第一章 前言
第二節 DNA 鍵結物( DNA adduct ) ：8-OHdG 之定量
(一) 材料
將輻射照射的老鼠於採血後犧牲，取肝臟放於-80 ℃保存。
(二) DNA 的萃取
將每 1 g 組織平均磨碎於 10 ml phosphate-buffered saline ( PBS )中，以 4
℃、3200 rpm 轉速離心 15 分鐘，可得到含有細胞核的 pellet，將 pellet 均勻 溶於 10 ml 1x lysis buffer 【1% sodium dodecyl sulphate SDS、25 mM EDTA、
10 mM Tris ( pH8.0)、75 mM NaCl】，加入 5 mg ( 250
µ
l )蛋白質分解酵素 K，再加 50 µl BHT 溶液 ( butylated hydroxytoluene 20mg/ml 溶於異丙醇)，維持
在 37℃一晚上。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇＝25：24：1，萃取 3 分鐘，
以 3200 rpm 的轉速離心 10 分鐘。重複前面萃取步驟，取上清液以等體積的 氯仿再萃取 3 分鐘，以 3200 rpm 的轉速離心 10 分鐘。取上清液加入 0.1 倍 體積的 3 M 醋酸鈉( pH=5.5)和 2 倍體積的 95% 冰乙醇，使核酸沈澱，保存 在-20℃。用冰的 70%乙醇洗去醋酸鈉並且 spool DNA 和清洗。使 DNA 均勻 溶在 10 mM 的 Tris. HCl buffer ( pH=7.4 ) 3 ml 中，反應一晚上。加入 300 µg ( 6
µ
l) RNase A 和 150 U ( 15µ
l ) RNase T1，且在 37℃下反應一小時。以等體積 的氯仿萃取，除去 RNase A 和 RNase T1，離心 10 分鐘。收集上清液，且重 複沉澱和洗清的步驟。將 DNA 放於 3 ml 的 HPLC 滅菌水中且保存於–20℃的冰箱。
(三) 高壓液相層析儀加電化偵測儀( HPLC/ECD )的測量
將萃取的 DNA，以高壓液相層析儀加電化偵測儀( HPLC/ECD )來分析 8-OhdG 之量。HPLC 先以 10% methanol water，以每分鐘 0.8 ml 的速率來洗 脫，再換為 50mM CH3COONa 為 mobile phase。取 1 pmole、2 pmole、6 pmole、
18 pmole、54 pmole、108 pmole 的 50
µ
l 8-OHdG standard 和 10 nmole、25 nmole、50 nmole、100 nmole、250 nmole 的 dG standard，分別注射到 C18 5U column，畫出 8-OHdG standard curve 及 dG standard curve 檢量線圖。再分別 取 50µl 的 DNA 水解物注射到 C18 5U column，以 HPLC-ECD 及 UV detector 檢測，利用每 106個 dG 含多少 8-OHdG 來表示。第三節 脂質過氧化物( LPO)的定量
(一)材料
將輻射照射的老鼠於採血後犧牲，取肝臟放於-80 ℃保存。
(二) 方法
取 liver 約 200 mg 加入 2 ml 的 1.15% KCl，在冰浴中平均磨碎，研磨 15 min，休息 15 min，共 5 次，以 4℃、3000 rpm 轉速離心 5 分鐘，用 pipetment
沖吸均勻後再吸取上清液 0.2 ml，依順序加入 8.1% sodium dodecyl sulphate ( SDS )、 0.2 ml、 H2O 0.6 ml、 Acetic acid ( 20% ) 1.5 ml、0.8% thio- barbituric acid ( TBA ) 1.5 ml，調整體積至 4 ml，搖勻，於 100℃水浴反應 1 小時，沖 水冷卻，加入 1 ml H2O 使體積至 5 ml，加入 4 ml n-butanol /pyridine ( 15:1)，
調整體積至 9 ml，搖勻，以 25 ℃、3000 rpm 轉速離心 15 分鐘，取上清液 1ml 放入拋棄式的測量管中，以分光光度儀測量 OD ( 532 nm )。
第四節 tk 基因突變率測試
（一）材料
1. 本實驗使用人類淋巴胚母細胞株 ( human lymphoblastoid cell line；
TK6 )
