第三章 材料與方法
5. 進行濃度定量。
3-13 蛋白質定量步驟
儀器：分光光度計 Spectorphotometer Beckman DU 650 定量方法：
本實驗所採用之蛋白質濃度定量方式，是Bradford dye-binding method [101, 102]。樣本液加入Dye reagent (CASNr 7664-38-2 Phosphoric acid, CASNr 67-56-1 Methanol; Bio-RadTM)，使用波長595nm測其吸光值。
以BSA(bovine serum albumin)當標準品，製作不同濃度的測試點，
畫出校正線，並以內插法算出樣本液的蛋白質濃度。最後將樣本液調製 成濃度：200 μg 於 350 μl中，儲存於-80℃下備用。
3-14 等電點集焦凝膠電泳
所謂的等電點(isoelectric point)，就是一個分子其所帶的淨電荷為零 時的pH值，當蛋白質處於等電點時，在電泳時會停止移動，利用此原理 達到分離蛋白質之目的。我們先採用等電點集焦電泳(Isoelectric
Focusing; IEF)，進行第一次元橫向的蛋白質分離。
電泳儀：Protean IEF cell (Bio-Rad)如圖3.7。膠條：IPG strips (immobilized pH gradient gel, Bio-Rad readyStripTM, PH 3-10, non-linear, 17 cm)。樣本量：200μg in 350μl
電泳儀之條件參數設定，見表 3.4。
Rehydration 條件設定 active、50V、溫度 20℃。
Conditioning Step(S1)設定 250 V、15 分鐘，此階段使用較低的電壓伏特 數來移除鹽類離子與電荷等干擾物質。
Voltage Ramping(S2)設定為 Rapid、HRS:MIN：10000V、hours：03:00。
Final Focusing(S3)選用搭配 17cm 膠條的 10,000 V。
Hold step(S4)設定維持在 500V。Method：RAPID ΔV。
LIMIT / GEL 設為 50μA。電泳時間需隔夜。
圖 3.7 Bio-Rad Protean IEF cell 電泳儀
表 3.4 IEF 電泳儀條件設定 (Preset method for 17 cm strip) R-Rehydration Active at 50 V，temp. 20℃
S1-Conditioning Step 250 V for 15 minutes
S2-Voltage Ramping Rapid HRS:MIN：10000V vhours：03:00 S3-Final Focusing 10,000 V Æ60,000
S4-Hold step 500 V/HOLD
後續處理步驟：
1. 調配試劑(IEF balance buffer 註1)備用。
2. 等電點集焦電泳完成後，用夾子將膠條夾起，直立於拭鏡紙上，滴掉 上面的礦物油。
3. 將膠條置放於 IEF holder 內，加入 9ml IEF balance buffer，0.18g DTE (Dithioerythritol)，室溫下，混合均勻 15 分鐘。
4. 將膠條夾起，更換至另一個新的 IEF holder 內，加入 9ml IEF balance buffer，0.225g IAA (Iodoacetamide)，室溫下，混合均勻 15 分鐘。混 合均勻。
註1
IEF balance buffer：
50mM pH 8.8 Tris-HCL 3.3ml, 6M Urea 36g, 30% Glycerol 30ml, 2%
SDS (sodium dodecyl sulfate) 2g 加二次水至100ml。
3-15 SDS-PAGE第二次元電泳
第二次元縱向電泳，採用Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)方式進行，依分子大小再進一步將蛋白質分 離。
3-15-1 SDS 膠片調配方法
製備 12 %Tris-glycine SDS Polyacrylamide 膠片(50 ml/gel)，以供第 二次元電泳使用，使用的試劑如表 3.5 所示。
表 3.5 SDS-PAGE gel 配製方法 (50 ml/gel) 12%
試 劑 組 成 份 廠 牌 劑量 (ml)
H2O 21.50
40% acrylamide mix CASNr 79-06-1 Acrylamide CASNr 110-26-9
N,N’-methylene-bis-acrylamide
Bio-Rad 15.00
1.5 M Tris (PH8.8) C4H11NO3 Amresco 12.50 10% SDS Sodium dodecyl sulfate Bio Basic
inc. 0.50 10% APS ammonium persulfate 0.50
3-15-2 第二次元電泳過程
1. 架設電泳膠台，倒入少量75%酒精，檢視是否滲漏。
2. 倒掉酒精，加入50 ml已配妥之12% SDS-PAGE gel (見表3.4)。
3. 加入0.02 ml TEMED(tetramethylenediamine; Amresco)，混合均勻。
4. 加入3-5 ml 75%酒精，將氣泡排擠出來。
5. 待凝固後，將酒精倒掉，以二次水清洗，並將水倒乾。
6. 用夾子，將IEF膠條放置於SDS-PAGE gel上層，放置時避免膠面碰
觸玻璃。
7. 吸20 µl protein marker放入正極側。
8. 加入0.5% Agarosesolution註1，覆蓋於膠條上，勿超出膠台上緣。
9. 待其凝固後，上機，開始電泳。
註1
Agarose solution：
