魚腥草對肺癌細胞之活性及作用機轉研究; Bioactivities and action mechanisms of Hottuynia cordata on lung cancer cells
103
0
0
全文
(2) 致謝. 首先感謝成功大學 吳天賞教授，提供魚腥草生物鹼幫助我在實 驗上完成作用機轉之初探，以及擔任口試委員，提供論文修正之寶貴 意見。感謝蔡輝彥教授以及我的指導教授 陳玉芳老師，在實驗過程 中的指導，給予批評與指教，讓這份碩士論文可以如期完成。 在研究所二年，有同窗好友鈺亭及俏媽咪郁玟學姐，跟我一起努 力學習；學術指導兼朋友的宏柏學長，讓我討教實驗上的技術；學姐 兼玩伴的易鮮、玟玲、姿秀、佳慈及助理靜怡，可以一起吃飯聊天； 可愛聽話的延杰學弟及奕鈞學妹，減輕了我實驗上的負擔；還有亦師 亦友的湯智昕老師與藥理科總管柯毅文大哥，謝謝你們陪我度過這些 日子，使枯燥的生活增添許多色彩與笑聲。 從職場再回到學校進修，特別要感謝開明先進的永昌爸爸、春 櫻媽媽，天真開朗的阿球爺爺，努力勤奮的文姿大姐，活潑美麗的惠 娟大妹、淑娟小妹和彭熙帥弟弟，讓我順利完成學業而無後顧之憂。.
(3) 目錄. 圖目錄-----------------------------------------------------------------IV 表目錄-----------------------------------------------------------------IX 縮寫表------------------------------------------------------------------X 中文摘要-------------------------------------------------------------XII 英文摘要------------------------------------------------------------XIV 第一章. 緒論. 第一節 魚腥草之簡介------------------------------------------------------1 第二節 肺癌之簡介---------------------------------------------------------5 第三節 細胞週期-----------------------------------------------------------14 第四節 研究動機-----------------------------------------------------------17. 第二章. 總論. 第一節 實驗材料及設備--------------------------------------------------19 第二節 實驗方法-----------------------------------------------------------24 一、 小鼠足浮腫-抗發炎實驗----------------------------------------25 二、動物急性毒性測試 ( LD50 )------------------------------------25 三、 細胞存活測試 ( MTT 與 PI 試劑分析 )----------------------25 I.
(4) 四、 細胞型態的觀察--------------------------------------------------27 五、 細胞週期分析-----------------------------------------------------27 六、 Annexin V-FITC/PI 試劑雙染----------------------------------29 七、 西方墨點 ( western blot ) 分析-------------------------------30. 第三節 資料統計與分析----------------------------------------------------32. 第三章 結果 第一節 魚腥草粗抽物之生理活性 一、 魚腥草粗抽物抗發炎作用--------------------------------------33 二、 魚腥草粗抽物對小鼠之急性毒性作用-----------------------33 三、 魚腥草粗抽物對 A549 細胞或 LLC 細胞存活率的影響---34 四、 魚腥草粗抽物對 A549 細胞於形態學上的改變------------34 五、 魚腥草粗抽物對 A549 細胞之週期的影響------------------35 六、Annexin V-FITC/PI 試劑雙染呈現 A549 細胞死亡情況----35 七、魚腥草粗抽物對 A549 細胞之週期相關及凋亡相關蛋白質 的影響--------------------------------------------------------------36. 第二節 魚腥草所含生物鹼之生理活性 一、 魚腥草所含生物鹼對 A549 細胞存活率的影響------------58. II.
(5) 二、 魚腥草所含生物鹼對 A549 細胞之週期的影響------------58 三、 魚腥草所含生物鹼對 A549 細胞之週期相關及凋亡相關蛋 白質的影響-------------------------------------------------------58. 第四章 討論--------------------------------------------------------70 第五章 結論--------------------------------------------------------80 第六章 參考文獻--------------------------------------------------82. III.
(6) 圖目錄. Fig.1. Hottuynia cordata THUNB ( Saururaceae; HC )------------------------1 Fig.2.歷年惡性腫瘤死亡人數占率趨勢圖-----------------------------------6 Fig.3. 96 年及 97 年台灣主要前十大死因及人數--------------------------6 Fig.4. 97 年台灣主要癌症死亡率----------------------------------------------7 Fig.5. Cell cycle ------------------------------------------------------------------15 Fig.6. The effect of Hottuynia cordata ( HC ) crude extract on carrageenan-induced paw edema in mice.-----------------------------37 Fig.7. The acute toxicity of Hottuynia cordata ( HC ) crude extract in mice.-----------------------------------------------------------------------38 Fig.8. Effect of HC-crude extract on the cell viability of human lung carcinoma cells (A549) by MTT assay.-------------------------------39 Fig.9. Effect of HC-crude extract on the cell viability of murine lung cancer cells (LLC). Cell viability was detected by MTT assay.---40 Fig.10. Effect of HC-crude extract on the cell viability of human lung carcinoma cells (A549) by Flow Cytometry.------------------------41 Fig.11. Effect of HC-crude extract on the cell morphology of human lung carcinoma cells (A549).------------------------------------------------42 IV.
(7) Fig.12. Alternation of HC-crude extract on cell cycle distribution of A549 cells for 24h.-------------------------------------------------------------43 Fig.13. Alternation of HC-crude extract on cell cycle distribution of A549 cells for 48h.-------------------------------------------------------------44 Fig.14. Alternation of HC-crude extract on cell cycle distribution of A549 cells for 72h.-------------------------------------------------------------45 Fig.15. Effects of HC-crude extract on the cell vaibility of A549 cells. A549 cells were treated with HC-crude extract and were stained with Annexin V conjugated FITC and PI. Cell viability was measured by using Flow Cytometer.--------------------------------46 Fig.16. Effect of HC-crude extract on the cell viability of A549 cells. A549 cells were treated with HC-crude extract for different time (A) 24h (B) 48h (C) 72h and were stained with Anexin V conjugated with FITC and PI.-----------------------------------------47 Fig.17. Suppression of CDKs and cyclins and up-regulation of p27, caspase 8, caspase 3 by HC-crude extract treatment. A549 cells were treated with various concentration of HC-crude extract for 48h.-----------------------------------------------------------------------48 Fig.18. Suppression of cyclin D1 by HC-crude extract treatment on A549 V.
(8) cells for 48h by immunoblotting.-------------------------------------49 Fig.19. Suppression of cyclin E by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.-------------------------------------50 Fig.20. Suppression of cyclin A by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.-------------------------------------51 Fig.21. Suppression of CDK 4 by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.-------------------------------------52 Fig.22. Suppression of CDK 6 by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.-------------------------------------53 Fig.23. Suppression of CDK 2 by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.-------------------------------------54 Fig.24. Up-regulation of caspase 8 by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.------------------------------55 Fig.25. Up-regulation of caspase 3 by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.------------------------------56 Fig.26. Up-regulation of p27 by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.The blot of β-actin was used as loading control.----------------------------------------------------------57 Fig. 27 Effect of aristolactam BII, aristolactam AII, piperolactam A, VI.
(9) norcepharadione B and noraristolodione on the cell viability of human lung cancer cells (A549) for 24 h. Cell viability was detected by MTT assay.------------------------------------------------60 Fig.28. Effects of aristolactam BII on A549 cell cycle distribution. aristolactam BII treatment for 24h altered A549 cell cycle distribution and arrested at S/G2/M phase..-----------------------61 Fig.29. Effects of aristolactam AII on A549 cell cycle distribution. aristolactam AII treatment for 24h altered A549 cell cycle distribution and arrested at S/G2/M phase.--------------------------62 Fig.30. Effects of noraristolodione on A549 cell cycle distribution. Noraristolodione treatment for 24h altered A549 cell cycle distribution and arrested at S/G2/M phase.------------------------63 Fig.31. Suppression of CDKs, cyclins, Bcl-2 protein expression and up-regulation of apoptosic protein expression ( caspase 3, caspase 8 and p21, p27, p53 and Bax) by aristolactam BII treatment. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam BII for 24h-----------------------------------------------64 Fig.32. Suppression of CDKs, cyclins, Bcl-2 protein expression and up-regulation of apoptosic protein expression ( caspase 3, VII.
(10) caspase 8 and p21, p27, p53 and Bax ) by aristolactam AII treatment. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam AII for 24h. ---------------------------------------------66 Fig.33. Suppression of CDKs, cyclins, Bcl-2 protein expression and up-regulation of apoptosic protein expression (caspase 3, caspase 8. and. p21,. p27,. p53. and. Bax). by. noraristolodione. treatment.A549 cells were treated with various concentration of noraristolodione for 24h. ---------------------------------------------68 Fig.34. Cell cycle regulation and differentiation.----------------------------74 Fig.35. The possible action and mechanism of Hottuynia cordata.-------78 Fig.36. Possible action site of Hottuynia cordata on cell apoptosis pathway. ------------------------------------------------------------------79. VIII.
(11) 表目錄. Table 1. 台灣主要癌症死亡原因的統計-------------------------------------7 Table 2. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam BII for 24h and the expression of cell cycle-related and apoptosis proteins -----------------------------------------------65 Table 3. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam AII for 24h and the expression of cell cycle-related and apoptosis proteins------------------------------------------------67 Table 4. A549 cells were treated with various concentration of noraristolodione for 24h and the expression of cell cycle-related and apoptosis proteins------------------------------------------------69. IX.
(12) 縮寫表. A549---------Human lung adenocarcinoma cell AP------------Ammonium persulfate CDK---------Cyclin dependent kinase CDKI--------Cylin dependent kinase inhibitory protein DMSO-------Dimethyl sulphoxide ECL----------Enhanced chemiluminescence EDTA--------Ethylenediaminetetraaccetic acid ELISA-------Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FBS-----------Fetal bovine serum FACS---------Fluorescence Activated Cell Sorting HC------------Hottuynia cordata KIP-----------Kinase inhibitory protein LLC----------Lewis lung carcinoma cell ( Murine) LD50---------50% Lethal Dose MTT----------3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide NE-------------Nitrocellulose membrane PBS-----------Phosphate buffered saline X.
(13) P/S------------Penicillin/Streptomycin PI--------------Propidium iodine PVDF---------Polyvinylidene difluoride SDS-PAGE--Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED------N-N-N’-N’-Tetramethylenediamine. XI.
