sequence Amplicon size hu-β2M-F GCCGATATTCCTCAGGTACT
331 bp hu-β2M-R TCCAACTTTCAGCAGCTTAC
3.2.5 反轉錄聚合酶連鎖反應/即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應之引子 (a) ALK 基因
Name Primer sequence Amplicon size
ALK E19.1 TTTCTGCGGCATCATGATTG 1049 bp 搭配 ALK E29.2
ALK E27.1 AGTTTGTCACCAGTGGAGGC 183 bp 搭配 ALK E29.2
ALK E29.2 ATACTATCGGCAAAGCGGTG ALK E22.1 GTGCTCTGAACAGGACGAAC
ALK E26.2 CTTAACTGGCAGCATGGCA 418 bp 搭配 ALK E22.1
ALK E27.2 GATTTCCCATAGCAGCACTCC 502 bp 搭配 ALK E22.1
(b) MYCN 基因
Name Primer sequence Amplicon size MYCN-F GACCACAAGGCCCTCAGTAC
240 bp MYCN-R GTGGATGGGAAGGCATCGTT
(c) Control gene
hu-c-β2M-F TGGAGGCTATCCAGCGTACTCC
333 bp hu-c-β2M-R CATCTTCAAACCTCCATGATGCTG
hu-c-β-actin-F GCTCGTCGTCGACAACGGCTC
353 bp
hu-c-β-actin-R CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC
hu-GAPDH-f GCCAAAAGGGTCATCATCTC
227 bp
hu-GAPDH-r GGCCATCCACAGTCTTCT
hu-c-HPRT1-f TGACACTGGCAAAACAATGCA
94 bp
hu-c-HPRT1-r GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT
hu-c-SDHA-f TGGGAACAAGAGGGCATCTG
86 bp
hu-c-SDHA-r CCACCACTGCATCAAATTCATG
3.2.6 實驗儀器
儀器 廠牌型號
落地型離心機 微量離心管離心機 水平震盪器
自動恆溫機
分光光度計(Nanodrop) PCR 熱循環儀
電泳槽
照膠系統(UV Box)
KUBOTA 8800
HERMLE Z233MJK-2 KS Orbital shaker OS701 DENG YNG DB 45 incubator J&H ND1000
peqLab peqSTAR、Thermal PX2 Mupid-21
Quantum-1000-26M
3.2.7 軟體與網路工具
名稱(版本) 開發單位(網址) 用途
NCBI
Ensembl Genome brower R2 database
DNA MAN (7.0.2.176) Chromas (2.5.1.0) GraphPad Prism 4
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://asia.ensembl.org/index.html http://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/
main.cgi?&species=hs Lynnon Corporation Technelysium Pty Ltd GraphPad Software, Inc.
網路基因資料庫 網路基因資料庫 網路資料庫 定序圖形檔顯示 序列分析比對
統計軟體、繪圖軟體
[實驗方法]
3.3 檢體 DNA、RNA 製備 3.3.1 傳統常規 DNA 萃取
以 EDTA 採血管(紫頭)收集 3 ml 全血後，先經離心去除上層血漿，再加入紅 血球裂解液(Red blood cell lysis buffer, RBCL)離心後，留下採血管底部的白色血球 團塊，加入蛋白酶 K 混合液(Proteinase K mixture)後將待萃檢體移置 1.5 ml 微量離 心管，於 37℃震盪培養隔夜，藉此使白血球細胞中的蛋白質降解。次日，於室溫 下冷卻待萃檢體後，加入 6N NaCl 鹽析出蛋白質。以微量離心管離心機離心後將 上清液取出移至 1.5 ml 離心管中，加入異丙醇(Isopropanol)輕微搖晃至核酸沉澱物 出現。離心去除上清液，以 75%酒精清洗核酸沉澱物。待酒精風乾後，加入適當 體積的滅菌水使最終 DNA 濃度約為 40μg/ml，萃取出的 DNA 檢體儲存於-20℃冰 箱備用。附錄十一【實驗步驟 1】
