第四章 結果
4.2 ALK 基因突變及基因多型性分析
4.2.1 神經母細胞瘤病人腫瘤中 ALK 基因突變分析
將所有 DNA 檢體針對 ALK 基因 Exon20 到 Exon25 及其鄰近 Intron 部分分段 進行 PCR 後，進行核酸定序(Sanger’s sequencing)，並從定序結果檢視 ALK 基因 突變，已報導 ALK 3 個突變熱點 F1174、F1245 及 R1275 分別是位在 ALK 基因 Exon23、24 及 25(圖二)。本研究中所有發現的突變皆經過獨立重覆 PCR/Sanger's sequencing 予以確認，並於對應樣本 cDNA 中確認突變點及突變形式。分析 61 例 神經母細胞瘤腫瘤中發現共有 7 例具有 ALK 基因突變(表二)，其中有 3 例為 F1174 突變，在+3522 位置出現單一核苷酸置換，由 C 置換成 A，並造成第 1174 號胺基 酸由苯丙胺酸( phenylalanine, Phe (F) )改變成白胺酸( leucine, Leu (L) )─F1174L。
此外，有 3 例為 F1245 突變，其中的 2 例在+3733 位置分別出現單一核苷酸置換，
1 例是由 T 置換成 G，使得第 1245 號胺基酸由苯丙胺酸改變成纈胺酸( valine, Val (V) )─F1245V；1 例是由 T 置換成 A，使得第 1245 號胺基酸由苯丙胺酸改變成異 白胺酸( isoleucine, Ile (I) )─F1245I；另 1 例是在+3735 位置出現單一核苷酸置換，
由 C 置換成 A，造成第 1245 號胺基酸由苯丙胺酸( phenylalanine, Phe (F) )改變成 白胺酸( leucine, Leu (L) )─F1245L。本研究於 NB 樣本中並未發現 ALK R1275 突 變，不過卻發現了 1 個可能的新突變點─A1274，在+3820 位置出現單一核苷酸置 換，由 G 置換成 A，並造成第 1274 號胺基酸由丙胺酸( alanine, Ala (A) )改變成蘇 胺酸( threonine, Thr (T) )─A1274T。此突變點在 Ensembl Genome brower 基因資料 庫(CANCER-GENOME, EVA-EXAC, PERLEGEN database)中有記錄，其發生頻率 G allele: A allele=12,1411:1 (EVA-EXAC database)，但至今尚無人報導在神經母細 胞瘤中發現此突變點。
4.2.2 ALK 突變基因型的表現
本研究發現 ALK 基因突變的樣本皆為 ALKWT/Mut+雜合子(圖三)，與先前報導
相似82。NB 檢體編號 168、203 及 277-L 與 NB 細胞株 SH-SY5Y 皆帶有 ALK F1174L 突變，從定序圖可見正常野生對偶基因(WT allele)和突變對偶基因(mutant allele) 在腫瘤中的訊號強度並非一致(圖三 a)。針對同病例/細胞株之 cDNA 樣本進行核
位具有 ALK 基因突變的的病人中，2 位為未分化神經母細胞瘤(佔該群病人的 18.2%)、3 位為部分分化神經母細胞瘤(佔該群病人的 13.6%)，剩下 2 位歸類為其 他(佔該群病人的 7.1%)。最後，7 位具有 ALK 基因突變的的病人中，有 4 位具有 MYCN 基因增幅 (佔該群病人的 30.8%)；3 位不具 MYCN 基因增幅(佔該群病人 的 6.8%)，以費氏精確檢定顯示 ALK 突變發生與 MYCN 增幅有明顯正相關(Odd Ratio：6.07、95% CI：1.15-32.20 及 p=0.0407)。以病患是否具有 ALK 突變(WT、
Mut+)分別和 NB 發病年紀(<18 months、>18 months)、病理組織學(UNB/PDNB、
others)進行費式精確檢定分析，皆不具統計上顯著差異(Age：p=1.0000、Histology：
p=0.4367)。綜合以上，在 NB 中 ALK 突變比較發生於 INSS Stage3/4，並與 INRG high-risk NB 以及 MYCN-amplified NB 顯著正相關。
4.2.4 ALK 基因多型性分析
