第一章 緒論
1.2 Anaplastic lymphoma kinase (ALK)基因
未分化淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因是一種蛋白質酪胺酸 激 酶 (protein tyrosine kinase, PTK) 基 因 ， 擁 有 一 個 單 一 穿 膜 結 構 區 域 (single transmembrane domain, TM)，人類的 ALK 由 1620 個胺基酸構成57-59。ALK 蛋白胞 外部分包含 2 個 MAM (meprin, A5 protein, and protein phosphatase μ) domain 及 1 個 假 想 的 配 體 結 合 區 域 (ligand-binding domain, LB)59,60( 附 錄 七 ) 。 ALK 在 PTK superfamily 系統進化樹裡相對孤立，與 ALK 激酶區域(kinase domian)具最高度序 列相似的是白血球酪胺酸激酶(leukocyte receptor tyrosine kinase, LTK；79%相似度)。
在成人體內只有中樞神經系統能低量表現 ALK，而其他組織器官則未偵測到 ALK 表現 61。有鑑於這樣的基因表現分佈，ALK 因此被認為在神經系統發育過程中扮 演重要角色。由於 ALK 的結構及其表現的分佈，暗示著它的功能應是位在細胞表 面上提供特異性配體結合的受器，並且調控著神經細胞的增殖與分化。ALK 的天 然配體仍不明確，目前被認定最可能為哺乳類動物 ALK 受體的 2 個配體是生長因 子 pleiotrophin 及 midkine62,63，但此說法仍具有爭議64，對 pleiotrophin 及 midkine 的生物意義也尚不清楚。事實上，ALK 基因可透過基因重組，如轉位(translocation)、
翻轉(inversion)與其他基因產生融合蛋白或透過基因突變使得 ALK 構形改變，導 致 ALK 能夠不透過配體刺激便能持續活化(ligand-independent activation)65。
1.2.2 ALK 基因的腫瘤學歷史
ALK 基因在腫瘤學領域首次出現是 Morris 等人於 1994 年66在未分化大細胞淋 巴瘤(anaplastic large cell lymphomas, ALCL)中發現染色體 5q35(nucleophosmin, NPM1)與染色體 2p23(含未知的 PTK 基因)發生轉位(translocation)，該 PTK 基因便 被命名為 anaplastic lymphoma kinase (ALK)基因。NPM1 基因胺基酸末端與 ALK 基 因的催化區域(catalytic domain)發生聯結形成融合蛋白(fusion protein)。透過 NPM1 的二聚化(dimerization)，使得 NPM1-ALK 融合蛋白得以活化65。下一個與 ALK 聯 結的疾病是炎性肌纖維母細胞瘤(inflammatory myofibroblastic tumor, IMT)，除了腫 瘤中 ALK 表現增加，亦發現 TPM3-ALK、TPM4-ALK 融合蛋白67。而 TPM3/4-ALK 融合蛋白也在食道鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)68與腎癌 (renal cancer)69中發現。而 2007 年 Soda 等人在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)則發現 2 號染色體短臂(2p)因為發生翻轉(inversion)，使得 EML4 基 因與 ALK 基因形成 EML4-ALK 融合基因70，約佔 NSCLC 病患 6%。其他腫瘤也有 發現 ALK 融合基因，例如在大腸直腸癌(Colorectal cancer, CRC)中有 EML4-ALK 與 C2orf44-ALK 融合基因，腎細胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)71、腎髓質癌(Renal
medullary carcinoma, RMC)72中則發現 VCL-ALK 融合基因。(附錄七) analysis)，發現 high-risk NB 常發生 ALK 基因 gain 或 amplification，並且藉由核酸 定序發現 ALK gain/amplified high-risk NB 中，ALK tyrosine kinase domain 也有 ALK 活化性突變發生(M1166R, I1171N, F1174I/L, F1245V/C, I1250T, R1275Q 等 8 個)，