(14) 摘要. 肺癌於台灣居十大死亡癌症首位，除了現今的化學療法，中草藥 之使用或許對肺癌有其參考價值。在台灣，魚腥草是一種很常用的中 草藥，它被廣泛的應用在各類的疾病。回顧相關文獻記載：魚腥草具 有許多作用，包括:抗發炎、抗氧化、抗病毒、免疫調節作用、抗急 性呼吸窘迫症候群、抗菌和抗腫瘤活性。然而未見有文章陳述魚腥草 對抗肺癌的作用，因此本研究目的在評估魚腥草抗肺癌之可能的作用 與機轉。使用 ICR 品系的小鼠進行腳蹠浮腫實驗以評估魚腥草之抗 發炎作用，並選用 2 株肺癌細胞 A549 和 LLC 細胞，進行有關魚腥 草對肺癌細胞的存活率，對肺癌細胞形態的改變，對細胞週期之影 響，以及造成肺癌細胞凋亡的作用探討；並分析魚腥草對細胞週期及 細胞凋亡相關蛋白質之影響，以評估魚腥草對肺癌細胞之作用及其可 能之機轉。 利用人類肺癌細胞株 A549 和小鼠肺癌細胞株 LLC 進行抗癌活性 評估，結果發現魚腥草粗抽物具有抑制肺癌細胞活性之作用。由人類 的肺癌細胞株 (A549) 之實驗結果得知：魚腥草的粗抽物會引起人類 肺癌細胞 (A549) 細胞週期的停止，其作用可能是透過向下調節細胞 週期中的 G1 期相關的蛋白質所致。又魚腥草含有數種生物鹼，以其 XII.
(15) 中對 A549 細胞較具抑制效果的 3 種 Aristolactam BII, Aristolactam AII 和 Noraristolodione 進 行 作 用 之 分 析 ， 研 究 發 現 這 些 生 物 鹼 ( Aristolactam BII, Aristolactam AII 和 Noraristolodione )會使 A549 肺 癌細胞之細胞週期在 S 或 G2/M 期產生蓄積作用，使相關的蛋白質 向下調節。由本實驗結果可知，魚腥草粗萃取物及其所含生物鹼成分 Aristolactam BII, Aristolactam AII 和 Noraristolodione 對於人類非小 細胞肺癌細胞株 A549 細胞的影響，主要是透過造成肺癌細胞週期生 長停滯及誘導凋亡。. XIII.
(16) Abstract. Lung cancer is the leading cause among the top ten-cause of death in Taiwan. Besides the currently used chemotherapy, herbal medicine may play a role in the treatment of lung cancer. Hottuynia cordata THUNB (Saururaceae; HC), one of the frequently used herbal medicine in Taiwan, has been widely used in various diseases. Review from literatures, HC had many effects, including anti-inflammatory, anti-oxidative, anti-viral, immunomodulatory, anti-SARS, anti-bacterial and anti-tumor activities. However, there is no literatures describe its effect on lung cancer. The aim of my present study is to evaluate the possible effect and action mechanism of HC on lung cancer. A549 and LLC lung cancer cell lines were used to evaluate the effects of HC on the cell viability and possible anti-tumor effects,and SD rats were used in anti-inflammation study. The methods of experiment, including paw edema, cell viability, cell morphology, cell cycle, cell apoptosis and protein expression. We used A549 and LLC cells in the evolution of anticancer activity, and found that HC-crude extract showed inhibitory effect on cell viability of A549 and LLC cells. In order to look into the possible potential and action mechanism of HC on human lung cancer, human lung cancer A549 cells were used. Results from our study, HC treatment causes cell cycle arrest of A549 cells. The inhibition of cell cycle might be via the down-regulating of G1 phase related protein levels such as cyclinD1, cyclinE, cyclinA, CDK4, CDK6, and CDK2. Additionally, HC causes A549 cell apoptosis via caspase-8 and P27 expression. The anti-tumor effect of HC-crude extract and active compounds (aristolactam BII, aristolactam AII and noraristolodione ) on human lung carcinoma A549 cell line is via cell cycle arrest and late apoptosis.. XIV.
(17) 第一章 緒論. 第一節 魚腥草之簡介. 一、魚腥草型態與分佈[1]. Fig.1 Hottuynia cordata THUNB ( Saururaceae ) 魚腥草為三白草科 ( Saururaceae ) 植物蕺菜屬 Houttuynia cordata THUNB ( 以下簡稱 HC ) 的帶根全草，多年生腥臭草本。高 15~50cm，通常分佈於田埂、路旁及河邊潮濕地方，適應性廣、遍及 全台灣，為台灣常用之民間藥用植物之一。別名有很多，如岑草《吳 越春秋》 ，蕺《別錄》 ，菹菜《新修本草》…等，台灣稱臭臊草，大部 份為栽培品，部份山區為野生狀。目前市售的魚腥草大多是以人工栽 培方式供應，全草可供藥用，具有清熱、解毒、消腫、利尿、治水腫、 1.
(18) 淋病、梅毒、尿道炎、子宮炎等效用；外敷治惡瘡、癬疥、痔瘡及溼 疹等。. 二、魚腥草的文獻考察 回顧魚腥草研究相關文獻，發現其具有下列作用:. 1.抗發炎作用 魚腥草的水層粗抽物具有抗發炎活性，對於 RAW264.7 細胞株所 產生發炎的前驅物質一氧化氮 ( nitric oxide; NO ) 和腫瘤壞死因子 ( tumor necrosis factor alpha; TNF-α ) 具有抑制作用 [2]; 魚腥草注射 液( HC injection ) 可以抑制 carrageenann 所致大鼠肋膜炎及 xylene 造成小鼠耳朵水腫 [3]。. 2.抗氧化作用 魚腥草中的多酚成分具抗氧化作用，如類黃酮成分可使患有糖尿 病的病人因氧化壓力所產生的自由基分解 [2, 4]; 魚腥草中的水層粗 抽物對於藥物 bleomycin 氧化作用所引起的肺部纖維化具有保護作用 [5]。. 3.抗病毒活性 對抗腸病毒 71 型，魚腥草可以減少病毒斑塊形成 ( plaque 2.
(19) formation ) 和減少病毒 RNA 合成，增加病毒凋亡作用 [6]; 還可以降 低泡疹病毒 ( HSV-2 型 ) 的複製作用，達到具抗病毒感染活性 [7] 。. 4.抗白血病作用 魚腥草熱水萃取物能有效的抑制人類的白血病細胞的生長[8] 。. 5.免疫調節與抗嚴重急性呼吸窘迫症候群 ( SARS ) 作用 魚腥草水層萃取物可刺激小鼠脾臟淋巴細胞而增生，藉增加臟淋 巴細胞 IL-2 和 IL-10 的分泌作用,同時增加免疫系統的 CD4+ 和 CD8+ T 細胞；在抗病毒方面是抑制 SARS-CoV 3C-like protease ( 3CLpro ) 和 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) [9] 。. 6.抗過敏反應 魚腥草水層粗抽物可以抑制 compound 48/80 所誘導小鼠全身性 過敏反應，藉由肥大細胞的去顆粒化作用 ( mast cell degranulation ) 以及抑制大鼠週邊肥大細胞的組織胺釋放 ( histamine release ) 和鈣 的再吸收 ( calcium uptake ) [10] 。. 7.抗菌作用 魚腥草的水層萃取物可以對抗在巨噬細胞 ( RAW 264.7 cell ) 內的沙門氏菌感染 [11]; 及抗葡萄球菌 [12] 。 3.
(20) 8.抗腫瘤活性 由 甲 醇 萃 取 魚 腥 草 所 得 的 6 種 活 性 生 物 鹼 :aristolactam B, piperolactam A, aristolactam A, norcepharadione B, cepharadione B and splendidine，可以有效抑制 5 株人類癌細胞株: 非小細胞肺癌 ( A549 ), 卵巢癌 ( SK-OV-3 ),黑色素瘤 ( SK-MEL-2 ),中樞神經系統癌細胞 ( XF-498 ) 和結腸癌 ( HCT-15 ) 的生長 [13]，但並未有作用機轉之 探討。. 4.
(21) 第二節 肺癌之簡介. 一、前言[14]. 在台灣惡性腫瘤已經連續 27 年蟬聯十大死因之首，而且死亡人 數逐年增加 ( Fig.2 )，至今續居國人十大死因之首 ( Fig.3 )，如何預 防及有效地治療，以降低其發生率和死亡率，是目前醫學研究上重要 的一門課題。. 二、肺癌[14]. 由行政院衛生署從 1997~2007 年的主要癌症死亡原因統計資料 ( Table 1 ) 顯示，肺癌名列前茅,每年死亡的人數居高不下。大多數早期 的肺癌患者沒有明顯症狀，故只有約 5~15%的人被早期發現，病人大多 數是男性，男與女之比約為 4～8：1，患者年齡大多在 50 歲以上。致 癌假說錯綜複雜，很難以單一因子來加以解釋，由研究得知吸菸是造成 肺癌的最重要因子，抽菸的人比不抽菸的人發生肺癌的危險高達 20 倍， 目前肺癌 5 年的存活率約 15%左右。最新各癌症粗死亡率排序，97 年十 大主要癌症順位分別為 ( Fig.4 )：(1) 肺癌 (2) 肝癌 (3) 結腸直腸癌 (4) 5.
(22) 女性乳癌 (5) 胃癌(6) 口腔癌 (7) 攝護腺癌 (8) 子宮頸癌 (9) 食道癌 (10) 胰臟癌，順位與去年(96 年)相同。 圖19.歷年惡性腫瘤死亡人數占率趨勢圖. % 35.0 33.0 31.0 29.0. 28.5. 28.2 27.3. 27.3. 27.0. 27.1. 26.6. 24.8. 25.0. 25.5. 25.3 25.4 22.8. 23.0. 24.0. 全體 男. 22.7 21.9. 21.0 19.2. 18.2. 17.0. 女. 20.5. 18.7. 19.0. 17.8. 16.6. 16.4. 15.0 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97年. Fig.2. 歷年惡性腫瘤死亡人數占率趨勢圖. 人. 圖 3. 96年及97年主要死因死亡人數. 45,000 38,913. 40,000. 37,762. 35,000 30,000 25,000. 97年 96年. 20,000 15,726. 15,000. 15,277. 10,663. 10,731. 8,661. 10,000. 8,036 7,772. 7,773. 7,077 7,441. 5,374. 5,314. 4,917 5,091. 5,000. 4,128 3,930. 4,012 3,983. 病 群 候 症 病. 腎. 意. 、 炎 腎. 6. 腎 及. （ 害 傷 我 自. 慢. 蓄. Fig.3. 96 年及 97 年台灣主要前十大死因及人數. 變. ） 自. 硬 肝 及 病 肝 性. 下 性 慢. 殺. 化. 病 疾 呼. 腦. 吸. 意. 道. 外. 糖. 事. 尿. 故. 病. 炎. 血. 肺. 病 疾 管. 疾 臟 心. 惡. 性. 腫. 病. 瘤. 0.