2. 豬苓多糖或WR-2721給藥：將30
µ
g/ml、100µ
g/ml、300µ
g/ml PUPs或 300µ
g/ml WR-2721加入 TK6 細胞中，經30分鐘後，以1.5 Gy之游離輻 射照射，隨即離心去除PUP和WR-2721。（二）細胞群落生成率 ( plating efficiency, PE )的計算法
將細胞轉植到96 well plate （2 cell/well/150µl細胞培養液）中，置於5
％ CO2、37℃ 恆溫培養相中培養。經12-15 天培養，計算細胞生長結 果，可以得到未添加TFT選擇性試劑之PE。
（三）突變率 ( mutant frequency, MF )的測試
將細胞接種到 96 well plate（20000 cell/well/150µl 細胞培養液）中，此 細胞培養液中含有 1µg/ ml trifluorthymidine ( TFT )之選擇性試劑，可以 有效篩選 tk-fast 基因突變率，將培養盤置於 5％ CO2、37℃ 恆溫培養 相中培養。經 10 天培養，計算細胞生長結果，利用 PE 的算法，可以 得到添加 TFT 選擇性試劑之 PE，即可得到 tk-fast 基因的細胞突變率，
經 10 天後，再加入 1µg/ ml TFT 之選擇性試劑，即可得到 tk-slow 基 因突變率。
（四）計算公式
a.細胞的群落生成率 ( plating efficiency, PE ) PE = ( -ln[p(0)])/原先加入well內的細胞數
p(0) = ( total well數 – 有細胞群落的well數 )/total well數
b.細胞突變率 ( mutant frequency, MF ) MF = PE in TFT/PE without TFT
PE in TFT：有添加 TFT 的plate所計算出的PE
PE without TFT：沒有添加 TFT 的plate所計算出的PE
第五節 統計分析方法
利用 Student t-test 方法來分析。Student t-test 主要是在分析兩組間的差異 性，p 值小於 0.05 表示有統計上的意義。
第四章 結果
第一節 豬苓多糖對輻射誘發 TK6 細胞微核之劑量反應關係
豬苓多糖給藥劑量對於輻射後 TK6 細胞微核產生的影響，其結果見表 4-1 所示。本實驗使用人類淋巴胚母細胞株 ( human lymphoblastoid cell line；
TK6 )，分別給予 300
µ
g/ml、100µ
g/ml 、30µ
g/ml 劑量的 PUPs ，30 分鐘 後照射 1.5 Gy的游離輻射，48 小時後製片、計數微核，其中 30 µg/ml 的 PUPs 劑量對陽性對照組微核率並無明顯下降，因此對細胞無明顯保護作用； 100µ
g/ml 的 PUPs 劑量經游離輻射後和陽性對照組比較微核生成率則有意義的 下降，但以 300 µg/ml 的 PUPs 劑量對微核產生的抑制作用達到高峰，其抑 制率達 46.2 %；三者對微核產生的抑制率並呈現劑量反應關係，從實驗可知 PUPs 在體外實驗對輻射有明顯的染色體保護作用。表 4-1 豬 苓 多 糖 對 輻 射 誘 發 TK6 細 胞 微 核 之 劑 量 反 應 關 係
Group MN/2000 cells Inhibition ratio# (%) (1) Control 8.3 ± 2.7
-- (2) 1.5 Gy 64.8 ± 13.2 0.0 (3) PUPs 300µg/ml + 1.5 Gy 38.7 ± 8.2* 46.2 (4) PUPs 100µg/ml + 1.5 Gy 51.4 ± 10.2*
23.7 (5) PUPs 30µg/ml + 1.5 Gy 58.1 ± 13.8
11.9
PUPs: Polyporus umbellatus polysaccharides; MN: micronuclei
*Significantly different from 1.5 Gy (at p<0.05)
#Inhibition ratio= (MN in irradiated group) – (MN in PUPs-pretreated irradiated group ) / (MN in irradiated group ) – (MN in control group)
n= 6~8 from three independent experiments.