3.3.2 傳統常規 RNA 萃取
利用 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 原理來分離 RNA、DNA 及蛋 白質，再用 isopropanol 萃取 RNA。附錄十一【實驗步驟 2】
3.3.3 以 DNA、RNA 及蛋白質萃取套組萃取神經母細胞腫瘤樣本
利用含有大量 chaotropic ions 的細胞裂解液(lysis buffer)在裂解細胞的同時將 所有細胞內的酵素(包括 DNase、RNase、proteases 以及 phosphatases 等等)皆去活 性，並將難溶的蛋白質分解，藉以使得 DNA 及 RNA 更好被矽膠濾膜(silica membrane)吸收。經過兩次清洗步驟後，以低鹽緩衝液將 DNA 洗脫，收集 RNA 留 在濾膜上。殘留於濾膜上的 DNA 則透過 rDNase 溶液去除之。隨後利用兩種緩衝 液清洗濾膜以去除鹽類、代謝物以及大分子細胞成分，此時便只留下 RNA 於濾膜 上。最後再以 RNase-free water 將 RNA 洗脫下來。將 DNA、RNA 萃取過程中所留
下含有蛋白質之溶液則可透過蛋白質沉澱試劑有效地將蛋白質從溶液中沉澱下來，
經過清洗步驟後，最後以蛋白質溶解緩衝液回溶。附錄十一【實驗步驟 3】
3.3.4 cDNA 製備
(a) SuperScript® III First-Strand Synthesis System
透過 SuperScript® III 的 M-MLV 反轉錄酶以 RNA 為模板合成出 first-strand cDNA。SuperScript® III 的反轉錄酶是一種經過修飾而減少 RNase H 活性並增加熱 穩定度，而且不會受到 ribosome RNA 及 transfer RNA 的大量抑制的 M-MLV 反轉 錄酶，因此得以從 total RNA 中合成出 first-strand cDNA。附錄十一【實驗步驟 4 (a)】
(b) Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase
套組中的雙股特異性 DNA 酶(dsDNase)可將 RNA 溶液中殘存的雙股 DNA 去 除，同時確保 RNA 和單股 DNA(包括 cDNA 以及引子)不被切割。而套組中的反轉 錄酶源自 M-MuLV 反轉錄酶，經改良後具有高度熱穩定性、更穩定，並且增加 cDNA 的合成率。附錄十一【實驗步驟 4 (b)】
3.4 聚合酶連鎖反應引子設計
自 Ensembl Genome brower 網站下載目標基因的序列，再搜尋相關文獻 NCBI (National Center for Biotechnology Information)網站上基因多型性資料庫，決定所要 調查之基因多型性/突變位點，依照下載序列設計適合之引子。
3.5 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)
將檢體 DNA 取 0.2μg/μl (至多 3μl)至 0.2ml 微量離心管中，並加入 30μl 聚合酶 連鎖反應混合液，與檢體 DNA 充分混勻後，於預先設定好的適當 PCR 條件下進 行反應。反應完成後再以 1.5~2.0%洋菜膠片(含 1‰EtBr)進行電泳分離，並確認聚 合酶連鎖反應是否有產物足以進行後續實驗。本實驗中所有聚合酶連鎖反應之條
件與混合液配置如附錄十一【實驗步驟 5】。
3.6 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcription-PCR, RT-PCR)
將 cDNA 樣本取 1μl 至 0.2ml 微量離心管中，並加入 30μl 聚合酶連鎖反應混 合液，與 cDNA 充分混勻後，於預先設定好的適當 PCR 條件下進行反應。反應完 成後再以 1.5~2.0%洋菜膠片(含 1‰EtBr)進行電泳分離，並確認聚合酶連鎖反應是 否有產物足以進行後續實驗。本實驗中所有聚合酶連鎖反應之條件與混合液配置 如附錄十一【實驗步驟 5】。
3.7 聚合酶連鎖反應產物純化與定序