(23) Table 1. 從 1997 至 2007 年台灣主要癌症死亡原因的統計 西 1997 元. 1998. 1999. 2000. 2001. 2002. 2003. 2004. 2005. 2006. 2007. 當 年 死 119385 119116 121991 121181 126653 126936 12878 133679 138957 1350171 139376 亡 人 數 癌 29011 29260 29784 31554 32993 34342 35201 36357 37222 症 (24.3) (24.0) (23.8) (25.4) (26.1) (27.1) (27.1) (27.2) (26.8). 37998 (28.1). 40306 (28.9). 肺 5857 5749 5959 6261 6555 6846 6911 7153 7302 癌 (20.2) (19.7) (20.0) (19.1) (19.9) (19.9) (19.6) (19.4) (19.6). 7479 (19.7). 7993 (19.8). 肝 5842 5865 5762 6001 6415 6943 7010 7059 7108 癌 (20.0) (20.0) (19.4) (19.0) (19.4) (20.2) (19.9) (19.4) (19.1). 7415 (19.5). 7809 (19.4). 大 2855 腸 (9.8) 癌. 4284 (11.3). 4470 (11.1). 2987 3128 3376 3457 3649 3711 3898 4111 (10.2) (10.5) (10.7) (10.5) (10.6) (10.5) (10.7) (11.0). [註 1] ( ) : 死亡百分比 (%) [註 2] 暗色空格: 當年度表示在國內為十大癌症死亡原因第一名。. 每十萬人口 死亡率 36.00. 圖 20. 97年主要癌症死亡率. 33.8. 33.3. 32.00 28.00. 26.8. 26.3. 24.00. 粗死亡率 20.00. 18.5. 16.00. 標準化死亡率 14.4. 13.5 10.7. 12.00. 10.0. 9.6 7.8. 7.6. 8.00. 7.7. 6.2. 5.7. 6.2 4.7. 5.0. 5.9. 4.00. Fig.4. 97 年台灣主要癌症死亡率 7. 癌 胰 臟. 癌 食 道. 癌 頸. 腺. 癌. 子 宮. 口 咽 癌 (含 口 腔. 附 註：標準化死亡率係以W.H.O.2000年世界標準人口數為基準。. 攝 護. 及 下. 咽 ). 胃 癌. 癌 乳 女 性. 結. 腸 直. 腸 癌. 肝 癌. 肺 癌. 0.00. 4.7.
(24) 三、肺癌病因[15] 1. 抽菸[16] a. 每天吸煙 2 包達 20 年的男性，其罹患肺癌危險增加了 60-70 倍。 b. 吸煙時間愈長，量愈大，開始吸煙的年齡愈小，發病率與死亡率 愈高，其中吸煙時間長短比吸煙量多、少更為重要。 c. 在肺癌發生以前停止吸菸，肺組織可以慢慢恢復正常。 d. 吸菸者比起不吸菸者，有 30%的較大危險性會罹患肺癌。 2. 二手煙[17] a. 女性因吸入二手煙而罹患肺癌的風險高於男性(可高至 1.5 倍)。 b. 不吸菸的人吸入吸菸者吐出的煙，會增加罹患肺癌的危險性。 3. 氡、石棉、二氯甲基醚、多環芳香烴、鉻、鎳及有機砷化合物等 的致癌物。[18] a. 和石棉接觸的工人，有較高的危險性罹患肺癌。如果他們也吸 煙，罹患肺癌的危險性更大為增加。 4. 空氣污染 5. 廚房油煙 6. 遺傳因素 7. 肺部感染後引起發炎的後遺症 a. 肺結核與病毒 (HPV, ...) 感染 8.
(25) 四、臨床徵狀[19] 1. 新生或持續不停的咳嗽 (cough) (三個禮拜以上） 。 2. 持續性的胸部疼痛、肩膀痛或是背痛，通常深呼吸時情況更壞。 3. 痰的顏色改變或是痰中帶血或呈鏽色。 4. 哮鳴聲 ( wheezing )／呼吸會喘／呼吸困難 ( shortness of bronchus )／聲音嘶啞，特別是新發生的哮喘。 5. 不斷復發的肺炎 ( recurrent pneumonia ) 或是支氣管炎等重覆感 染。 6. 不明原因的發燒（罹輕度肺癌者也可能發生）。 7. 疲勞感 ( fatigue )、食慾變差 ( decreased appetite )、體重減輕 ( weight loss )。 8. 當肺癌擴散到遠處器官時，可能引起： 頭痛、骨頭痛、關節痛、 手臂或腿的軟弱或麻木，暈眩，甚至腹痛。. 五、肺癌的分類[20] 根據組織學類型肺癌的分類有兩大類型： 1. 小細胞肺癌 ( Small Cell Lung Cancer, SCLC ) 小細胞肺癌生長快速，易轉移擴散，對化療及放療敏感，但經治療 緩解後，多數病例在兩年內復發，復發後有抗藥性。. 9.
(26) 2. 非小細胞肺癌 ( Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC ) 肺癌常見，占全部肺癌患者的 75%，相對於小細胞肺癌，非小細胞 肺癌生長較緩，轉移也較慢，因此對化療及放療不敏感，多採用手 術治療。根據腫瘤細胞的形態又分成要主要三種： a. 肺腺癌 ( Adenocarcinoma )： 約占非小細胞肺癌的 50%，占第一位。台灣最常見的肺癌，也 是不抽菸 (女性和 45 歲以下的年輕人) 患者中最常見的類型。 常常是在有遠處轉移之後才出現臨床症狀，多由血路轉移。 包 括支氣管肺泡細胞癌 ( Bronchioaveolar carcinoma (BAC) ) 。 b. 肺鱗癌 ( Squameous cell cancer )： 約占非小細胞肺癌的 30%，占第二位。又稱表皮樣癌，常見於 男性吸菸者，早期多為局部向外延伸的轉移，後期則經血路擴 散。 c. 肺大細胞癌 ( Large cell cancer )： 具有外表不正常且大的細胞。在台灣少見，生長速度較緩慢， 會經由血路及淋巴擴散。. 六、肺癌的分期：[20] 1. 小細胞肺癌：分為侷限期和擴散期。. 10.
(27) a. 侷限期：是指癌細胞僅在一邊胸部或兩側頸部的淋巴結。 b. 擴散期：則是指癌細胞已跑到另一邊肺部或身體其他的器官。 2. 非小細胞肺癌： a. 第 1 期：癌細胞在肺部內,未有轉移。 b. 第 2 期：癌細胞已轉移至肺部淋巴,但沒有轉移至身體其他器官。 c. 第 3 期：癌細胞已轉移至另一側肺部的淋巴,但還沒有遠端器官 或組織的轉移。 d. 第 4 期：已有遠端器官組織的轉移如腦部、骨頭的轉移。. 七、肺癌治療的方法[21, 22] 1. 手術治療：如果被診斷為第 1、2 期的病患，通常建議趕快開刀切 除癌症部位，同時於手術後加上化療，以提高癌症治 癒的機會；如果是第 3 期的病患，可能會再手術前先 做化學治療或放射性治療，用意為讓腫瘤縮小後再進 行手術，可提高手術切除成功率。 2. 化學治療：主要是殺死癌細胞；因小細胞肺癌對化學治療藥物反 應敏感，所以多採用此種治療方法。而非小細胞肺癌 則用於無法手術切除的病患（第 3b、4 期患者） ，或有 些病患在手術後，發現縱膈腔淋巴有腫瘤細胞存在時. 11.
(28) 使用，通常會使用一種以上的化學藥物來治療病人。 3. 放射線療法：俗稱放療或電療，它是用高能量放射線去殺死癌細 胞；用於手術前縮小癌細胞的範圍，或手術後預防 癌細胞切除不完全，以降低腫瘤復發或轉移的機會； 有時會與化學治療合併使用。 4. 免疫生物療法：目前的免疫學療法，仍在試驗性，主要作用為刺 激病患本身產生對癌細胞的抵抗力，進而减慢癌 細胞生長或轉移的速度，目前使用的治療方法如: 干擾素…等。 5. 症狀治療：於治療中或當癌症的侵犯造成身體疼痛時，會使用止 痛劑來緩和疼痛情況。若有呼吸困難或咳嗽厲害，則 可用支氣管擴張劑或止咳劑來改善不舒服的症狀。 6. 雷射治療：當癌細胞會阻塞到呼吸道時，用雷射將癌細胞殺死， 以改善呼吸困難症狀，亦可用於止血 ( 癌細胞所造成 的出血 )，此種治療屬於緩解不舒服症狀的方法，只 能治標不能治本。 通常治療方式非單一進行，有時會合併 2-3 種方法同時進行，為 的是能使病患獲得最完整的治療。現今的治療以化療為主再加上標靶 治療為輔助，可以更加提高治療的效果。 12.
(29) 八、肺癌的預後[22] 一般說來，肺癌的預後通常是不好的，然而，科技不斷的進步， 第三代化學藥物的發展，在臨床上已證實可延長病患預期的生命週 期，甚至可達到完全消滅癌細胞，治癒癌症，雖然目前僅有少數的案 例，仍為肺癌患者帶來無限的希望，儘管肺癌在早期診斷上確實有很 大的困難度存在，仍期望在未來有更多藥物或治療方式的發展，能為 肺癌患者帶來更好的預後。. 13.
(30) 第三節 細胞週期. 一、前言[23]. 細胞分裂週期又稱細胞週期 ( cell cycle )， 是一連串嚴謹有規律 的步驟，細胞分裂的功能為生殖、生長與修補，完整的細胞分裂應包 括一個很長的生長期 ( 間期，interphase )，所費時間為一個細胞週 期中的 90%，在此期間，細胞會生長並複製染色體，作為有絲分裂 前 ( Mitosis,含細胞質分裂 ) 的準備；真核細胞週期可分成五個時 期，包括:G0、G1、S、G2、M 期 ( 如 Fig.5 所示 )。 G0 ( Gap 0 ) phase:靜止期，細胞離開細胞週期且停止分裂。 G1 ( Gap 1 ) phase:第一間期，細胞生長時期，此時細胞代謝活化， 複製所需胞器以及一些細胞質的組成，以供下一 階段複製染色體使用。 S ( Synthsis ) phase:合成期，DNA 進行複製的時期。 G2 ( Gap 2 ) phase:第二間期，此時細胞已具有兩倍的遺傳物質，並 為有絲分裂期做準備。 M ( Mitosis ) phase:分裂期，進行核裂 ( 染色體分離 ) 和質裂 ( 細 胞質分裂 ) 的階段。 14.