第二節 豬苓多糖單獨或併用 WR-2721 對輻射誘發 TK6 細胞微核 Abbreviations for tables: PUPs, Polyporus umbellatus polysaccharides
Statistically significantly different (at p<0.05) from (1) group1, (2) group 2, (3) group 3, (4) group 4, (5) group 5, (6) group 6, (7) group 7, (8) group 8, differences within each group:
statistically significantly different (at p< 0.05) from the value of TK6 cells, n= 3~6 6.6± 0.92345678
67.9±14.01345678 15.5± 1.81245678
第三節 豬苓多糖單獨或併用 WR-2721 對輻射誘發 TK6 細胞的 細胞毒性影響
豬苓多糖和 WR-2721 對輻射誘發細胞毒性的影響，如表 4-3 所示。300
µ
g/ml 的 WR-2721 單獨或併用 300µ
g/ml 劑量的 PUPs 由細胞群落生成率 ( plating efficiency，PE )來觀察，在統計上均有意義的拮抗輻射所造成的細胞 毒性，然其差異不大；但是 PUPs 的 PE 和相對存活率並未增加，表示細胞受 Abbreviations for tables: PUPs, Polyporus umbellatus polysaccharides*Statistically significantly difference (at P<0.05) from X-ray group. n= 7~10 72.0±7.3
第四節 豬苓多糖和 WR-2721對輻射誘發 TK6 細胞的 tk 基因突變
Control 1.5 Gy PUPs 30μ
l/ml+1.5Gy
*Statistically significantly different (at p<0.05) from 1.5 Gy irradiated group, n= 3-5 replicates from two independent experiments.
*Abbreviations for tables: PUPs: Polyporus umbellatus polysaccharides ;WR: WR-2721
*
*
*
*
第五節 豬苓多糖單獨或併用 WR-2721 對老鼠的遺傳毒性試驗
為了了解 PUPs 單獨或併用 WR-2721 本身對老鼠是否具有致突變性，我 們分別給與老鼠 50 mg/Kg 及 250 mg/Kg 劑量的 PUPs 單獨或併用 200 mg/kg、400mg/kg 劑量的 WR-2721，48 小時後採血、製片、計數微核，和陰 性對照組比較，並無明顯差異，表示兩者在此一劑量下無遺傳毒性。如表 4-4 所示。
表 4-4 豬 苓 多 糖 單 獨 或 併 用 WR-2721 對 老 鼠 的 遺 傳 毒 性 試 驗
Group MNRET/1000RETs RETs/NCEs
(1) Control 1.9±0.9
7.0±1.7 (2) 6 Gy 38.6±8.7 0.6±0.4 (3) PUPs 50 mg/kg 1.9±0.8 5.9±1.9 (4) PUPs 250 mg/kg 2.5±1.4 7.9±1.4 (5) WR-2721 200 mg/kg 2.4±1.8 6.8±1.0 (6) WR-2721 400 mg/kg 3.0±0.7 5.4±1.3 (7) PUPs 50 mg/kg+WR-2721 200 mg/kg 1.8±1.6 5.7±2.7
Abbreviations for table: PUPs, Polyporus umbellatus polysaccharides； MNRETs:
micronucleated reticulocytes；RETs: reticulocytes；NCEs: normochromatic erythrocytes.
n= 6 except WR-2721 400 mg/kg group.
1.9±0.9 7.0±1.7 38.6±8.7 0.6±0.4 1.9±0.8 5.9±1.9 2.5±1.4 7.9±1.4 2.4±1.8 6.8±1.0 3.0±0.7 5.4±1.3 1.8±1.6 5.7±2.7
第六節 豬苓多糖給藥時間對輻射誘發老鼠周邊血微核之影響 30.4/1000 RETs，可見輻射前 30 分鐘給藥的時間點是抑制的高峰。PUPs 對於 輻射誘發微核產生的抑制率也達到 41.1%的能力，因此豬苓多糖對於游離輻
MNRETs: micronucleated reticulocytes; RETs: reticulocytes ； NCEs: normochromatic erythrocytes； PUPs: 50 mg/kg of Polyporus umbellatus polysaccharides.