聚合酶連鎖反應後之產物利用 PCR/Gel clean up 套組(Favorgen)純化後，以 2%
洋菜膠片進行電泳，並以 UV 光照射，依照膠片上色帶強度推估純化後產物的 DNA 濃度與純度。將純化後的產物依照建議量準備樣品後，委託台大醫學院第二共同 研究中心進行桑格定序(Sanger’s sequencing)反應(APPLIED BIOSYSTEMS, 3730xl DNA Analyzer)。詳見附錄十一【實驗步驟 6】。
3.8 即時定量聚合酶連鎖反應
將檢體 cDNA 稀釋 10 倍後，取 1μl 至 0.2ml 微量離心管中，並加入 19μl 即時 定量聚合酶連鎖反應混合液(2X SYBR Green Master Mix)，與檢體 cDNA 充分混勻 後，於預先設定好的適當 real-time PCR 條件下進行反應(ABI 7500 Fast)。反應完成 後將實驗數據輸出至 excel 檔，以便做後續基因相對表現量分析。詳見附錄十一【實 驗步驟 7】。
3.9 數據統計分析
臨床資料與病人基因型分析或病人 ALK 基因表現量高/低間之比對，以卡方檢
定進行統計分析(雙尾)，當 p 值小於 0.05 認定為有統計上的顯著差異。若細格數 n 值小於 5 以下，則使用費雪精確檢定(Fisher’s exact test)。臨床資料與實驗數據間比 對以及 Kaplan-Meier curve (survival curve)皆是透過 GraphPad Prism 軟體進行分析、
作圖以及統計，組間分布比較統計的檢定方法為 Mann-Whitney U Test，不同病人 組間存活比較檢定用 Log-rank test。
第四章 結果
[臨床資料及檢體收案情形]
本研究共收集 79 例 2007-2014 年間在台大醫院就診並接受手術治療之神經母 細胞瘤病人檢體，其中 15 例為 cDNA 樣本，64 例病人檢體則是取得冷凍腫瘤組 織，抽取 DNA 及 RNA 樣本，並將 RNA 反轉錄出 cDNA (其中有 3 例無法提取足 夠 DNA、RNA 樣本以及 2 例 RNA 樣本品質無法符合分析要求)。因此最終用於 本研究中進行資料分析的細節如表一所示：74 個病人 cDNA 樣本進行即時定量 PCR 偵測腫瘤中 ALK、MYCN 基因表現量；61 例病人 DNA 檢體進行核酸定序 (Sanger’s sequencing)分析腫瘤中 ALK 基因突變及基因多型性。病人臨床資料部分，
有 74 例組織病理資料、74 例疾病分期資料、73 例疾病風險分群資料、70 例 MYCN 基因增幅與否資料、74 例復發時間資料、74 例死亡時間資料及 31 例 ALK 免疫 組織化學染色資料。
4.1 神經母細胞瘤預後因子與病患存活率之分析
針對具有完整臨床資料的 74 個病例，將病人發病年紀和疾病分期(INSS stage)與確診後之疾病復發時間(time to relapse)或死亡時間(time to death)分別進行 比對，便可得到與病人發病年紀及疾病分期相關的事件發生存活率(event-free survival, EFS)及整體存活率(overall survival, OS)。
從實驗結果可發現：若 NB 病人發病年紀大於 18 個月，無事件存活率 (Event-free survival, EFS)及整體存活率(Overall survival, OS)皆明顯低於發病年小 於 18 個月的病人(圖一 a，EFS：p=0.0013；OS：p=0.0015)。神經母細胞瘤 INSS 分期，若 NB 病人疾病分期為第 4 期者，EFS 之五年存活率為 14.2%(存活時間中 位數為 20.6 個月)以及 OS 之五年存活率為 27.0%(存活時間中位數為 39.0 個月)，
皆顯著低於第 1、2 期病例(圖一 b)。
4.2 ALK 基因突變及基因多型性分析
4.2.1 神經母細胞瘤病人腫瘤中 ALK 基因突變分析
將所有 DNA 檢體針對 ALK 基因 Exon20 到 Exon25 及其鄰近 Intron 部分分段 進行 PCR 後，進行核酸定序(Sanger’s sequencing)，並從定序結果檢視 ALK 基因 突變，已報導 ALK 3 個突變熱點 F1174、F1245 及 R1275 分別是位在 ALK 基因 Exon23、24 及 25(圖二)。本研究中所有發現的突變皆經過獨立重覆 PCR/Sanger's sequencing 予以確認，並於對應樣本 cDNA 中確認突變點及突變形式。分析 61 例 神經母細胞瘤腫瘤中發現共有 7 例具有 ALK 基因突變(表二)，其中有 3 例為 F1174 突變，在+3522 位置出現單一核苷酸置換，由 C 置換成 A，並造成第 1174 號胺基 酸由苯丙胺酸( phenylalanine, Phe (F) )改變成白胺酸( leucine, Leu (L) )─F1174L。