(31) Fig.5. Cell cycle 出自: https://eapbiofield.wikispaces.com/FRF+PR7. 二、細胞週期的調控[23] 細胞週期的進行可由不同的週期素 ( Cyclin ) 和週期素依賴性 激酶 ( Cyclin-dependent kinase; CDK ) 結合形成複合物 ( Cyclin /CDK complex ) 來調控，種類有許多，但只有 Cyclin A、B、D、E 和 CDK 1、2、3、4、6 能夠參與細胞週期。 這些 Cyclins /CDKs 複合物的表現量會隨著細胞週期的進行有 所變化，進而確認複合物於細胞週期調控的角色。如同 G1 期→S 期 →G2 期→M 期的進行，在 G1 期會大量表現的 cyclin D/CDK4 & 6 15.
(32) 漸漸地轉換成 Cyclin E/CDK 2， 進入 S 期初步是由 Cyclin E/CDK 2 調控，大部分的 S 期由 Cyclin A/CDK 2 所控制的，另外進入 G2/M 期是由 Cyclin B/CDK 1 所調控。Cyclins /CDKs 複合物決定細胞何 時進入下一個週期。 另外還有一種蛋白質，稱為週期素依賴性激酶抑制劑 ( Cyclin-dependent kinase inhibitor; CDKI ) 是細胞週期裡調控的蛋 白質，而此蛋白質則會和上述兩者所形成的複合物結合，因而使週期 素及週期素依賴性激酶分離造成細胞週期的停止。 癌細胞與一般正常細胞的最大差別是在於癌細胞能夠一直無限的 增生，而這就是癌細胞的細胞週期 ( cell cycle ) 已經不受正常的調控 最明顯的證據。如果能夠利用藥物去控制癌細胞的細胞週期，使癌細 胞停止增生，甚至使癌細胞進行程式性凋亡 ( apoptosis )，那麼就能夠 達到我們所預期的抗癌效果。. 16.
(33) 第四節 研究動機. 傳統藥用植物於民間被廣泛地應用疾病上的治療，通常這些藥草 都具多功能，例如分佈在台灣的魚腥草就有清熱、解毒、消腫、利尿、 治水腫、淋病、梅毒、尿道炎、子宮炎等效用；外敷治惡瘡、癬疥、 痔瘡及溼疹等。然而治療上的作用機轉並不是很清楚，搜索一些研究 文獻，報導魚腥草有抗氧化、抗發炎、抗病毒、抗白血病、免疫調節 與抗嚴重急性呼吸窘迫症候群 ( SARS ) 作用、抗菌和抗腫瘤等作 用。 根據政院衛生署公佈國人的健康狀況，一些與生活息息相關的疾 病，像是抽煙喝酒、熬夜壓力、環境飲食所引起的肺癌、肝癌及大腸 癌…等，其中肺癌在台灣死亡率居高不下，對生命一直威脅巨大，而 魚腥草在抗腫瘤的研究報告對肺癌部份研究著墨不多，所以我們研究 目標是找出魚腥草用在肺癌上的作用機轉，期許未來它能成為化學治 療以外的另一種支持性療法。大多數的抗癌藥物是針對影響細胞週期 所研發的，近年來，藥物化學家對於能夠推動和控制細胞週期的蛋白 質感到非常有興趣，而這些蛋白質都具有酶的功能。在癌細胞中就是 這些的調控機制出問題，導致癌細胞不斷的增生，而細胞也會喪失正 常的功能轉變成為癌細胞[24]。於是就以癌細胞的細胞週期做探討機 17.
(34) 制目標，找出造成細胞週期停止的蛋白質，以及引起癌細胞死亡的調 控蛋白。本研究擬探討魚腥草對肺癌細胞之作用以及其作用是否與細 胞週期調整相關。. 18.
(35) 第二章 總論. 第一節 實驗材料及設備. 一、實驗材料之製備 魚腥草 ( Houttuynia cordata, 簡稱 HC ) 之乾燥全株植物 200 公克，以 1 公升的水及 1 公升的酒精抽提，獲得之魚腥草粗抽液 ( 25mg/ml ) 儲存於冰箱-20℃備用。. 二、細胞株 A549 ( a human lung adenocarcinoma cell line ) 和 LLC ( a murine lung cancer cell ; lewis lung carcinoma cell line ) 購自新竹食 品工業研究所。. 三、儀器 1. 細胞培養箱 ( Forma Direct Heat CO2 Incubator Model310 Series ) 2. 垂直式無菌操作台 ( Laminar flow ) 3. 倒立式光學顯微鏡及影像分析軟體 ( Digital Microscopy. 19.
(36) Camera/Viewfinder3.0） 4. 冷凍離心機 ( Cetrifuge-5415R )、高速離心機 ( SORVALL®-pico 和 KUBOTA-2420 ) 5. 恆溫水浴槽（ Water bath BH230） 6. 液態氮儲存桶 7. 電子秤重天平 ( METTLER TOLEDO AB204-S/FACT ) 8. 二次去離子水製造機 ( Millipore® ) 9. 酸鹼值測定儀 （ pH meter METTLER TOLEDO Seven Easy） 10. ELISA reader ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay reader ) 11. 電泳槽 ( Bio-Rad SDS-PAGE® ) 12. 半乾式蛋白質轉漬槽 ( iBlot Transfer system, Invitrogen® ) 13. 震盪器 ( ORBITAL SHAKER 0S701 ) 14. 細胞計數器（Haemocytometer plate ） 15. 流式細胞分析儀（Becton Dickinson ® FACSCanto） 16. 4℃冷藏冰箱和-20℃及-80℃冷凍冰箱 17. 冷光螢光影像分析系統 ( Luminescent Image Analyzer, LAS-4000 ) 18. 高壓蒸氣滅菌鍋. 20.
(37) 四、試劑 1. 購自 GIBCO company ( Langley, Oklahoma, USA ) RPMI medium , Fetal Bovine Serum (FBS) , Penicillin-Streptomycin (P/S) , Trypan Blue 2. 購自 Merck company ( Whitehouse Station , New Jersey, USA ) Na2HPO4 (Disodium hydrogen phosphate) , NaCl ( Sodium chloride ) , KH2PO4 ( Potassium dihydrogen phosphate ) , KCl ( Potassium chloride ) 3. 購自 Sigma-Aldrich Chemical company ( Missouri, St. Louis, USA ) DMSO ( Dimethyl sulfoxide ) , PI ( Propidium iodide ) , RNase A ( Ribonuclease A) , BSA (Bovine Serum Albumin ) , APS ( Ammonium persulfate ) , Methanol ,Ethanol, Glycerol ,MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide ) reagent , CellyticTM M cell lysis reagent , Triton X-100 4. 購自 Amersco company ( Cleveland, Ohio, USA ) TEMED (N-N-N’-N’-Tetramethylenediamine), Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate), Trypsin-EDTA, 40% acrylamide /bis-acrylamide (29:1 ratio), 10X SDS (Sodium dodecylsulfate) buffer, Tris (Tris(hydroxymethyl)-aminomethane), 10X SDS-PAGE running buffer (TG-SDS buffer). 21.
(38) 5. 購自 Becton Dickinson company ( Franklin Lakes, New Jersey, USA ) Apoptosis detection Kit (PI/Annexin V-FITC) 6. 購自 Kodak company ( New York, USA ) Development reagent (顯影劑) ,Fixed reagent (定影劑) , BioMax Flim 底片 7. 購自 NEN Life Science ( MA, USA ) Western Lightning Chemiluminescene Reagent Plus ( ECL ) Kit. 五、耗材 ◎ 10 公分培養盤 , 75 公分培養瓶 ,12 孔及 96 孔培養盤 ◎ 15ml、50ml 的離心管和 1.5ml 的冷凍管以及 1.5ml eppendorff ◎ 5ml、10ml、25ml 吸管和 200μl 、1000μl 微量吸管尖以及 0.22μm 過濾膜 ◎ PVDF 轉漬膜(Millipore® , MA ,USA)以及 dispossible glasses. 六、抗體 1. 購自 Fermentas company Protein marker(＃SM6071) 2. 購自 Abcam company 22.
(39) Anti-Cyclin A (ab7956), Anti-CyclinB1 (ab2949), Anti-CyclinD1 (ab7958), Anti-CyclinE (ab7959), Anti-Cdk1/Cdc2 (ab6537), Anti-Cdk2 (ab7954), Anti-Cdk4 (ab7955), Anti-Cdk6 (ab41870), Anti-p27KIP1 (ab47590), Anti-p21 (ab47452), Goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody, Goat anti-rabbit IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody 3. 購自 Santa Cruz Biotechnology company β-Actin (C4):sc-477778 , Caspase-3(H-277):sc-7418 , Caspase-8 p20 (H-134):sc-7890 , Caspase-9 p35 (H-170):sc-8355. 七、實驗動物 購自樂斯科生技公司 ( BioLASCO Taiwan Co.,Ltd ) 的 ICR 雄 性小鼠(ICR mice)，體重約 20~25 公克，由本學校實驗動物中心代養， 其飼養室為 12 小時照光以及 12 小時黑暗，給予自由飲食。. 23.
(40) 第二節 實驗方法. 回顧魚腥草相關文獻，魚腥草具抗發炎作用，因此我們先進行 魚腥草粗抽物對小鼠足浮腫實驗來驗證其抗發炎活性，及其毒性的 評估，以了解魚腥草粗抽物的安全性；接著探討其對非小細胞肺癌 細胞株之影響及其可能的作用機轉，所進行的實驗包括: MTT reagent 檢測和流式細胞儀分析癌細胞的存活率；以倒立式光學顯微 鏡及影像分析軟體 ( Digital Microscopy Camera/Viewfinder 3.0 ） 觀察魚腥草對癌細胞型態上的影響；並利用流式細胞儀做細胞週期 分析；以 PI / Annexin V-FITC KIT 染色以分析癌細胞之死亡情況； 最後利用西方墨點法 ( western blot analysis ) 分析與癌細胞週期相 關之 cyclinD1 、cyclinE 、cyclinA 和 CDK4 / 6、 CDK2、 p27 以 及凋亡相關之 caspase 3、caspase 8 蛋白質的表現。 另進一步探討由魚腥草中分離所得之 5 種生物鹼成分，以其中 3 種對非小細胞肺癌細胞株具有活性的生物鹼:aristolactam BII, aristolactam AII 及 noraristolodione，進行其對非小細胞肺癌細胞株 之上述機轉探討。. 24.