Differences within each group: significant different (at p<0.05) from (1) group1, (2) group 2, (3) group 3, (4) group 4, (5) group 5, (6) group 6, (7) group 7
n= 6~8 from four independent experiments.
# Inhibition ratio = (MNRETs in irradiated group) – (MNRETs in PUPs-pretreated irradiated group ) / (MNRETs in irradiated group ) – (MNRETs in control group)
1.9±0.924567 -- 7.0±1.7
第七節 豬苓多糖單獨或併用 WR-2721 對輻射誘發老鼠周邊血微
Abbreviations for tables: PUPs, Polyporus umbellatus polysaccharides
Statistically significantly different (at p<0.05) from (1) group1, (2) group 2, (3) group 3, (4) group 4, (5) group 5, (6) group 6, (7) group 7, (8) group 8, differences within each group:
statistically significantly different (at p< 0.05) from the value of peripheral blood, n= 8~10 2.1± 0.5 2345
第八節 豬苓多糖對 CP 誘發 TK6 細胞的微核試驗
實驗中均加入 S9，S9 為肝臟萃取物，可將 CP 活化， CP 雖為強的致突 變劑，但須經肝細胞 p450 活化才能與 DNA 反應；實驗開始我們先作 CP 的 劑量反應關係，以 80
µ
g/ml 與 120µ
g/ml 的 CP 劑量引發的微核生成率與陰性 對照組比較有明顯的差異，且 120µ
g/ml 明顯比 80µ
g/ml 誘發較高的微核。於 表 4-2 結果得知 300µ
g/ml 的 PUPs 能有意義降低游離輻射誘發的微核生成 率，所以將 PUPs 和 120µ
g/ml 劑量的 CP 合用，結果發現 PUPs 對化療藥物 誘發的染色體的保護作用也良好，在統計上能有意義的降低微核數，其抑制 率達 42.1 %。如表 4-7 所示。表 4-7 豬 苓 多 糖 對 CP 誘 發 TK6 細 胞 的 微 核 試 驗
Group MN /2000 cells Inhibited ratio(%)
(1) Control 7.3±0.4
- (2) CP 80 ug/ml +S9 10.8±0.4
- (3) CP 120 ug/ml +S9 22.0±1.4
0 (4) PUPs 300g/ml+CP 120 ug/ml +S9 15.8±1.8* 42.1
*Statistically significantly different (at p<0.05) from CP group, n= 2-3 replicates from two independent experiments.
Abbreviations for tables: PUPs: Polyporus umbellatus polysaccharides ; CP: cyclophospamide
7.3±0.4 - 10.8±0.4 - 22.0±1.4 0.0 15.8±1.8* 42.1
第九節 豬苓多糖對 CP 誘發老鼠周邊血微核的試驗
Abbreviations for tables: PUPs, Polyporus umbellatus polysaccharides;
CP, cyclophosphamide
*Statistically significantly difference (at p<0.05) from CP group, n= 6~7 from four independent experiments.
