民間常見的魚腥草用藥，過去有學者對其抗發炎研究是採用誘發
動物胸肋膜炎及耳朵水腫，本實驗以致炎劑carrageenan 造成小鼠足 蹠浮腫，由測其排水量得知發炎程度，分成給魚腥草粗抽物組及對照
組，及以 Indomethacin 當正對照組，實驗結果證實魚腥草粗抽物具
有抗發炎作用，在劑量100mg/kg 時的抗發炎活性大於 Indomethacin (4mg/kg) ( 如 Fig.6 所 示 ) 。 根 據 研 究 文 獻 指 出 ， 前 驅 發 炎 ( pro-inflammatory ) 物質與抗發炎 ( anti-inflammatory ) 物質之間
平衡失調時，過量的前驅發炎化學物質(chemokines)導致發炎的產生 [25]，長期慢性發炎可能促進血管新生[26]，進而演變為快速腫瘤的
生長，由此可知發炎與癌症之間具有密不可分的關聯[27-30]。
由於魚腥草具抗發炎作用，是否也具抗癌作用呢？由過去的研究
文獻記載，魚腥草確實對一些人類的癌細胞株，如非小細胞肺癌(A549 細胞)、卵巢癌 ( SK-OV-3 細胞 )、黑色素瘤 ( SK-MEL-2 細胞 )、
中樞神經系統癌細胞( XF-498 細胞) 和結腸癌 ( HCT-15 細胞 ) 產 生抑制生長效果 [13]，可惜的是沒有把抗癌作用機轉做詳盡研究，
這激起了我們對魚腥草是如何達到抑制癌細胞作用產生興趣。在台灣 肺癌從1997 到 2007 年幾乎是國人十大癌症死因之首[15]，目前臨床
上對於肺癌之治療多使用化學治療 ( chemotherapy ) 及放射性療法 [31, 32]，皆有其副作用，因此，本研究擬探討魚腥草對於肺癌細胞 之作用及其可能機轉，以期能提供魚腥草在臨床應用之參考。
首先選用了2 株非小細胞肺癌 A549 ( 來自人類 ) 和 LLC ( 來
自老鼠 ) 做存活率測試，由 MTT 試劑分析結果得知，魚腥草粗抽物 對A549 及 LLC 都具有明顯抑制生長效果 ( 由 Fig. 8 和 Fig. 9 之結 果可知 )，進一步研究針對 A549 細胞探討其作用機轉。由流式細胞 儀進行 A549 細胞存活率實驗，得到的結果 與 MTT 試劑分析相似 ( Fig. 10 和 Fig. 8 所示 )，兩者不同的分析方式在經過 48 小時的魚
腥草粗抽物劑量0.25 mg/ml 時，皆能抑制 50%的細胞存活；經過魚 腥草粗抽物處理的A549 細胞與對照組相比較，在倒立式光學顯微鏡 下觀察，發現其細胞形態隨著時間和劑量的增加，A549 細胞部分變 得不完整、碎小且不貼壁 ( Fig.11 )，當細胞受到損傷時，可能進行 凋亡或壞死[33-35]，觀察外在細胞形態的變化，只能看到細胞較小且 皺縮破裂[36, 37]。
為了進一步了解魚腥草造成 A549 細胞死亡之作用及其可能機
轉，本研究以魚腥草粗抽物處理過之A549 細胞進行其細胞週期的變 化，以進一步探討魚腥草之抗癌機制。細胞週期生長的控制有賴於週
[38]，而細胞週期可區分為休眠期 ( G0 phase )、第一間期 ( G1 pahse )、合成期 ( S phase )、第二間期 ( G2 pahse ) 和分裂期 ( M phase )，這些複合物( Cyclins / CDKs ) 在各期分別是: G1 期會大量 表現的 cyclinD /cdk4 或 cyclinD / cdk6;在晚期 G1 進入初期 S 期則 是由cyclinE /cdk2 負責; S 期中大量表現 cyclinA / cdk2;在 G2 和 M 期是cyclinA / cdc2(cdk1) 或 cyclinB / cdc2 (cdk1)。另一種調控蛋白 質稱週期素依賴性激酶抑制劑 ( CDKI )，包括 2 大家族: INK4 ( Inhibitor of Cdk4 ) 家族，成員有 p16INK4A 、p15 INK4B、p18 INK4C和
p19 INK4D，全都是特異性鍵結在 Cdk4 和 Cdk6； CIP/KIP ( Cdk
Interacting Protein/ Kinase Inhibitory Protein ) 家 族 ， 成 員 有 p21CIP1、p27KIP1 和 p57KIP2，較廣泛鍵結在 CDK4、CDK6、CDK2 和Cdc2。當 CDKI 與 Cyclins / CDKs 複合物結合時，會導致細胞週 期的停止[39, 40]，依據研究發現 p21CIP1過量表現會引起細胞週期停 滯在 S 期 [41]，而 p27KIP1 過量表現引起細胞週期停滯在 G1/S 期 [42]，且兩者皆會誘導細胞進行凋亡作用[42]。
臨床上抗癌藥可分細胞週期專一性與非專一性藥物，專一性藥