(41) 一、小鼠足浮腫-抗發炎實驗 ICR 小鼠分成 4 組每組 8 隻，以每 10 公克體重給 0.1ml 的劑量 利用腹腔注射 ( i.p. ) 方式將魚腥草粗抽物 ( 0, 25, 50, 100 mg/kg ) 打入體內，另一組打入抗發炎藥 Indomethacin ( 4mg/kg )當作正對照 組，30 分鐘後，用致炎劑 1%λ-Carrageenan 0.05ml 注入小鼠後腳掌 引起浮腫，分別於 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 和 5 小時以 Plethysmometer 腳浮腫 測量儀測量排水量。. 二、動物急性毒性測試 ( LD50 ) ICR 小鼠分成 6 組每組 8 隻，以每 10 公克體重給 0.1ml 的劑量利用 腹腔注射 ( i.p. ) 方式將魚腥草粗抽物打入體內，觀察一星期之存活 率，並利用 Excel 算出其半數致死劑量 ( LD50 ) ，最後換算成每公斤的 劑量。. 三、細胞存活測試 ( MTT 與 PI 試劑分析 ) 1. MTT 試劑分析 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] 試劑分析法，主要是根據細胞粒線體內 dehydrogenase 會將 tetrazolium salt 還原成 formazan 結晶，其藍紫色結晶生成量與活細胞數目成正. 25.
(42) 比，再利用 DMSO ( Dimethyl sulphoxide ) 當作溶媒將藍紫色結晶溶 解，然後用酵素免疫自動分析儀 ( ELISA reader ) 在 570 nm 波長讀取 吸光值，實驗組與對照組吸光值的百分比表示細胞存活率。 將非小細胞肺癌細胞株 ( A549 or LLC ) 用 RPMI 培養液在 10cm2 培養盤中培養，再植入 96 孔培養盤 ( 2x104/200μl/well ) 經過 24 小時， 先抽掉舊的培養液，加入不同濃度的魚腥草粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 分別作用 24、48、72 小時，或是加入不同濃度的魚腥草所含生 物鹼 ( 0, 12.5, 25, 50 µg/ml ) 作用 24 小時，接著抽掉 20μl 培養液，再 加入 20μl MTT reagent ，1 小時後，抽掉 200μl 培養液，並加入 200μl DMSO，15 分鐘後，將結晶溶解，再用酵素免疫自動分析儀 ( ELISA reader ) 在 570 nm 波長讀取吸光值。. 2.PI 試劑染色 PI. [ Propidium iodine ] 是帶正電的核酸染劑，當細胞死亡時細. 胞膜通透性增加，便藉由靜電親和力和核酸結合，可發出紅色螢光， 再以流式細胞儀中不同雷射波長照射，對細胞的顆粒大小及複雜性所 產生的激發光訊號，代表細胞群分佈位置的意義。 將 A549 cells 植入 12 孔培養盤 ( 1x105/1ml/well ) 用 RPMI 培養液 經過 18~24 小時及 37℃培養，先抽掉舊的培養液，加入新的培養液及不. 26.
(43) 同濃度的魚腥草粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 分別作用 24、48、 72 小時。 加入 trypsin-EDTA 使細胞剝離培養盤，收取細胞移轉到離心管，用 1XPBS 將細胞沖洗下來 ( 2 次 )，進行離心 1500 轉 5 分鐘，去掉上清 液，加入 PI 染劑 ( 含 2mg/100ml PI 和 1xPBS ,其比例為 1:4 ) 300μl ， 上機之前先將有 PI 染劑之細胞移轉到 FAScan 專用管，蓋上錫箔紙避光 30 分鐘，最後以流式細胞儀進行分析。. 四、細胞型態的觀察 人類非小細胞肺癌細胞株 ( A549 ) 用 RPMI 培養液在 10 公分培 養盤培養經過 24 小時，先抽掉舊的培養液，加入不同濃度的魚腥草 粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 分別作用 24、48、72 小時，以倒 立式光學顯微鏡觀察細胞型態上之變化情形。. 五、細胞週期分析 用 70~75%冰冷酒精將細胞做固定及細胞膜打洞， PI 染劑染上 DNA 做量化，利用流式細胞儀分析不同週期中 DNA 的含量，便可得 知藥物使細胞週期的停滯作用。 將 A549 or LLC cells 植入 12 孔培養盤 ( 1x105/1ml/ well ) 用. 27.
(44) RPMI 培養液 ( 含 10% 胎牛血清 ) 經過 18~24 小時培養，先抽掉舊 的培養液，再加入新的培養液及不同濃度的魚腥草粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 分別作用 24、48、72 小時，或是加入不同濃度的魚 腥草生物鹼 ( 0, 12.5, 25, 50 µg/ml ) 作用 24 小時。 加入 trypsin-EDTA 使細胞剝離培養盤，收取細胞移轉到離心管， 用 1XPBS 將細胞沖洗下來 ( 2 次)，進行離心 1500 轉 5 分鐘，去掉上 清液後輕刮管壁來回 3 次，再次加入 1XPBS 清洗與離心，倒掉上清 液後輕刮管壁，接著一邊震盪 ( vortex ) 一邊沿著管壁加入 1ml 冰冷 ( 4℃ ) 75%酒精，放在-20℃冰箱存放。 上機之前先從 -20℃ 冰箱拿出前述離心管後直接離心 1500 轉 5 分 鐘，去掉上清液，輕輕刮管壁來回 3 次以 1ml 的 1xPBS 清洗殘餘酒精， 再一次進行離心，去掉上清液，再輕輕刮管壁來回 3 次，每管加入 PI 染劑 300μl ( 包含 20mg/dl PI、2mg/ml RNase A、5% Triton X-100 及 1xPBS )，移轉至流式細胞儀專用管，蓋上錫箔紙避光 30 分鐘，最後以 流式細胞儀進行樣品分析。 所得到的細胞週期中 DNA 之含量，用 Becton Dickinson 科技公司 ModFit cell cycle analysis software 3.0 定量軟體進行細胞週期的變化分 析。. 28.
(45) 六、Annexin V-FITC/PI 試劑雙染 在細胞進行凋亡早期時，磷脂絲氨酸（ phosphatidylserine，簡稱 PS ）會外露於細胞膜外，Annexin V 對磷脂絲氨酸有親和性，利用 標定螢光物質（FITC）後，可使用螢光顯微鏡或流式細胞儀偵測細 胞凋亡的發生。而碘化丙啶（ Propidium Iodide，PI ）是一種核酸 染料，它不能穿透完整的細胞膜，但對凋亡中、晚期的細胞和死細胞， PI 能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將 Annexin V 與 PI 合併 使用，就可以將處於不同凋亡時期的細胞區分開來。 將 A549 cells 植入 12 孔培養盤 ( 1x105/ 1ml / well ) 用 RPMI 培 養液經過 18~24 小時及 37 ℃培養，先抽掉舊的培養液，加入新的培 養液和不同濃度的魚腥草粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 分別作 用 24、48、72 小時。 先收取 12 孔培養盤中含培養液的細胞，用約 0.5ml 1xPBS 清洗 後收取細胞到離心管，再用大約 300μl 的 trypsin-EDTA 收取到離心 管，離心 1500 轉 5 分鐘，去掉上清液後加入 1x PBS 再次清洗與離心， 去掉上清液接著按照 Apoptosis detection Kit 上的步驟去做，先加入 300μl 的 1 倍 binding buffer 將 cells 混合，從中抽取 100μl ( 1x105 cells / ml ) 到 FAScan 管中，以 PI 與 Annexin V-FITC 為 1:1 ( 5μl:5μl )做雙 染，蓋上錫箔紙避光在室溫下作用 15 分鐘，上機之前再加入 400μl 29.
(46) 的 1 倍 binding buffer，最後以流式細胞儀進行分析。. 七、西方墨點 ( western blot ) 分析 Western Blot 採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白 質， 「探針」是抗體， 「顯色」用標記的二抗。經過 PAGE 分離的蛋白 質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非 共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活 性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免 疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放 射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。 1. 蛋白質萃取 人類非小細胞肺癌細胞株 ( A549 ) 用 RPMI 培養液先在 10 公分 培養盤經過 24 小時培養，抽掉舊的培養液，加入新的培養液和不同 濃度的魚腥草粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 分別作用 24、48、 72 小時，或是加入不同濃度的魚腥草所含生物鹼 ( 0, 12.5, 25, 50 µg/ml ) 作用 24 小時。 先將細胞中的培養液抽掉，用 1xPBS 清洗後抽掉，放在冰上面 使細胞停止活化，加入 100～200μl CellyticTM M cell lysis reagent，作 用 10 分鐘，以塑膠棒輕輕刮過整個細胞後作用 20～30 分鐘 ( 冰 30.
(47) 上 )，收集 10 公分培養盤上的細胞吸取到 eppendorff，進行離心 1500 轉 15～20 分鐘，取上清液到新的 eppendorff，接著可以作蛋白質定量 分析，或是暫時儲存在 -20℃ 冰箱。 2. 蛋白質定量 首先定量標準品，用 2mg/ml BSA ( Bovine Serum Albumin )，稀 釋成濃度 2000、1000、500、250、125、0μg/ml，利用 ELISA reader 在 吸光值 570nm 測量，做出一條標準檢量線 ( standard curve )，並算出 趨勢方程式和 r2 值 ( r 至少大於 0.995 以上 )。 樣品的定量則是由低到高濃度 ( 0→ 0.125→ 0.25→ 0.5 mg/ml ) 分別放入 10μl 的蛋白質體積量，每個濃度都做 3 個樣品，然後加入 體積 200μl 的 A+B 染劑 ( A : B = 50 : 1 )，利用 ELISA reader 在吸光 值 570nm 測量。將數值套進標準檢量線 ( standard curve )，可得到蛋 白質的體積量。 3. 電泳跑膠和轉漬 配製 10~12%的 SDS-PAGE ( 下膠:D.D water，1.5M Tris，30% acrylamide，10%SDS，10% Ammonium persulfate，TEMED；上膠: D.D water ， 0.5M Tris ， 30% acrylamide ， 10%SDS ， 10% Ammonium persulfate，TEMED )，取 40~70μg 的蛋白質量加入 1/4 倍染劑，以 95 ℃加熱 5 分鐘，變性後的蛋白放入含有 1x running buffer 電泳槽的上 31.
(48) 膠凹槽內，以 120~125 伏特及 400 安培電流跑膠約 60~70 分鐘。將 膠上的蛋白質轉漬到 PVDF 或是 NE 膜上，使用半乾式轉漬機器 ( Invitrogen® ) 轉漬約 6 分鐘 ( 分子量大時間越久，分子量小時間越 短 )。 4. 蛋白質免疫染色 將 PVDF 或 NE 膜浸在 5% 脫脂牛奶液中 1 小時，覆蓋掉一些 非特異性蛋白結合位置，用 1xPBST 清洗牛奶液，每次 10~15 分鐘， 共 4~6 次，室溫下加入一級抗體搖晃至少 1 小時或是冰箱冷藏 ( 4℃ ) 浸潤過夜，清洗一級抗體，每次 10~15 分鐘，共 4~6 次，加入二級抗 體搖晃 1 小時，清洗二級抗體，每次 10~15 分鐘，共 4~6 次，最後加 入等比例 ( 1 : 1 ) 冷光劑試劑 ( ECL Kit ) 呈色反應，於暗房內以 Kodak X 光底片及顯影劑、定影劑呈現蛋白質的表現量。. 第三節 資料統計與分析 採用 SigmaPlot 繪圖並以 SPSS 統計軟體分析，實驗結果數據以 平均值 ( mean ) ± 標準誤差 ( standard error, S.E. ) 表示,實驗與對 照組別之間以 One-way ANOVA ( Analysis of variance ) 中的 Dunnett 分析，若 p 值小於 0.05 即具有統計學上的意義。. 32.