將所有 DNA 檢體針對 ALK 基因 Exon20 到 Exon25 及其鄰近 Intron 部分分段 進行 PCR 後，進行核酸定序(Sanger’s sequencing)，除了從定序結果檢視 ALK 基 因突變外，亦檢視神經母細胞瘤病人腫瘤中 ALK 基因 Exon20 到 Exon25(包括鄰 近 Intron 部分)的單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)分布情 形，並與 34 個健康成人周邊血液單核球細胞(Peripheral blood monocyte cells, PBMCs)的 SNPs 分布做比較，本研究在 Exon20 到 25 間總共發現 6 個 SNPs (表四)。
3 個 SNPs 位在 ALK 基因 Exon20、21、23 的 coding region，屬於 Synonymous variants，
並未造成胺基酸改變：ALK Exon20 +3336 G/A 位點(rs146074150)之基因型為 G/G 及 G/A，對應之胺基酸為脯胺酸( proline, Pro (P) )，定序結果如圖四 a；61 位神經 母細胞瘤病患基因型人數分別為 G/G：60 人(98.4%)、G/A：1 人(1.6%)、A/A：0 人。而 34 位健康對照組基因型人數為 G/G：34 人(100.0%)、G/A：0 人、A/A：0 人(表四)。ALK Exon21 +3375 C/A (rs3795850)之基因型為 C/C、C/A、A/A，對應 之胺基酸為甘胺酸( glycine, Gly (G) )(圖四 a)；NB 病患基因型人數為 C/C：9 人
(14.8%)、C/A：23 人(37.7%)、A/A：29 人(47.5%)；而健康對照組基因型人數為 C/C：5 人(14.7%)、C/A：10 人(29.4%)、A/A：19 人(55.9%)(表四)。ALK Exon23 +3600 G/C (rs56247462)之基因型為 G/G 及 G/C，對應之胺基酸為甘胺酸丙胺酸( alanine, Ala (A) ) (圖四 a)；NB 病患基因型人數為 G/G：51 人(83.6%)、G/C：10 人(16.4%)、
C/C：0 人；健康對照組則是 G/G：30 人(88.2%)、G/C：4 人(11.8%)、C/C：0 人(表 四)。另外在 Intron20 及 25 部分則發現 3 個 SNPs，屬於 intron variant：ALK Intron20 第 6 位置的 C/T 位點(rs4622670)，基因型為 C/C、C/T 及 T/T (圖四 b)；NB 病患 基因型人數為 C/C：58 人(95.1%)、C/T：3 人(4.9%)、T/T：0 人；而健康對照組 為 C/C：31 人(91.2%)、C/T：2 人(5.9%)、T/T：1 人(2.9%)(表四)。此位點除了是 intron variant ， 也 是 splicing region variant (http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Exons?db=core;g=ENSG000001710 94;r=2:29223286-29223386;t=ENST00000389048;v=rs4622670;vdb=variation;vf=27 94666)。ALK Intron20 第 24 位置的 G/C 位點(rs2276550)，基因型為 G/G、G/C、
C/C (圖四 b)；NB 病患基因型人數 G/G：8 人(13.1%)、G/C：23 人(37.7%)及 C/C：
30 人(49.2%)；而健康對照組基因型人數 G/G：5 人(14.7%)、G/C：10 人(29.4%) 及 C/C：19 人(55.9%)(表四)。ALK Intron25 第 27 位置的 G/C 位點(rs3738868)，基 因型為 G/G、G/T 及 T/T (圖四 b)；NB 病患基因型人數 G/G：55 人(90.2%)、G/T： PCR, qPCR)偵測病人腫瘤中 ALK 基因相對表現量。所使用的參考基因(reference