物例如:抗代謝藥物 ( Antimetabolites ) [43-45] 對 S 期最具作用，抗 生素類( Antibiotics ) [46]的 Bleomycin 可導致細胞停滯在 G2 期[47]，
長春花鹼 ( Vinca alkaloids ) 抑制 G2 分裂期中的微小管、半合成之
普達非倫生物鹼類 ( podohyl alkaloids ) 的 Etoposide 可阻斷較後期 S-G2 期; 非專一性藥物例如:烷化製劑 ( Alkylating agents ) 的 Mechlorethamine 及其他化學治療劑 Cisplatin 對正在進行增殖的細
胞較敏感，尤其是 G1 與 S 期[48]。經過魚腥草粗抽物處理的 A549 細胞，以流式細胞儀分析，發現隨著魚腥草粗抽物劑量與時間的增
加，在 G1 或 S 期產生蓄積現象，顯示魚腥草粗抽物可使 A549 細胞
週期停滯在G1/S 生長期 ( 如 Fig.12、Fig.13 和 Fig.14 所示 ) 。 Grimison 等 2000 年曾指出肺癌細胞之抑制與 cip/kip 蛋白重新
分布而抑制了CDK2 之表現，而使細胞停滯於 G1 期 [49]。如 Fig.34 [50] 所示，與細胞週期 G1/ S 期相關之 cyclin D / CDK4 /CDK6、cylin E /CDK2 和 cyclin A/CDK2 複合蛋白質受到 p53, Myc 蛋白質和 cip / kip 家族 ( 包括 p21, p27, p57 ) 與 Ink4 家族 ( 包括 p15, p16, p18, p19 ) 所調控，其中 p53 蛋白質影響 cip / kip 家族，可以抑制 cyclins/
CDKs 複合蛋白質，而 Ink4 家族主要是抑制 D-型的 cyclin / CDK 複
合蛋白質，負向調節細胞週期，抑制細胞的增生；Myc 蛋白質則是 正向調節細胞週期，促進細胞的增生[49]。利用西方墨點免疫轉漬技 術 ( western blot )，將細胞週期相關的蛋白質表現出來，實驗結果顯 示A549 細胞其 G1/S 期相關之 cyclin D1、cylin E 、cyclin A 和 CDK4
( 如 Fig.17 所示 )，p27KIP1 蛋白質表現量則隨魚腥草粗抽物劑量增 加而增加 ( 如 Fig.26 所示 )，由此可知，魚腥草對 G1/ S 期之作用 乃與影響前述G1/S 期相關之蛋白質表現有關。
Fig.34. Cell cycle regulation and differentiation.[50]
由本研究發現魚腥草粗抽物可使 A549 細胞之細胞週期停止及死
亡，因此進一步探討魚腥草造成 A549 細胞死亡的作用機轉。利用 Annexin V-FITC/PI 試劑進行雙染，當細胞進行凋亡早期時，磷脂絲 氨酸（phosphatidylserine，簡稱 PS）會外露於細胞膜外，Annexin V 對磷脂絲氨酸有親和性，利用與標定螢光物質（FITC）結合後，可
使 用 螢 光 顯 微 鏡 或 流 式 細 胞 儀 偵 測 細 胞 凋 亡 的 發 生 ； 碘 化 丙 啶
（Propidium Iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細 胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細 胞核染紅[51, 52]。因此將 Annexin V 與 PI 合併使用，即可將處於 不同凋亡時期的細胞區分開來。由實驗結果顯示，加入魚腥草粗抽物
引起 24、48、72 小時 A549 細胞的凋亡並不明顯，而是出現在較晚
期的凋亡 ( 如 Fig.15 和 Fig.16 所示 )。細胞進行凋亡作用可透過內 在路徑 ( intrinsic pathway) 或外在路徑 ( extrinsic pathway)。細胞 質 內 的 一 種 轉 錄 因 子 稱 p53， 它 是 一 種 腫 瘤 抑 制 基 因 ( tumor suppressor gene )，當細胞接受死亡訊息時，會活化增加 p53 蛋白質
的表現，促進凋亡性蛋白質 Bax/Bak 增加，同時抑制抗凋亡性蛋白 質Bcl-2/Bcl-XL 的表現，再使細胞內的粒腺體外膜通透性增加，釋放 出cytochrom c 或 AIF ( apoptosis inducing factor )，接著誘導凋亡性
蛋白質caspase 活化，造成細胞核的改變，進而使細胞進行凋亡作用，