取0.5% Agarose 0.5 g溶解，溫度控制在45~50℃，加入電泳緩衝液 ( TG-SDS buffer：Tris 0.025 M, Glycin 0.192 M, SDS 0.1 %) ，及指 示劑(Bromphenol blue) 1 ml。
3-15-3 第二次元電泳條件設定
第二次元電泳儀器採用 BIO-RAD 二維電泳系統(Protein II cell)，條件設 定為兩片膠，32mA，time 選 / v-hour，step 1 time：00:30，Step2 constart：
60mA，time / v-hour，電泳時間設 99:99，可電泳至隔夜。
3-16 膠體染色
SDS-PAGE電泳完成後，進行膠體染色，試劑採用奇異公司(General Electric Company，GE)的Silver stain kit ( PlusOne Silver Staining Kit, Protein )。
膠體染色步驟
1. Fixing：加 30% Ethanol 75 ml，Glacial acetic acid 25 ml，加二次水至 250ml，置於 Lab Rotator (DigiSystem Industrial Inc.) 50 rpm，均勻搖 晃 120 分鐘。
2. Sensitizing：倒掉前步驟之溶液，加 Ethanol 75 ml，Sodium thiosulphate 10 ml，Sodium acetate 17 g，加二次水至 250 ml，再加入 1.25 ml
3. Silver stain：倒出前步驟之溶液，加 Silver nitrate solution 25 ml，加 二次水至 250 ml，再加入 0.1 ml formaldehyde，置於 Lab Rotator 50 rpm，均勻搖晃 120 分鐘。
4. Developing：倒出前步驟之溶液，加 Sodium carbonate 6.25 g，加二 次水至 250 ml，再加入 0.2 ml formaldehyde 置於 Lab Rotator 50 rpm，
均勻搖晃 4 分鐘。
5. Stop：倒出前步驟之溶液，加 3.65 g EDTA-Na2H2O，加二次水至 250 ml，置於 Lab Rotator 50 rpm，均勻搖晃 120 分鐘。
6. Washing：倒出前步驟之溶液，以二次水清洗五次，每次五分鐘。
3-17 膠體影像擷取與分析
3-17-1 膠體影像擷取
染色後膠片，使用掃描器Bio-Rad GS-800 Image Densitometer®
(California, USA)進行掃描(圖3.8)，儲存成預設的gsv影像檔格式。
掃描條件設定：Gel: Silver stain, Filter: White, Light: Transmmissive, Resolution: X 63.5, Y 63.5 microns。
圖 3.8 掃描器 Bio-Rad GS-800 Image Densitometer
3-17-2 膠體影像分析與蛋白質點比對
前步驟掃描完成之影像檔，採用比對軟體進行蛋白質點之分析。本 研究採用PDQuest 8.0.1試用版(Bio-Rad)(圖3.9)，藉由其experiment wizard 之輔助，normalization參數選擇：local regression method。
經比對後，若發現蛋白質點之quantity ratio超出2倍者，視為有差異，
則將其列入等待研究之蛋白質點，進行後續的挖膠、蛋白酶水解、質譜 儀分析等程序。
圖 3.9 PDQuest 2-D Analysis Software
3-18 膠體內蛋白酶水解
膠體內蛋白酶水解(in-gel digestion)步驟是遵循 Bruker DaltonicsTM公司 提供的 Proteomic protocols for mass spectrometry (2008 版本)[103-105]。
使用試劑如表 3.6 所示。
(一)、切割蛋白質膠塊
1. 使用二次水清洗膠體兩次，每次 10 鐘。
2. 使用 pipet tip，把蛋白質點從膠體挖出。
3. 取 1.5 ml 的 Eppendoff 試管，使用 100%ACN 註1清洗，風乾。
4. 將膠塊放入 Eppeddoff 試管內。
(二)、膠塊清洗
1. 使用 100μl 的 wash buffer 註2清洗膠塊，15 分鐘，每 5 分鐘振 盪一次。
2. 移去殘留液體，加入 200μl 的去銀染脫色液(Silver destain solution)註3。
3. 脫色時間，不可超過五分鐘。
4. 移除脫色液，以 200μl 的 25 mM ammonium bicarbonate buffer
註4
清洗膠塊，重覆此步驟兩次，清除染色直至膠塊透明無色。
5. 移去殘留液體，並加入 100μl 的 ACN 覆蓋膠塊。
6. 待膠塊縮小後，移去 ACN。
7. 使用真空離心機將膠塊乾燥或任其風乾(air dry)。
(三)、膠內蛋白酶分解(Trypsin)
1. 加入 3μl 新鮮配製的酵素溶液(20 ng/μl trypsin, in 25 mM NH4HCO3)覆蓋膠塊。
2. 4℃，反應 60 分鐘。
3. 加入 3μl 的 25 mM NH4HCO3溶液，放置隔夜，並保持濕潤，
注意勿加太多溶液。
4. 37℃下反應，放置隔夜。
(四)、萃取蛋白質胜肽
1. 確認管內是否還有大約 3μl 的液體。
2. 加入 2μl 的 100% ACN 與 1% TFA註5。 3. 超音波震盪 (sonication) 10 分鐘。
4. 吸出上清液，進行質譜儀分析。
表 3.6 蛋白酶水解使用試劑
試 劑 名 稱 組成份或要求等級
註1
ACN (Acetonitrile) 50% CH3CN (HPLC 等級)
註2
wash buffer 2.5 mM NH4HCO3, 50% ACN