這類在 ALK tyrosine kinase domain 隨機發生突變的神經母細胞瘤，稱作偶發性神 經母細胞瘤(sporadic neuroblastoma)15,73-75。2014 年 Bresler 等人分析 1596 例確診為 神經母細胞瘤的樣本中發現 126 例(8%)有 ALK 基因突變，這些突變分布於 tyrosine kinase domain 的 16 個位置，其中 3 個突變熱點(hotspots)的突變人數為 F1174：38 人(30%)、F1245：15 人(12%)及 R1275：54 人(43%)，共佔 NB ALK 突變案例總數 的 85%。神經母細胞瘤中 ALK 基因變異(genetic aberration)除了 ALK 基因活化性突 變外，尚有 ALK 基因的 gain (12.2%，copy number 為 3-10 copies)或 amplification (1.5%，copy number 為>10 copies)。
研究顯示 ALK 基因發生變異(基因突變或基因增幅)的神經母細胞瘤病患，無 事 件 存 活率 (EFS) 與 整 體 存 活率 (OS) 皆 比未 發 生 基因 變 異 者低； 進 一 步分 析 high-risk NB 病患，則 ALK 基因變異的病患存活率亦低於未發生 ALK 基因變異者
56。由 R2 資料庫(Tumor Neuroblastoma-Kocak-649 custom-ag44kcwolf)則可見 ALK 基因過度表現會造成神經母細胞瘤病患存活率下降76。而有些第 4 期神經母細胞瘤 案例是未發生 ALK 基因突變或增幅，但具有 ALK 高度表現77，因此 NB 腫瘤中 ALK 基因表現量高對於評估神經母細胞瘤的預後也相當重要。
1.2.4 ALK 基因的調控
神經母細胞瘤中，ALK 基因的調控常與 MYCN 基因做聯結，因為兩者位在人 類染色體 2p 鄰近區域(ALK：2p23、MYCN：2p24)，故 ALK 基因增幅經常伴隨 MYCN
基因增幅59,78,79。由 Schönherr 等人的研究發現 ALK 能透過透過活化下遊 ERK 訊
息傳遞途徑刺激 MYCN promotor 進行轉錄進而促進 MYCN 表現80。而 Hasan 等人 提出 ALK promoter region 上有 non-canonical E-Box 的結構座落於轉錄起始位的上 游，並且證明 MYCN 基因能藉由與 ALK promotor 上的 non-canonical E-Box 結合來 促進 ALK 基因的轉錄表現7。
1.2.5 ALK 抑制劑在神經母細胞瘤中的潛力
以 ALK 作為標的物的小分子抑制劑 Crizotinb (PF-02341066) 於 2011 年經美國 FDA 核准，臨床上已使用於有 ALK 轉位突變的非小細胞肺癌(NSCLC)之治療，
Crizotinib 的作用機制是結合至 ALK 的 ATP 結合位，藉由與 ATP 競爭來阻斷 ALK 的 autophosphorylation，進而抑制 ALK 持續活化。由於神經母細胞瘤中出現的 ALK 基因突變，會造成 ALK 結構改變，促使 ALK 由 inactive form 轉變成 active form，
增加 ATP 與 ALK 的 ATP 結合位親和力，導致 ALK 得以產生 ligand-independent activation。這使得許多研究團隊也寄望於將 ALK 抑制劑應用於治療神經母細胞瘤。
根據 Heukamp 等人於 2012 年的研究81，Crizotinib 在細胞實驗及小鼠 xenograft 模 型中皆能有效抑制 NB 細胞及腫瘤生長，使 ALK 抑制劑具潛力為 high-risk NB 提 供有效的輔助治療。
然而，某些 ALK 基因突變對於 Crizotinib 的感受性較低，表示 ALK 抑制劑對 於某些 ALK 突變的神經母細胞瘤而言抑制效果不好。眾所皆知的 Crizotinib-resistant ALK 突變是 F1174L56,59，其它對 Crizotinib 感受性差的 ALK 突變如 G1128A、I1171N、
Y1278S 等56。Heukamp 等人的研究81顯示具有 ALK F1174L/MYCN double-transgenic mice 的 NB 小鼠模型中，Crizotinib 無法抑制腫瘤發展；採用實驗用的 ALK 小分
子抑制物(如：TAE-684)則具有抑制 ALK F1174L 突變的 NB 腫瘤。以相同劑量的 TAE-684 及 Crizotinib 處理 ALK F1174L-mutated NB cell，發現 TAE-684 更能減少 細胞的 viability。將 ALK F1174L-mutated NB cell 皮下注射於裸鼠所長出的腫瘤，
同樣以 TAE-684 及 Crizotinib 治療，發現 Crizotinib 無法抑制 ALK F1174L-mutated tumor 生長，但 TAE-684 則能有效抑制腫瘤生長。這意味著那些對於 Crizotinib 感 受性較低的 NB 病患，其他 ALK 抑制劑對於 NB 治療將有幫助。