第四章 結果與討論
4.1.4 離子對試劑的影響
為了測試除了 TFA 以外，是否有其他的酸類也可以誘導 ε-PL 的構 型產生變化，我們以醋酸、甲酸與三氟丙酸（TFPA）配製成流動相進 行測試。當 0.5%醋酸水溶液的 pH 值為 2.88，尚高於 0.02% TFA 的 pH 2.55，但是因為較高濃度的醋酸可能會影響到後續質譜法的使用，因此 我們以 0.5%醋酸水溶液進行實驗，觀察 TFA 與醋酸對 ε-PL 聚合物分離 效果的的影響。
在流動相由 MeOH 與 0.5%醋酸水溶液的條件下，經由 HPLC-UV-MS 分析結果如下圖（圖 4-13）。調整各種流動相比例皆無法找到分離條 件的魔術數字，且由 TIC 圖及質譜圖可以觀察到隨著流動相中 MeOH 的比例下降，ε-PL 被沖提出的比例逐漸減少，產生滯留於管柱中的現 象，不論是樣品 L 或 S 皆得到相同的結果。
圖 4-13 流動相 MeOH : 0.5% AcOH 條件下，樣品的 TIC 及質譜圖
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其次改為測試甲酸，0.5%甲酸水溶液的 pH 值為 2.55，等同於 0.02% TFA 水溶液的 pH，可以用來比較在相同 pH 的流動相條件下，以 甲酸與 TFA 做為調質劑的差異。結果顯示，以甲酸做為調質劑並不能 得到與 TFA 相同的分離結果，反而是與醋酸的結果相同（圖 4-14），無 論如何調整流動相組成皆無法找到魔術數字，隨著流動相中 MeOH 的比 例下降，不論是樣品 L 或 S，ε-PL 析出的量逐漸減少。
圖 4-14 流動相 MeOH : 0.5% FA 條件下，ε-PL 的 TIC 及質譜圖
再試著調整甲酸水溶液的 pH 值，發現 0.8%甲酸水溶液的 pH 2.25 與 0.05%TFA 水溶液相同，以 0.8%甲酸水溶液與甲醇做為流動相進行分 析，結果如圖 4-15 所示，即使增加了甲酸的濃度我們依舊無法得到與 TFA 作為流動相相同的分離結果。
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圖 4-15 流動相 MeOH : 0.8% FA 條件下，ε-PL 的 TIC 及質譜圖
我們認為醋酸與甲酸水溶液無法達到 TFA 水溶液的效果，在於這 兩者都不能是好的離子對試劑，而無法與ε-PL 作用誘導其構型或離子 性的轉變，促成不同聚合度ε-PL 與固定相之間，具有足夠的作用力差 異性而可以被有效的分離。Bobaly56等人的研究，所分析的為轉鐵蛋白 與溶菌酶兩種不同的蛋白質，兩者差異極大，藉由 pH 的調節將蛋白質 完全變性，就可以將兩者分開。相反的，藉由 pH 的調節將不同聚合度 ε-PL 變性，構型上的差異並不足以做有效的分離，還需配合 TFA 離子 對試劑的參與，改變ε-PL 的離子性質（親水性），才能達到有效分離不 同聚合度ε-PL 的效果。一系列的實驗結果顯示，由於 ε-PL 與固定相作 用力的複雜性，很難發展一套高耐變性的 HPLC 分析方法。
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檢視質譜法中的選擇離子層析圖（extracted ion chromatogram, EIC）（圖 4-19），可以發現部分 ε-PL 聚合物可以被有效分離。EIC 圖顯示從滯留 時間 2.7 分鐘開始，聚合度（n）為 25 個單體的ε-PL 聚合物依序析 出，到 13.6 分鐘時 n=34 的ε-PL 聚合物為止（圖 4-20）。單獨從 HPLC-UV 層析圖並無法觀察到這一系列聚合物的顯現，展現了質譜法在本研 究的重要性。
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圖 4-18 流動相 MeOH : 0.15% TFPA 條件下，ε-PL 的 TIC 及質譜圖
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圖 4-19 流動相 MeOH : 0.15% TFPA = 18 : 82 條件下，（A）ε-PL 的 TIC 圖 及（B）400.2、（C）413.0、（D）425.8、（E）438.6 m/z 的 EIC 圖
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圖 4-20 流動相 MeOH : 0.15% TFPA=18:82 條件下，樣品 L 的質譜圖
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質譜圖資料提供我們進一步了解以 TFA 和 TFPA 作為離子對試劑的 差異性（圖 4-21），同樣為聚合度 30 的 ε-PL，當離子對試劑為 TFA 時，質譜圖可以觀察到[ε-PL+n ---mTFA-]離子的訊號，離子電荷數分布 +4~+10 之間。相較之下，當離子對試劑為 TFPA 時，質譜圖無法記錄到 [ε-PL+n ---mTFPA-]離子的訊號，離子電荷數分布集中在高電荷數的
+8~+12 之間。TFA 和 TFPA 和表現的差異，推測是來自離子對試劑能 力的強弱，ε-PL+n 與 mTFPA-有較強的作用力，[ε-PL+n ---mTFPA-]離子 加成物能在質譜法的游離過程中存活而被觀察到，生成總電荷數較低 (質荷比較高)的離子訊號（圖 4-21）。至於[ε-PL+n ---mTFPA-]期間作用力 較弱，容易在游離過程中解離生成ε-PL+n和 mTFPA-，因此無法觀察到 [ε-PL+n ---mTFPA-]，由於 ε-PL+n的淨電荷數高於 [ε-PL+n ---mTFPA-]，質 譜圖中訊號主要為低質荷比離子。
圖 4-21 以（A）0.02% TFA 以及（B）0.15% TFPA 作為流動相，
n=30 的ε-PL 質譜圖的差異
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