註3
脫色液 Silver destain solution 0.1 g Potassium ferricyanide, 0.15 g Sodium thiosulfate in 10 ml Milli Q water
註4
Ammonium bicarbonate buffer NH4HCO3 註5
TFA 1% Trifluoroacetic acid
Trypsin solution 20ng/μl trypsin (sequencing 等級) in 10mH NH4HCO3, pH 8
3-19 質譜儀分析
本研究採用：基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometer, MALDI-TOF MS)，進行胜肽質量分析。
儀器：Brucker ultraflex IIITM mass spectrometer，如圖3.10所示。
Matrix：α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)。
取前步驟萃取完成之上清液，滴置於質譜儀樣本盤上，滴上matrix (CHCA)覆於其上，待風乾後，送入質譜儀內，進行分析。
圖 3.10 Brucker ultraflex III mass spectrometer
3-20 蛋白質身份鑑定--網路資料庫比對
本研究同時使用多種工具程式，鑑定比對蛋白質身份。
首先，將質譜儀偵測所得胜肽數據資料，委由本校貴重儀器中心之 蛋白質序列資料庫伺服器比對搜尋，產生鑑定報告。我們再採用 Bruker 公司提供的比對軟體 BioToolsTM v.3.0 及 flexAnalysisTM v.3.0 確認比對，
並連結上 MASCOT 蛋白質序列資料庫網站搜尋確認，並檢視該蛋白之 相關資訊。
MASCOT 網路資料庫搜尋界面，是由 Matrix Science 公司所維護。
使用者把質譜儀產生的胜肽數據，依特定的檔案格式，先經由其搜尋界 面(圖 3.11)設定搜尋條件，再透過網際網路(The Internet)傳送給資料庫伺 服器，經過內部程式運算，將胜肽的質量、強度等數據與既有的蛋白質 資料庫互相配對比較，並採用一種名為『機率基礎的分子量搜尋計分演 算法』( probability-based MOWSE scoring algorithm )計算配對成功的機 率[106]。此項分數越高，代表正確配對的機率越高。
圖 3.11 MASCOT 網路資料庫搜尋界面
本實驗所使用 MALDI-TOF 質譜儀，其產生的胜肽片段(peptide fragment)以質量(mass value)與強度(intensity)為主，因此配對方式以 PMF( peptide mass fingerprint )為主，與序列資料庫 NCBInr，
SwissProt，,MSDB 等進行配對。
實驗結果，如果配對分數超出顯著水準者，我們稱之為「有效配對」
(亦即 significant match)，則將其列為尋獲的蛋白質，並進一步探討其可 能之作用機轉。搜尋條件設定如下：Type of search ( Peptide Mass
Fingerprint ), Enzyme ( Trypsin ), Global modification ( Carboxymethyl (C) ), Variable modifications (Oxidation (M) ), Mass values ( MH+;
Monoisotopic ), Protein Mass ( Unrestricted ), Peptide Mass Tolerance (±
100 ppm ), Peptide Charge State ( 1+), Max Missed Cleavages (1)。
除此之外，我們也採用簡易版的 Mascot 搜尋界面逐一比對。Mascot 提供一個簡易版的伺服器界面，名為 Mascot Wizard (圖 3.12) ，讓無法 建構完整伺服器的使用者，也能從家中個人電腦完成比對工作。不過使 用前必須先自行將胜肽片段質量數據(mass value)，轉換成文字檔格式 ( txt )，再將此檔拖弋進入 Mascot Wizard 執行畫面，即可連線上網比對，
而其結果將會以網路瀏覽器格式傳回給使用者。
圖 3.12 Mascot Wizard 簡易版搜尋界面
為了簡化檔案轉換的前置處理作業，筆者自行撰寫一個轉換程式做 為輔助，名為 PIDwizard，見圖 3.13。
本實驗中每一個樣本點分析後產生的質譜數據檔案之中，有一名為 peaklist.xml 的檔案，此檔記錄著質量、強度等數據；此程式可先行搜尋 檔案資料夾，將此檔找出，再將此 xml (extensive markup language)檔案 解析(parsing)，並取出 mass value 及 intensity 數據，存成 txt 文字檔格式，
即可進入 Mascot Wizard 逐一執行比對。
兩程式的搭配整合示意圖，如圖 3.14 所示。為了測試轉檔的正確 性，我們使用原廠提供的樣本檔案(Bovine serum albumin)經 PIDWizard 轉換後，交由 MascotWizard 進行搜尋比對，其結果見圖 3.15，可見其正 確配對結果。
圖 3.13 PIDWizard 執行畫面
圖 3.15 PIDWizard 搜尋 Bovine serum albumin 之傳回結果 圖 3.14 MascotWizard 與 PIDWizard 整合示意圖
XML file
Sequence database
Txt file MALDI-TOF
PIDWizard
MascotWizard
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