(49) 第三章 結果 第一節 魚腥草粗抽物之生理活性. 一、魚腥草粗抽物抗發炎作用 在給予魚腥草粗抽物的各組別，分別和完全不給藥物組 ( 控制 組 ) 及給予 Indomethacin 藥物組 ( 正對照組 ) 做比較。結果發現給 藥組都能有效抑制發炎，在給予魚腥草粗抽物劑量 50mg/kg 時，與 Indomethacin ( 4mg/kg ) 組有相似抑制發炎作用，魚腥草粗抽物劑量 100 mg/kg 的抗發炎作用甚至比 Indomethacin ( 4mg/kg ) 藥物作用 強，其結果如 Fig. 6 所示。. 二、魚腥草粗抽物對小鼠之急性毒性作用 將魚腥草的粗抽物以每 10 公克體重給 0.1ml 之劑量，以腹腔注 射到小鼠體內，藥物濃度為 0.5, 0.625, 0.75, 1.00, 1.25, 1.5 mg/0.1ml， 觀 察 7 天 內 小 鼠 存 活 的 情 況 ， 結 果 發 現 投 與 0.5mg/0.1ml 與 0.625mg/0.1ml 的 小 鼠 ( n=8 ) 皆 存 活 , 存 活 率 為 100% , 而 0.75mg/0.1ml 有 87.5%的存活率，但是 1.00mg/0.1ml 其小鼠存活率僅 有 12.5%，而 1.25mg/0.1ml 和 1.5mg/0.1ml 濃度之下小鼠全都死亡， 33.
(50) 存活率為零。由以上實驗結果得知，魚腥草的粗抽物其安全範圍狹 小，其 LD50 為 9 mg/kg 。. 三、魚腥草粗抽物對 A549 細胞或 LLC 細胞存活率的影響 (一) MTT 試劑的分析 ( MTT assay ) 以對照組 ( control ) 的吸光值當 100%，給藥組別的吸光值相對應 之百分比代表細胞的存活率，其結果如 Fig. 8 和 Fig. 9 所示。顯示隨著 劑量及時間的增加，魚腥草粗抽物抑制非小細胞肺癌細胞株 ( A549 or LLC ) 的生長，且具有劑量及時間上的依存性。. (二) 流式細胞儀分析 ( Flow cytometry analysis ) 由 Fig.10 結果顯示隨著劑量及時間的增加，魚腥草粗抽物有意義的 抑制 A549 細胞株的生長，與 Fig. 8 的 MTT 試劑分析 A549 細胞活性之 結果相似，皆在給予魚腥草粗抽物劑量 0.25 mg/ml 經過 48 小時，有效 抑制 50%的 A549 細胞存活。. 四、魚腥草粗抽物對 A549 細胞於形態學上的改變 由 Fig.11 顯示魚腥草粗抽物在高劑量及長時間作用下，A549. 34.
(51) 細胞形態變得比較不完整及細胞較小，可看到細胞內呈現小顆粒狀， 如同圖中以箭頭指出之處。. 五、魚腥草粗抽物對 A549 細胞之週期的影響 不同濃度的魚腥草粗抽物 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml )，經過 24、48、72 小時作用，對 A549 細胞之週期影響，結果顯示細胞週期 之 DNA 含量在 G1 期最多，S 期其次，G2/M 期最少，以不給藥組當 標 準 比 較 ， 發 現 較 投 予 高 濃 度 魚 腥 草 粗 抽 物 時 ( 0.25mg/ml 和 0.5mg/ml ) 經過 24、48 小時產生蓄積作用在 G1 期最多，而 72 小時 產生蓄積作用在 G1 及 S 期最多，如 Fig.12-14 所示。. 六、Annexin V-FITC/PI 試劑雙染呈現 A549 細胞死亡情形 不同濃度的魚腥草粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 對 A549 細胞分別作用 24、48、72 小時，結果如 Fig.15 和 Fig.16 所示，經過 24 小時後，A549 細胞隨著魚腥草粗抽液劑量 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 之細胞死亡百分比分別為 12.38±2.39%, 12.5±2.07%, 15.92±1.41%, 21.43±3.59% ; 經過 48 小時後，A549 細胞隨著魚腥草粗抽液劑量 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 之 細 胞 死 亡 百 分 比 分 別 為 10.50±3.8%, 10.33±2.56%, 23.68±6.41%, 28.48±9.80% ; 經過 72 小時後，A549 細 35.
(52) 胞隨著魚腥草粗抽液劑量 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml 之細胞死亡百分比 分別為 10.35±1.27%, 7.05±0.58%, 18.18±2.18%, 35.68±3.67% 。由上 述結果顯示，魚腥草粗抽液隨著劑量與時間的增加，造成 A549 細胞 死亡百分比也增加。. 七、魚腥草粗抽物對人類 A549 細胞之週期相關及凋亡相關 蛋白質的影響 不同濃度的魚腥草粗抽液 ( 0, 0.125, 0.25, 0.5 mg/ml ) 處理 48 小 時，觀察其對 A549 細胞之週期中的蛋白質及凋亡相關蛋白質的影 響。結果如 Fig.17-26 所示，細胞週期 G1 期相關的 cyclinD1、cyclinE、 cyclinA 和 CDK4 / CDK6 、CDK 2 蛋白質隨著魚腥草粗抽液劑量增 加而遞減，而 p27 蛋白表現量增加；與細胞凋亡相關的 caspase 8、 caspase 3 蛋白質表現量增加。. 36.
(53) control 25mg/kg 50mg/kg 100mg/kg indomethacin 4mg/kg. 40. Edema (%). 30. 20. *** **. *** ***. **. ***. **. 10. ***. *. ***. *** ##. 0. ***. ***. *** 0. **. ***. *** ***. *** *** ###. 1. *** ###. *** #. 2. 3. *** #. ***. 4. 5. #. Time(h). Fig.6 The effect of Hottuynia cordata ( HC ) crude extract on carrageenan-induced paw edema in mice.. 37. 6.
(54) Fig.7 The acute toxicity of Hottuynia cordata ( HC ) crude extract in mice.. 38.
(55) 120 24h 48h 72h. 100. cell viability(% ). *** ***. 80 *** 60. ***. *** *** ***. 40. *** ***. 20. 0 control. 0.125mg/ml. 0.25mg/ml. 0.5mg/ml. Fig.8 Effect of HC-crude extract on the cell viability of human lung carcinoma cells (A549) . Cell viability was detected by MTT assay.. 39.
(56) 120 24h 48h 72h. cell viability (%). 100. **. 80. ***. ***. ***. 60 *** ***. 40. *** ***. 20. ***. 0 control. 0.125mg/ml. 0.25mg/ml. 0.5mg/ml. Fig.9 Effect of HC-crude extract on the cell viability of murine lung cancer cells (LLC ). Cell viability was detected by MTT assay.. 40.
(57) 120. 100. cell viability(%). 80. ** **. 24 h 48 h 72 h **. 60. 40 *** *** 20. *** *** ***. 0. control. 0.125. 0.25. 0.5. concentrartion(mg/ml). Fig.10 Effect of HC-crude extract on the cell viability of human lung cancer cells (A549) by Flow Cytometry.. 41.
(58) Fig.11 Effect of HC-crude extract on the cell morphology of human lung cancer cells ( A549 ).. 42.
(59) (B) 100 *** control 0.125 mg/ml HC-crude 0.25 mg/mlHC-crude 0.5 mg/ml HC-crude. **. % of cell cycle distribution. 80. 60. 40. 20. 0 G1. S. G2/M. Apoptosis. Fig.12 Alternation of HC-crude extract on cell cycle distribution of A549 cells for 24h.. 43.
(60) (B) 100 *** control 0.125mg/ml HC-crude 0.25mg/ml HC-crude 0.5mg/ml HC-crude. % of cell cycle distribution. 80 **. 60. 40. 20. 0 G1. S. G2/M. Apoptosis. Fig.13 Alternation of HC-crude extract on cell cycle distribution of A549 cells for 48h.. 44.
(61) (B) 120. ***. % of cell cycle distribution. 100. 80. control 0.125 mg/ml HC-crude 0.25 mg/ml HC-crude 0.5 mg/ml HC-crude. **. 60. 40 * *. 20. 0 G1. S. G2/M. Apoptosis. Fig.14 Alternation of HC-crude extract on cell cycle distribution of A549 cells for 72h.. 45.
(62) Fig.15 Effects of HC-crude extract on the cell vaibility of A549 cells. A549 cells were treated with HC-crude extract and were stained with Annexin V conjugated FITC and PI. Cell viability was measured by using Flow Cytometer.. 46.
(63) (A). 50. (B). 50. control 0.125mg/ml 0.25mg/ml 0.5mg/ml. control 0.125mg/ml 0.25mg/ml 0.5mg/ml. 40. percent (%). percent (%). 40. 30. 20. 30. 20. 10. 10. 0. 0 late apoptotic or necrosis + + (Anexin / PI ). late apoptotic or necrosis (Annexin +/ PI+ ). early apoptotic cells + (Anexin / PI ). early apoptotic cells (Annexin + / PI - ). (C) 50. ***. percent (% ). 40. control 0.125mg/ml 0.25mg/ml 0.5mg/ml. 30. * 20. 10. 0 late apoptotic or necrosis (Annexin +/ PI+ ). early apoptotic cells (Annexin + / PI - ). Fig.16 Effect of HC-crude extract on the cell viability of A549 cells. A549 cells were treated with HC-crude extract for different time (A) 24h (B) 48h (C) 72h and were stained with Anexin V conjugated with FITC and PI.. 47.
(64) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). Fig.17 Suppression of CDKs and cyclins and up-regulation of p27, caspase 8, caspase 3 by HC-crude extract treatment. A549 cells were treated with various concentration of HC-crude extract for 48h.. 48.
(65) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). The ratio of cyclinD 1 protein level (% ). 120. 100. 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.18 Suppression of cyclinD1 protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 49.