此稱之為粒線體之凋亡路徑，即為細胞凋亡的內在路徑 ( intrinsic pathway) [53, 54] ；若是細胞死亡訊息藉由死亡受體接收，則會透過 Fas/Fas ligands 作用，造成下游的凋亡性蛋白質 caspase 活化，使細 胞進行凋亡作用，稱之細胞凋亡的外在路徑 ( extrinsic pathway )[55,
caspase 8 的表現量隨魚腥草粗抽物劑量增加而增加，而 Bax, Bcl-2, caspase 9 蛋白質則未偵測到有表現，因此推測魚腥草粗抽物造成
A549 細胞凋亡可能來自於外在路徑 ( 如 Fig.36 所示 )。
從魚腥草全株分離出大約有 44 種化合物 [57]，由其粗抽物對
A549 細胞的毒性作用，推論可能是來自魚腥草所含生物鹼成份，再
經測試5 種魚腥草所含生物鹼，結果發現其中 3 種生物鹼對 A549 細
胞抑制效果較顯著，於是就以這 3 種魚腥草所含生物鹼: aristolactam BII , aristolactam AII 以及 noraristolodione ，來探討其對 A549 細
胞之作用，結果顯示 A549 細胞經過不同濃度的 3 種魚腥草所含生物 鹼處理 24 小時後，皆使 A549 細胞存活率下降 ( 由 Fig.27 可知 )。
以流式細胞儀分析出細胞週期的變化，A549 細胞在 aristolactam BII 和 aristolactam AII 的處理之下，發現 S 期或 G2/M 期產生蓄積，
也就是細胞週期的生長停止在 S 期或 G2/M 期 ( 由 Fig.28-29 可 知 )；而在 noraristolodione 的處理之下，結果使得 A549 細胞之週期 停滯在S 期 ( 如 Fig.30 所示 )，同時這 3 種魚腥草所含生物鹼在劑 量50 µg/ml 時，會促進 A549 細胞產生凋亡現象。
藉由電泳跑膠及免疫轉漬方式來呈現蛋白質的表現量，結果顯 示aristolactam BII 和 aristolactam AII 在 S 期或 G2/M 期的 cyclinE, cyclinA, CDK2, Cdc 2 蛋白質隨劑量增加而漸減，而控制細胞週期的
p21, p27, p53 隨劑量增加而漸增，與細胞凋亡有關的蛋白質 caspase 3, caspase 8, Bax 隨劑量增加而漸增，Bcl-2 則隨劑量增加而漸減 ( 如 Fig.31-32 所示 )；noraristolodione 在 S 期的 cyclinE, cyclinA, CDK2 隨劑量增加而漸減，而控制細胞週期的 p21, p27, p53 隨劑量
增加而漸增，與細胞凋亡有關的蛋白 caspase 3, caspase 8, Bax 隨劑 量增加而漸增，Bcl-2 則隨劑量增加而漸減 ( 如 Fig.33 所示 )。p53 是一種轉錄因子，是負責調控細胞正常生長與進行凋亡之間的平衡，
在癌細胞中存在大量的變異性 p53[58, 59]。由實驗結果可知，魚腥草 所含之生物鹼會經由影響細胞週期相關蛋白質及細胞凋亡有關之蛋 白質而抑制A549 細胞之活性，可能是一方面透過活化 p53 而促使 p21 / p27 增加，讓 A549 細胞週期停滯，另一方面藉由增加 Bax, caspase
8 , caspase 3 的表現及降低 Bcl-2 活性 [60]。
由 以 上 實 驗 結 果 顯 示 ， 魚 腥 草 粗 抽 物 與 其 所 含 生 物 鹼 ( aristolactam BII, aristolactam AII 以及 noraristolodione ) 對 A549 細胞可能的生長抑制機制: 藉由腫瘤抑制性蛋白質 p53 的增加，促使 控制細胞週期的p21, p27 蛋白質增加，一方面降低 A549 細胞之週期 中的 cyclinE, cyclinA, CDK2 蛋白質，另一方面增加凋亡性蛋白質 caspase 3, caspase 8 和 Bax，降低抗凋亡蛋白質 Bcl-2，綜合本研究之
Hottuynia corda
A549 cells ( DNA damage )
p 53 ↑
p 21 / p27
↑
Cell cycle arrest Apoptosis ( cyclinE↓, cyclinA↓, CDK2↓) ( caspase 3↑, caspase 8↑
and Bax
↑, Bcl-2 ↓)
Fig.35 The possible action mechanism of Hottuynia cordata.
Fig.36 Possible action site of Hottuynia cordata on cell apoptosis pathway.
Hottuynia cordata
Hottuynia cordata