此外，有 3 例為 F1245 突變，其中的 2 例在+3733 位置分別出現單一核苷酸置換，
1 例是由 T 置換成 G，使得第 1245 號胺基酸由苯丙胺酸改變成纈胺酸( valine, Val (V) )─F1245V；1 例是由 T 置換成 A，使得第 1245 號胺基酸由苯丙胺酸改變成異 白胺酸( isoleucine, Ile (I) )─F1245I；另 1 例是在+3735 位置出現單一核苷酸置換，
由 C 置換成 A，造成第 1245 號胺基酸由苯丙胺酸( phenylalanine, Phe (F) )改變成 白胺酸( leucine, Leu (L) )─F1245L。本研究於 NB 樣本中並未發現 ALK R1275 突 變，不過卻發現了 1 個可能的新突變點─A1274，在+3820 位置出現單一核苷酸置 換，由 G 置換成 A，並造成第 1274 號胺基酸由丙胺酸( alanine, Ala (A) )改變成蘇 胺酸( threonine, Thr (T) )─A1274T。此突變點在 Ensembl Genome brower 基因資料 庫(CANCER-GENOME, EVA-EXAC, PERLEGEN database)中有記錄，其發生頻率 G allele: A allele=12,1411:1 (EVA-EXAC database)，但至今尚無人報導在神經母細 胞瘤中發現此突變點。
4.2.2 ALK 突變基因型的表現
本研究發現 ALK 基因突變的樣本皆為 ALKWT/Mut+雜合子(圖三)，與先前報導
相似82。NB 檢體編號 168、203 及 277-L 與 NB 細胞株 SH-SY5Y 皆帶有 ALK F1174L 突變，從定序圖可見正常野生對偶基因(WT allele)和突變對偶基因(mutant allele) 在腫瘤中的訊號強度並非一致(圖三 a)。針對同病例/細胞株之 cDNA 樣本進行核 酸定序，結果發現在病人腫瘤編號 168 及 277-L 與 SH-SY5Y 細胞株，其 WT allele 與 mutant allele 表現之訊號強度與 DNA 樣本中訊號強度比例相當，但是病人腫瘤 編號 203 的 cDNA 樣本經重覆測試卻無法偵測到 ALK F1174 突變(圖三 a)。檢體 編號 256、270 及 274 都是 ALK F1245 突變，從 DNA/cDNA 核酸定序圖可見 WT allele 與 mutant allele 訊號強度大致相當(圖三 b)。檢體編號 254 為 ALK A1274T 突 變，其 DNA/cDNA 核酸定序顯示 WT allele: mutant allele 訊號強度皆約 1:1 (圖三 c)。分析具有 ALK 突變的樣本可發現在絕大多數的樣本 ALK mutant allele 皆有表 現，WT allele 則全部都有表現，因此在神經母細胞瘤腫瘤中 ALK 基因即使未出 現突變亦能有表現。
4.2.3 神經母細胞瘤病人 ALK 基因突變與預後分子相關性之分析
由於 ALK 基因與惡性神經母細胞瘤有關，因此我們進行 ALK 基因突變與神 經母細胞瘤預後分子(年齡、疾病分期、疾病風險分群、組織病理學以及 MYCN 基因增幅與否)之分析(表三)。年齡是以神經母細胞瘤平均發病年紀─18 個月做區 分，在 7 位具有 ALK 基因突變的病人中，有 3 位的發病年紀小於 18 個月(佔該群 病人的 10.3%)；4 位的發病年紀大於 18 個月(佔該群病人的 12.5%)。將 INSS 分 期區分成早期 NB(第 1、2 期)、晚期 NB(第 3、4 期)以及第 4S 期，7 位具有 ALK 基因突變的的病人皆屬於後期階段(1 位為第 3 期，其他 6 位皆是第 4 期)，佔該群 病人的 18.9%。疾病風險分群：7 位具有 ALK 基因突變的的病人皆為高風險分群 之神經母細胞瘤(佔該群病人的 23.3%)，以費氏精確檢定顯示 ALK 突變發生與疾 病為高風險分群有明顯正相關(p=0.0105)。組織病理學依照細胞分化程度做區分，
大方向分成未分化、部分分化及其他(細胞分化程度較高，詳細可參考附錄二)，7