(66) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). T he ratio of cyclin E protein level (% ). 120. 100. 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.19 Suppression of cyclinE protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 50.
(67) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). The ratio of cyclin A protein level (% ). 120. 100 * ** 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.20 Suppression of cyclinA protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 51.
(68) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). The ratio of CDK4 protein level(%). 120. 100 * 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.21 Suppression of CDK4 protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 52.
(69) control. 0.125. 0. 25. 0.5. (mg/ml). The ratio of CDK6 protein level (%). 120. 100. 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.22 Suppression of CDK6 protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 53.
(70) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). The ratio of CDK2 protein level (%). 120. **. 100. ** 80 *** 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.23 Suppression of CDK2 protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 54.
(71) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). 120. The ratio of caspase 8 protein level (%). * 100. 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.24 Up-regulation of caspase 8 protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 55.
(72) control. 0.125. 0.25. 0.5. (mg/ml). The ratio of caspase 3 protein level (%). 140. 120. 100. 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. 0.25. 0.5. concentration (mg/ml). Fig.25 Up-regulation of caspase 3 protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 56.
(73) control. 0.125. 0.25. 0.5. 0.25. 0.5. (mg/ml). The ratio of p27 protein levle (% ). 140. 120. 100. 80. 60. 40. 20. 0 0. 0.125. concentration (mg/ml). Fig.26 Up-regulation of p27 protein expression by HC-crude extract treatment on A549 cells for 48h by immunoblotting.. 57.
(74) 第二節 魚腥草所含生物鹼之生理活性. 一、魚腥草所含生物鹼對 A549 細胞存活率的影響 結果如 Fig. 27 所示，隨著劑量的增加，魚腥草所含之 5 種生物鹼(包 括 aristolactam BII , aristolactam AII, piperolactam A, norcepharadione B, 和 noraristolodione) 對 A549 細胞存活率具抑制作用， 以其中的 3 種生 物鹼 ( aristolactam BII , aristolactam AII 和 noraristolodione ) 對 A549 細 胞存活率之抑制作用較明顯。. 二、魚腥草所含生物鹼對 A549 細胞之週期的影響 結果如 Fig. 28-30 所示，細胞週期之 DNA 含量在 G1 期最多，S 期其次，G2/M 期最少，以不給藥組當標準比較，發現生物鹼成份 aristolactam BII 和 aristolactam AII 會使 S 期與 G2/M 期產生蓄積作 用，而 noraristolodione 僅使 S 期產生蓄積作用。. 三、魚腥草所含生物鹼對 A549 細胞之週期相關及凋亡相關 蛋白質的影響 結果如 Fig.31-33 所示，細胞週期 S 期和 G2/M 期相關的 cyclin A、. 58.
(75) cyclin E、CDK 2、Cdc2 (CDK1) 蛋白質隨著魚腥草生物鹼劑量增加 而減少;與凋亡有關的 Bcl-2 蛋白質遞減，p21、p27、P53、caspase 3 和 caspase 8 以及 Bax 蛋白質則隨著劑量增加而增加。. 59.
(76) aristoloactam BΙΙ aristolactam AΙΙ piperolactam A norcepharadione B noraristolodione. 120. 100 *. *. cell viability (%). *. ** **. 80 **. **. ** ***. ***. ***. 60. 40. 20. 0 control. 12.5 ug/ml. 25 ug/ml. 50 ug/ml. Fig. 27 Effect of aristolactam BII, aristolactam AII, piperolactam A, norcepharadione B and noraristolodione on the cell viability of human lung cancer cells (A549) for 24 h. Cell viability was detected by MTT assay.. 60.
(77) 70. control Aristolactam BΙΙ-12.5 ug/ml Aristolactam BΙΙ-25 ug/ml Aristolactam BΙΙ-50 ug/ml. cell cycle distribution(%). 60. 50 *** *** 40. 30. 20 *. *. 10. ** ***. 0 G1. S. G2/M. apoptosis. Fig.28 Effects of aristolactam BII on A549 cell cycle distribution. aristolactam BII treatment for 24h altered A549 cell cycle distribution and arrested at S/G2/M phase.. 61.
(78) 70 control Aristolactam AΙΙ-12.5 ug/ml Aristolactam AΙΙ-25 ug/ml Aristolactam AΙΙ-50 ug/ml. cell cycle distribution (%). 60. 50 ** 40. 30. 20. ** *. 10 ** 0 G1. S. G2/M. apoptosis. Fig.29 Effects of aristolactam AII on A549 cell cycle distribution. aristolactam AII treatment for 24h altered A549 cell cycle distribution and arrested at S/G2/M phase.. 62.
(79) 70 control Noraritolodione-12.5 ug/ml Noraristolodione-25 ug/ml Noraristolodione-50 ug/ml. cell cycle distribution (%). 60. 50. 40. **. 30. 20. 10. 0 G1. S. G2/M. apoptosis. Fig. 30 Effects of noraristolodione on A549 cell cycle distribution. Noraristolodione treatment for 24h altered A549 cell cycle distribution and arrested at S/G2/M phase.. 63.
(80) Control. 12.5. 25. 50. ( μ g / ml ). Fig.31 Suppression of CDKs, cyclins, Bcl-2 protein expression and up-regulation of apoptosic protein expression ( caspase 3, caspase 8 and p21, p27, p53 and Bax) by aristolactam BII treatment. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam BII for 24h.. 64.
(81) Table 2. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam BII for 24h and each data represented the expression of cell cycle-related and apoptosis proteins aristolactam BII Proteins / β actin. Proteins Level(%). control. 12.5μg/ml. 25μg/ml. 50μg/ml. Cyclin E. 100. 96.45±0.69**. 92.77±0.93**. 88.47±2.42**. Cyclin A. 100. 99.03±1.62. 93.09±1.63*. 83.86±2.08**. Cdc 2(CDK 1). 100. 97.04±2.11. 93.86±1.29**. 92.13±2.89. CDK 2. 100. 99.34±4.66. 92.72±3.32. 90.75±4.25. p21. 100. 97.47±0.58. 103.10±2.72. 106.66±4.44. 110.67±2.65*. 117.49±2.95**. 108.44±0.68. ***. p27. 100. p53. 100. 101.18±0.40. 117.21±4.71*. 127.31±2.49***. Caspase 3. 100. 104.60±1.60*. 106.83±0.29***. 118.93±0.945***. Caspase 8. 100. 118.39±5.45*. 120.74±4.90*. 131.12±3.24***. Bax. 100. 107.43±1.83*. 109.84±1.03***. 124.47±1.65***. Bcl-2. 100. 83.50±0.53***. 80.11±0.75***. 74.31±0.73***. * P < 0.05 , ** p < 0.01 , *** p < 0.001 compared with control group.. 65.
(82) control. 12.5. 25. 50. ( μ g/ ml). Fig. 32 Suppression of CDKs, cyclins, Bcl-2 protein expression and up-regulation of apoptosic protein expression ( caspase 3, caspase 8 and p21, p27, p53 and Bax ) by aristolactam AII treatment. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam AII for 24h.. 66.
(83) Table 3. A549 cells were treated with various concentration of aristolactam AII for 24h and each data represented the expression of cell cycle-related and apoptosis proteins Proteins / β actin. aristolactam AII. control. 12.5μg/ml. 25μg/ml. 50μg/ml. Cyclin E. 100. 93.20±2.18**. 87.88±3.05*. 81.36±3.65**. Cyclin A. 100. 88.66±2.42**. 90.79±1.00***. 83.13±2.71**. Cdc 2(CDK 1). 100. 91.32±3.38. 90.87±2.38*. 83.19±2.95**. CDK 2. 100. 92.86±4.27. 89.61±4.28. 88.89±5.37. p21. 100. 105.80±4.41. 110.63±4.23. 116.76±7.11. *. **. 130.00±3.29***. Proteins. p27. 100. 109.41±2.42. Level(%). p53. 100. 120.22±6.27*. 129.65±4.11**. 145.08±6.29**. Caspase 3. 100. 107.13±4.24. 114.97±3.53*. 121.32±2.78**. Caspase 8. 100. 110.20±6.99. 113.91±6.93. 120.97±7.31*. Bax. 100. 107.32±2.33*. 119.76±2.01***. 130.73±2.36***. Bcl-2. 100. 90.86±4.08. 85.29±3.45*. 78.43±6.03*. 120.33±3.25. * P < 0.05 , ** p < 0.01 , *** p < 0.001 compared with control group.. 67.
(84) control. 12.5. 25. 50. ( μ g /ml ). Fig. 33 Suppression of CDKs, cyclins, Bcl-2 protein expression and up-regulation of apoptosic protein expression (caspase 3, caspase 8 and p21, p27, p53 and Bax) by noraristolodione treatment.A549 cells were treated with various concentration of noraristolodione for 24h.. 68.
(85) Table 4. A549 cells were treated with various concentration of noraristolodione for 24h and each data represented the expression of cell cycle-related and apoptosis proteins noraristolodione Proteins / β actin. control. 12.5μg/ml. 25μg/ml. 50μg/ml. Cyclin E. 100. 93.27±9.06**. 90.65±1.09**. 82.48±1.34***. Cyclin A. 100. 95.50±1.91. 87.09±3.98*. 70.13±1.46***. CDK 2. 100. 95.98±1.58. 91.08±5.73. 91.95±3.93. p21. 100. 109.90±1.76**. 113.60±2.20**. 117.21±2.76**. Proteins. p27. 100. 111.56±4.88**. 121.69±3.26**. 128.93±5.22**. Level(%). p53. 100. 103.47±1.52. 105.92±1.34*. 116.97±1.26***. Caspase 3. 100. 110.31±2.90*. 115.03±3.28*. 123.19±4.03**. Caspase 8. 100. 106.71±2.46. 110.13±1.26**. 121.88±4.50**. Bax. 100. 107.03±1.48**. 115.37±3.36*. 120.15±3.24**. Bcl-2. 100. 92.84±3.22. 77.96±1.16***. * P < 0.05 , ** p < 0.01 , *** p < 0.001 compared with control group.. 69. 75.10± 0.87***.
