left (gm) 1.83 ± 0.34 1.83 ± 0.33 1.64 ± 0.47 1.68 ± 0.07
Kidney weight,
right(gm) 1.91 ± 0.50 1.74 ± 0.21 1.73 ± 0.49 1.66 ± 0.18
EG: 乙二醇 WLS: 五苓散 Starch: 澱粉數據以平均值±標準差(Mean ± S.D.)表示。統計方法使用one-way ANOVA test。
a 代表與正常對照組比較後有顯著差異者。
體重增加值(body-weight-gain)的計算方式是每隻大鼠實驗後的體重減去實驗前的體 重。結果顯示：與對照組比較之下，安慰劑組大鼠的體重增加值明顯地減少(p=0.007)。
4-3 腎臟病理變化
檢視腎臟組織切片發現，正常對照組的大鼠腎臟都沒有鈣化結晶現 象。但是，飲用含有乙二醇添加水的其它三組大鼠，在它們的腎皮質或 腎髓質部位，都可以發現程度不等的結晶沉積現象。使用光學偏光顯微 鏡檢視之下，此種結晶呈現出特殊的雙折射特徵(birefringent
appearance)，有如圖4.1所示。同時也發現多項病理變化：腎小管內結晶、
結晶塊阻塞集尿管腔、腎管上皮細胞損傷、組織間質發炎反應以及巨噬 細胞吞食結晶等現象(圖4.2~圖4.4)。
圖 4.1 草酸鈣結晶呈現雙折射特徵 圖 4.2 結晶阻塞腎小管
圖 4.3 腎小管上皮細胞損傷發炎 圖 4.4 吞噬細胞包圍結晶體
4-4 腎結晶嚴重度評分結果
結晶沉澱嚴重度評分的分析結果顯示，餵食五苓散的兩組(第3組與 第4組)大鼠的腎結晶程度，顯著地低於安慰組(p=0.034)，如表4.4所示。
安慰劑組的嚴重度平均分數是1.40，低劑量組是0.46，而高劑量組 是0.45。使用Kruskal-Wallis test統計方法分析，顯示出此三組的「腎結 晶嚴重度分數」具有顯著性的差異(p= 0.034)。代表餵食五苓散的確可以 有效的抑制腎內草酸鈣的結晶沉積。
再以Mann-Whitney U test，分別比較各實驗組與安慰劑組的差異，
顯示第3組(p=0.019)與第4組(p=0.035)的「腎結晶嚴重度分數」，都顯著 地低於安慰劑組。
表 4.4 腎結晶嚴重度評分結果
組別 動物數量 餵食方式 結晶分數
(平均值±標準差)
P value
Group 2 11
EG + Starch 1.40 ± 1.20Group 3 11
EG + WLS(low dose) 0.46 ± 0.72 * 0.019*
Group 4 11
EG + WLS(high dose) 0.45 ± 0.88 * 0.035*
結晶分數以平均值±標準差(Mean ± S.D.)表示之。
使用 Kruskal-Wallis test 比較三組之差異，p=0.034。
*
代表使用 Mann-Whitney U test 分析，各實驗組與安慰劑組之間有顯著性差異者。4-5 結石發生率與相對危險性分析
各組的「結石發生率」計算方法是：該組有結晶的大鼠數量除以該 組大鼠的總數量。表4.5呈現出各組的結石發生率與相對危險性(relative risk)的結果，從此表可看出，安慰劑組(group 2)的結石發生率高達 90.9%，而餵食低劑量五苓散組(group 3)的結石發生率降到81.8%，餵食 高劑量五苓散組(group 4)的結石發生率降到72.7%。此一結果表示餵食五 苓散可以有效的減少大鼠腎結石的發生機率。
同時，與安慰劑組相較之下，餵食五苓散的兩組大鼠其罹患腎結石 的相對危險性(relative risk)也比較低：低劑量組是0.90，而高劑量組是 0.80。
表 4.5 大鼠腎結石發生率與相對危險性分析 組別 有結石的
大鼠數量
無結石的 大鼠數量
該組大鼠 總數
結石發 生率
Relative
risk 95%信賴區間
1. Normal 0 8 8 0 %
2. Placebo 10 1 11 90.9 % 1.00
3. Low dose 9 2 11 81.8 % 0.90 0.0347 ~ 5.8437
4. High dose 8 3 11 72.7 % 0.80 0.0231 ~ 3.0801
相對危險比(relative risk)：第 3、4 組分別與安慰劑組(第 2 組)比較。
4-6 蛋白質比對結果
Mascot 網路資料庫的搜尋法則，係採用 probabilty based Mowse scoring 演算法[106]。此項分數越高，代表正確配對成功的機率越高。我 們把分數超出顯著水準(significant level < 5%)的蛋白質比對結果，列為 本研究所尋獲之蛋白質，分別列示於表 4.6 至表 4.8。
在安慰劑組中發現的蛋白質 AGT2 (丙氨酸乙醛酸轉氨酶;
Alanine-glyoxylate aminotransferase 2; EC 2.6.1.44)，其功能是藉由 Cofactor: pyridoxal 5’-phosphate 的輔助，催化 L-alanine 與 glyoxylate 作 用，產生 pyruvate 與 glycine；此酵素與解毒有關。從網路資料庫比對 結果出此一蛋白質，呈現於圖 4.5。從圖 4.6 與圖 4.7，可看出 AGT2 在膠片上的相關位置。
圖 4.5 AGT2 網路資料庫比對結果
AGT2; Alanine-glyoxylate aminotransferase 2, mitochondrial precursor - Rattus norvegicus (Rat)
Score: Probability Based Mowse Score 52
Nominal mass (Mr): 57164; Calculated pI value: 8.33
圖 4.6 AGT2 膠片比對圖。AGT2 係由中間膠片編號 6703 蛋白 質挖出。中間膠片是安慰組，右側膠片是對照組。
圖 4.7 AGT2 在膠片上位置
200kDa 116.3kDa
97.4kDa 66.3kDa 55.4kDa
36.5kDa 31.0kDa
21.5kDa
14.4kDa
No.39
萃取對照組與安慰劑組腎組織的RNA，並施行反轉錄(reverse transcription)(使用引子primer 5’-ctt ctg tgg cca cgt caa t-3’ forward, 5’-cgt cat cca tgg cga act-3’ reverse)，再進行定量聚合酶連鎖反應(quantitative real-time PCR)比較兩組之表現量差異。發現腎結石組鼠腎AGT2的 mRNA表現量明顯地高於正常組，達2.69倍(p<0.05)，如圖4.8所示。
圖 4.8 正常組與安慰劑組腎臟 AGT2 的 mRNA 定量比較圖。
安慰劑組的 mRNA 表現量高於正常組的 2.69 倍 (p<0.05)
表 4.6 蛋白質鑑定結果 (對照組)
G R Cp protein ID Tx RecName AltName Accession Sc Cv MW Id