第十節 豬苓多糖和 WR-2721 對輻射誘發氧化 DNA 傷害的影響
ICR 老鼠給以 50 mg/Kg 劑量的 PUPs 或 200 mg/kg 劑量的 WR-2721，以 6 Gy的游離輻射照射，48小時後犧牲老鼠取出肝臟，抽取 DNA，以 HPLC/ECD 來測量 8-OHdG 值，如圖 4-2 所示。陽性對照組可誘發 8-OHdG 的增加，而 PUPs 或 WR-2721 均能有意義的降低 8-OHdG 值，由圖 4-2 看出 WR-2721 效 果更好。
圖 4-2 豬 苓 多 糖 和 WR-2721 對 輻 射 誘 發 氧 化 DNA 傷 害 的 影 響
*Statistically significantly different (at p<0.05 ) from 6 Gy irradiated group, n= 3 replicates from two independent experiments
Abbreviations: PUPs:Polyporus umbellatus polysaccharides; WR,WR-2721
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Control 6Gy PUPs+6Gy WR2721+6Gy
8-OHdG/dG (xE-6)
*
*
*
第十一節 豬苓多糖和 WR-2721 對輻射老鼠脂質過氧化物的影響
豬苓多糖和 WR-2721 對脂質過氧化物的影響，如表 4-9 所示。ICR 老鼠 給以 50 mg/Kg 劑量的 PUPs 單獨或併用 200 mg/kg 劑量的 WR-2721，以 6 Gy 的游離輻射照射，48 小時後犧牲老鼠取出肝臟，PUPs 和 WR-2721 對游離輻 射後所誘發的脂質過氧化物的增加，和陽性對照組比較，均有下降的趨勢，
尤其 PUPs 降低輻射誘發 LPO 作用非常明顯（p < 0.005），其降低脂質過氧化 的效果亦較 WR-2721 為佳，可見在抗脂質過氧化物產生的機轉上，PUPs 在 統計上能非常有意義的抑制。
表 4-9 豬 苓 多 糖 和 WR-2721 對 輻 射 老 鼠 脂 質 過 氧 化 物 的 影 響
Group Liver peroxide level (nmol/g)
(1) Control 90.6±17.4 2
(2) 6Gy 123.3±23.1134
(3) PUPs 50mg/kg+ 6Gy 78.7±11.5 24
(4) WR-2721 200mg/kg+ 6Gy 95.8±13.6 23
Abbreviations for tables: PUPs, Polyporus umbellatus polysaccharides
Statistically significantly different (at p<0.05) from (1) group1, (2) group 2, (3) group 3, (4) group 4, n= 4~7
90.6 ± 17.42 123.3 ± 23.1134 78.7 ± 11.524 95.8 ± 13.623
第五章 討論
第一節 豬苓多糖之輻射防護作用
一 、 WR-2721 之 應 用
於癌症病人以輻射或化療藥物治療中，加用防護劑來輔助，不只可以增進 治療的成效，也可以降低輻射及化療所引起的副作用如突變和二次致癌的危 險性，WR-2721 是大家熟悉的輻射防護劑，於第二次世界大戰時由美國陸軍 研發出來為了保護戰場上的士兵，根據研究指出 WR-2721 可以保護正常組織 免於輻射或化療藥物所導致的細胞毒害，但 WR-2721 有低血壓( 57% )、面潮 紅( 39% )、打噴嚏( 29% )、噁心( 11% )和惡寒( 4% )的副作用；WR-2721 的 給藥方式一般在輻射或化療投予前 30 分鐘以輸注的方式在 15 分鐘內完成，
由此可知其藥效短暫，使用上也不方便( Hospers,1999 ),所以在臨床使用有一 定 的 限 制 ； 目 前 已 找 出 一 些 毒 性 較 小 的 輻 射 防 護 劑 Ocimum sanctum
（Ganasoundari et al.,1998）， ß-carotene（El-Habit et al.,2000）， Geniposide ( Hsu et al.,1997 )， flavonoids（Shimoi et al.,1994） 和 polysaccharides
（Patchen et al.,1992） 等來輔助或替代 WR-2721 以減低病人的不適感，而 豬苓多糖的著力點也在此。
WR-2721 在鹼性磷酸酵素( alkaline phosphatase ) 存在下產生去磷酸化作 用而成游離硫羥基（thiol-）的活性成分 WR-1065，其防護作用機制如 捕捉自由基 、以氫離子的轉移來修補 DNA 上之 free radical、WR-2721 本身 去磷酸產生 WR-1065，再經氧化作用形成雙硫化合物( disulfide )（附圖 4），
同時消耗掉氧( Trestses et al.,1991 )，而且雙硫化合物和 DNA 結合後可穩定 DNA 和抑制 DNA 的複製，藉此來延長 DNA 的修復時間( Geraldine et al.,1988 )，而豬苓多糖的作用機轉是否如此，則有待進一步的探討。
以 35S radiolabeled 之 WR-2721 來研究，知其在正常細胞中含量較高，
以 35S radiolabeled 之 WR-2721 來研究，知其在正常細胞中含量較高，