(86) 第四章 討論. 民間常見的魚腥草用藥，過去有學者對其抗發炎研究是採用誘發 動物胸肋膜炎及耳朵水腫，本實驗以致炎劑 carrageenan 造成小鼠足 蹠浮腫，由測其排水量得知發炎程度，分成給魚腥草粗抽物組及對照 組，及以 Indomethacin 當正對照組，實驗結果證實魚腥草粗抽物具 有抗發炎作用，在劑量 100mg/kg 時的抗發炎活性大於 Indomethacin (4mg/kg) ( 如 Fig.6 所 示 ) 。 根 據 研 究 文 獻 指 出 ， 前 驅 發 炎 ( pro-inflammatory ) 物質與抗發炎 ( anti-inflammatory ) 物質之間 平衡失調時，過量的前驅發炎化學物質(chemokines)導致發炎的產生 [25]，長期慢性發炎可能促進血管新生[26]，進而演變為快速腫瘤的 生長，由此可知發炎與癌症之間具有密不可分的關聯[27-30]。 由於魚腥草具抗發炎作用，是否也具抗癌作用呢？由過去的研究 文獻記載，魚腥草確實對一些人類的癌細胞株，如非小細胞肺癌(A549 細胞)、卵巢癌 ( SK-OV-3 細胞 )、黑色素瘤 ( SK-MEL-2 細胞 )、 中樞神經系統癌細胞( XF-498 細胞) 和結腸癌 ( HCT-15 細胞 ) 產 生抑制生長效果 [13]，可惜的是沒有把抗癌作用機轉做詳盡研究， 這激起了我們對魚腥草是如何達到抑制癌細胞作用產生興趣。在台灣 肺癌從 1997 到 2007 年幾乎是國人十大癌症死因之首[15]，目前臨床 70.
(87) 上對於肺癌之治療多使用化學治療 ( chemotherapy ) 及放射性療法 [31, 32]，皆有其副作用，因此，本研究擬探討魚腥草對於肺癌細胞 之作用及其可能機轉，以期能提供魚腥草在臨床應用之參考。 首先選用了 2 株非小細胞肺癌 A549 ( 來自人類 ) 和 LLC ( 來 自老鼠 ) 做存活率測試，由 MTT 試劑分析結果得知，魚腥草粗抽物 對 A549 及 LLC 都具有明顯抑制生長效果 ( 由 Fig. 8 和 Fig. 9 之結 果可知 )，進一步研究針對 A549 細胞探討其作用機轉。由流式細胞 儀進行 A549 細胞存活率實驗，得到的結果 與 MTT 試劑分析相似 ( Fig. 10 和 Fig. 8 所示 )，兩者不同的分析方式在經過 48 小時的魚 腥草粗抽物劑量 0.25 mg/ml 時，皆能抑制 50%的細胞存活；經過魚 腥草粗抽物處理的 A549 細胞與對照組相比較，在倒立式光學顯微鏡 下觀察，發現其細胞形態隨著時間和劑量的增加，A549 細胞部分變 得不完整、碎小且不貼壁 ( Fig.11 )，當細胞受到損傷時，可能進行 凋亡或壞死[33-35]，觀察外在細胞形態的變化，只能看到細胞較小且 皺縮破裂[36, 37]。 為了進一步了解魚腥草造成 A549 細胞死亡之作用及其可能機 轉，本研究以魚腥草粗抽物處理過之 A549 細胞進行其細胞週期的變 化，以進一步探討魚腥草之抗癌機制。細胞週期生長的控制有賴於週 期素( Cyclins ) 和週期素依賴性激酶 ( CDKs ) 所形成的複合物 71.
(88) [38]，而細胞週期可區分為休眠期 ( G0 phase )、第一間期 ( G1 pahse )、合成期 ( S phase )、第二間期 ( G2 pahse ) 和分裂期 ( M phase )，這些複合物( Cyclins / CDKs ) 在各期分別是: G1 期會大量 表現的 cyclinD /cdk4 或 cyclinD / cdk6;在晚期 G1 進入初期 S 期則 是由 cyclinE /cdk2 負責; S 期中大量表現 cyclinA / cdk2;在 G2 和 M 期是 cyclinA / cdc2(cdk1) 或 cyclinB / cdc2 (cdk1)。另一種調控蛋白 質稱週期素依賴性激酶抑制劑 ( CDKI )，包括 2 大家族: INK4 ( Inhibitor of Cdk4 ) 家族，成員有 p16INK4A 、p15 INK4B、p18 INK4C 和 p19. INK4D. ，全都是特異性鍵結在 Cdk4 和 Cdk6； CIP/KIP ( Cdk. Interacting Protein/ Kinase Inhibitory Protein ) 家 族 ， 成 員 有 p21CIP1、p27KIP1 和 p57KIP2，較廣泛鍵結在 CDK4、CDK6、CDK2 和 Cdc2。當 CDKI 與 Cyclins / CDKs 複合物結合時，會導致細胞週 期的停止[39, 40]，依據研究發現 p21CIP1 過量表現會引起細胞週期停 滯在 S 期 [41]，而 p27KIP1 過量表現引起細胞週期停滯在 G1/S 期 [42]，且兩者皆會誘導細胞進行凋亡作用[42]。 臨床上抗癌藥可分細胞週期專一性與非專一性藥物，專一性藥 物例如:抗代謝藥物 ( Antimetabolites ) [43-45] 對 S 期最具作用，抗 生素類( Antibiotics ) [46]的 Bleomycin 可導致細胞停滯在 G2 期[47]， 長春花鹼 ( Vinca alkaloids ) 抑制 G2 分裂期中的微小管、半合成之 72.
(89) 普達非倫生物鹼類 ( podohyl alkaloids ) 的 Etoposide 可阻斷較後期 S-G2 期; 非專一性藥物例如:烷化製劑 ( Alkylating agents ) 的 Mechlorethamine 及其他化學治療劑 Cisplatin 對正在進行增殖的細 胞較敏感，尤其是 G1 與 S 期[48]。經過魚腥草粗抽物處理的 A549 細胞，以流式細胞儀分析，發現隨著魚腥草粗抽物劑量與時間的增 加，在 G1 或 S 期產生蓄積現象，顯示魚腥草粗抽物可使 A549 細胞 週期停滯在 G1/S 生長期 ( 如 Fig.12、Fig.13 和 Fig.14 所示 ) 。 Grimison 等 2000 年曾指出肺癌細胞之抑制與 cip/kip 蛋白重新 分布而抑制了 CDK2 之表現，而使細胞停滯於 G1 期 [49]。如 Fig.34 [50] 所示，與細胞週期 G1/ S 期相關之 cyclin D / CDK4 /CDK6、cylin E /CDK2 和 cyclin A/CDK2 複合蛋白質受到 p53, Myc 蛋白質和 cip / kip 家族 ( 包括 p21, p27, p57 ) 與 Ink4 家族 ( 包括 p15, p16, p18, p19 ) 所調控，其中 p53 蛋白質影響 cip / kip 家族，可以抑制 cyclins/ CDKs 複合蛋白質，而 Ink4 家族主要是抑制 D-型的 cyclin / CDK 複 合蛋白質，負向調節細胞週期，抑制細胞的增生；Myc 蛋白質則是 正向調節細胞週期，促進細胞的增生[49]。利用西方墨點免疫轉漬技 術 ( western blot )，將細胞週期相關的蛋白質表現出來，實驗結果顯 示 A549 細胞其 G1/S 期相關之 cyclin D1、cylin E 、cyclin A 和 CDK4 /CDK6 及 CDK2 蛋白質，表現量皆隨魚腥草粗抽物劑量增加而遞減 73.
(90) ( 如 Fig.17 所示 )，p27KIP1 蛋白質表現量則隨魚腥草粗抽物劑量增 加而增加 ( 如 Fig.26 所示 )，由此可知，魚腥草對 G1/ S 期之作用 乃與影響前述 G1/S 期相關之蛋白質表現有關。. Fig.34. Cell cycle regulation and differentiation.[50]. 由本研究發現魚腥草粗抽物可使 A549 細胞之細胞週期停止及死 亡，因此進一步探討魚腥草造成 A549 細胞死亡的作用機轉。利用 Annexin V-FITC/PI 試劑進行雙染，當細胞進行凋亡早期時，磷脂絲 氨酸（phosphatidylserine，簡稱 PS）會外露於細胞膜外，Annexin V 對磷脂絲氨酸有親和性，利用與標定螢光物質（FITC）結合後，可 74.
(91) 使用螢光顯微鏡或流式細胞儀偵測細胞凋亡的發生；碘化丙啶 （Propidium. Iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細. 胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細 胞核染紅[51, 52]。因此將 Annexin. V 與 PI 合併使用，即可將處於. 不同凋亡時期的細胞區分開來。由實驗結果顯示，加入魚腥草粗抽物 引起 24、48、72 小時 A549 細胞的凋亡並不明顯，而是出現在較晚 期的凋亡 ( 如 Fig.15 和 Fig.16 所示 )。細胞進行凋亡作用可透過內 在路徑 ( intrinsic pathway) 或外在路徑 ( extrinsic pathway)。細胞 質 內 的 一 種 轉 錄 因 子 稱 p53 ， 它 是 一 種 腫 瘤 抑 制 基 因 ( tumor suppressor gene )，當細胞接受死亡訊息時，會活化增加 p53 蛋白質 的表現，促進凋亡性蛋白質 Bax/Bak 增加，同時抑制抗凋亡性蛋白 質 Bcl-2/Bcl-XL 的表現，再使細胞內的粒腺體外膜通透性增加，釋放 出 cytochrom c 或 AIF ( apoptosis inducing factor )，接著誘導凋亡性 蛋白質 caspase 活化，造成細胞核的改變，進而使細胞進行凋亡作用， 此稱之為粒線體之凋亡路徑，即為細胞凋亡的內在路徑 ( intrinsic pathway) [53, 54] ；若是細胞死亡訊息藉由死亡受體接收，則會透過 Fas/Fas ligands 作用，造成下游的凋亡性蛋白質 caspase 活化，使細 胞進行凋亡作用，稱之細胞凋亡的外在路徑 ( extrinsic pathway )[55, 56]。由 Fig.17 western blot 結果顯示，凋亡性蛋白質 caspase 3 與 75.
Outline
相關文件
• DNA analysis: cell cycle analysis, tumor monitoring, detection of ploidy,. •
Human papillomavirus- related squamous cell carcinoma of the oropharynx: a comparative study in whites and African Americans. Prevalence of human papillomavirus type 16 DNA in
Keratinizing squamous cell carcinoma composed of recognizable squamous tumor cells with pronounced keratinization (B) (original magnification ×200).6. Dark blue punctate (dotlike,
High pre-treatment serum level of vascular endothelial growth factor (VEGF) is associated with poor outcome in small-cell lung cancer. Telomerase as tumor
patients with stage I/II disease but not in those with stage III disease.43 A high serum level of VEGF is associated with poor survival among patients with small cell lung
Persons with a phenotype mediated by one of these MC1R genetic variants are at greater risk of UV-induced skin cancers, because pheomelanin not only provides less effective
Giant cells are also seen in other diseases like giant cell granuloma of the jaws, traumatic bone cyst, aneurysmal bone cyst, and jaw tumor of
To evaluate the clinicopathologic features, prognostic factors, and management of patients in the North Chinese population with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)