Md1 42 B13 aldo-keto reductase family1,member A1(NADPH2, aldehye reductase)
R aldo-keto reductase family1, member A1 ( NADPH2, aldehye reductase )
Aldehyde
R Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( EC 1.2.1.12 )
GAPDH gi|62318276 100 39 36095 I
1 42 B15 ETFA_Rat, electron transferring flavoprotien, alpha polypeptide
R ETFA gi|57527204 117 44 35277 I
1 42 B17 G3P_Rat,
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)
R Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( EC 1.2.1.12 )
GAPDH gi|62318276 102 41 36095 I
1 43 A04 ACT_HYDAT, Actin non-muscle 6.2
H Actin non-muscle 6.2 102 35 42002 I
1 43 B08 aldo-keto reductase family1,member A1(NADPH2, aldehye reductase)
R aldo-keto reductase family1, member A1 ( NADPH2, aldehye reductase )
Aldehyde reductase;
Akr1A1
gi|13591894 97 12 36715 I
1 43 B08 AK1R1_Rat, Alcohol dehydrogenase [NADP+]
R aldo-keto reductase family1,member A1
Taxonomy ( R: Rattus norvegicus, H: Hyda vulgaris, M: Mus musculus, S: Homo sapiens )
identity status : I: identified, U: uncertain Method ( T100: tryptic map 100 ppm , T150: tryptic map 150 ppm)
表 4.7 蛋白質鑑定結果 (第二組 安慰劑+EG)
G R Cp protein ID Tx RecName AltName Accession Sc Cv MW Id M
2 39 C07 SMC1A_RAT, Structural maintenance of chromosomes protein 1A
R Structural maintenance of chromosomes protein 1A
SMC-protein 59 24 143116 I
2 39 C08 GRB14_RAT, Growth factor receptor-bound protein 14
R Growth factor receptor-bound protein 14
GRB 14 adapter protein
53 26 60554 I
2 39 C08 SLMAP_RAT, Sarcolemmal membrane-associated protein
R Sarcolemmal
membrane-associated protein
SLMAP 53 17 99033 I
2 39 C09 ZFP90_RAT, Zinc finger protein 90 R Zinc finger protein 90 Zfp-90 51 34 72392 I
2 39 C12 LMNA_RAT, Lamin-A R Lamin-A Lmn 1 57 35 74569 I
2 39 C12 SMC1A_RAT, Structural maintenance of chromosomes protein 1A
R Structural maintenance of chromosomes protein 1A
SMC-protein 60 28 143116 I
2 39 C15 AGT2_RAT, Alanine--glyoxylate aminotransferase 2, mitochondrial precursor
R Alanine--glyoxylate aminotransferase 2, mitochondria
Taxonomy ( R: Rattus norvegicus, H: Hyda vulgaris, M: Mus musculus, S: Homo sapiens)
identity status : I: identified, U: uncertain Method ( T100: tryptic map 100 ppm , T150: tryptic map 150 ppm)
表 4.8 蛋白質鑑定結果 (五苓散+EG 組)
G R Cp protein ID Tx RecName AltName Accession Sc Cv MW Id M
4 12 G16 carbohydrate (N-acetylglucosamine
6-O) sulfotransferase 5 R 59 16 47285 U T150
4 12 G18 potassium voltage-gated channel,
Isk-related subfamily, gene R 61 22 1437 U T150
4 12 G19 rCG24972 R 55 80 4571 U T150
4 12 G22 electron-transfer-flavoprotein, beta
polypeptide R 67 30 27898 I T150
欄位說明：
G:組別 R:大鼠編號 Cp: Chip Position Tx: Taxonomy Sc: Mascot Score Cv: Mass peptide Coverage (%)
RecName: 正式名稱 AltName: 簡稱 MW: Protein Molecular weight Id: identity status Md: match method Group: 1 control 2 EG+Starch 3 低劑量 WLS+EG 4 高劑量 WLS+EG
Taxonomy ( R: Rattus norvegicus, H: Hyda vulgaris, M: Mus musculus, S: Homo sapiens)
identity status : I: identified, U: uncertain Method ( T100: tryptic map 100 ppm , T150: tryptic map 150 ppm)