HPLC 流動相沖提強度的影響

一般以 HPLC 分離蛋白質常以 MeOH 和 TFA 做為流動相組成，本 研究選擇以 MeOH（A）與 0.1% TFA（B）做為流動相，初步以 HPLC-UV 系統進行分析方法開發，試圖找出分離樣品 L 與 S 中不同聚合度 ε-PL 的最佳參數。

以梯度沖提方式將流動相由 10% MeOH 在 30 分鐘內提升到 90%，

得到的層析圖如下（圖 4-3，A 圖），分析物會在 11.12 分鐘被沖提出；

調整初始沖提比例，當流動相由 20% MeOH 在 30 分鐘內逐漸增加至 90% MeOH，意外的在層析圖上竟出現兩析出峰（圖 4-3，B 圖）第一 個析出峰滯留時間為 1.59 分鐘，第二個析出峰延遲至 8.26 分鐘；當梯 度沖提條件由 30% MeOH 在 30 分鐘內增加到 90% MeOH，分析物則在

53

1.38 分鐘也就是 t0（~1.5 分鐘）之前就被完全沖提出來（圖 4-3，C 圖），且訊號強度比 B 圖中的第一析出峰要強。

圖 4-3 以 MeOH 與 0.1% TFA 做為流動相，樣品 S 在不同梯度沖提條件 下，得到不尋常分離現象的層析圖

此外，利用 ACN 替代 MeOH 作為流動相，我們也得到了相似的分 離結果（圖 4-4），當沖提條件由 10% ACN 在 30 分鐘內提升到 90%，

分析物在 6.63 分鐘被沖提出來；若初始沖提比例調整為 15% ACN，層 析圖上卻出現多個析出峰，分別為 1.33、2.11、4.30 及 6.11 分鐘。結果 顯示分析物滯留時間會隨著 0.1% TFA 的比例增加而逐漸提前。

54

圖 4-4 以以 MeOH 與 0.1% TFA 做為流動相，樣品 S 在不同梯度沖提條 件下，得到不尋常分離現象的層析圖

進一步將圖 4-3 的 B 圖中兩析出峰蒐集並以質譜儀量測，我們竟得 到了相同的質譜資訊，表示兩析出峰皆為ε-PL，而非樣品中的不純物。

接續上述實驗結果，我們將 HPLC 系統與 Q-TOF 並聯，並改用相 對梯度更為單純的定組成操作方式，以 MeOH 與 0.1% TFA 作為流動 相，對於該特異性的分離結果進行更深入且詳細的探討。

55 度層析圖（total ion chromatography, TIC），都顯現連續多個波峰起伏

（圖 4-5）。 檢視 TIC 圖中各個滯留時間的質譜圖，發現聚合度（n）為

56

圖 4-5 樣品 L 在流動相 MeOH/0.1%TFA 組成比例為（A）50/50（B）30/70（C）25/75（D）20/80 的 HPLC-UV-MS 分析結果

57

研究結果與 2014 年 Bobaly⁵⁶等人的報告一致，他們也觀察到在低 濃度的 TFA 條件下蛋白質趨於在 t0前出現，隨著 TFA 濃度增加ε-PL 滯留時間逐漸延後，並歸因此現象來自蛋白質構型的改變。

我們同樣認為不同流動相組成會對ε-PL 聚合物的構型產生影響，高 濃度的甲醇造成ε-PL 聚合物變性，產生完全延展的構型，具有此構型 的ε-PL 聚合物因具有較大的截面積，而無法進入固定相顆粒的孔洞 中，造成滯留時間短於流動相的完全不滯留時間（t0）。隨著 TFA 含量 增加，TFA 與 ε-PL 形成離子對的機率增加，因而降低 ε-PL 聚合物的離 子性使得ε-PL 聚合物更加疏水，誘導 ε-PL 聚合物構型趨向緊密的球形 結構變化，形成的半成形蛋白球構型（molten globule）的截面積縮小，

因此不但得以進入孔洞之中，並且可以有較多的分配（partition）機制 進行，達到分離不同聚合度的ε-PL 的效果。但是過量的 TFA，卻可能 使不同聚合度的ε-PL 都形成分子化合物，失去了離子性，反而喜歡滯 留在固定相中而不易析出。

58

59

圖 4-6 流動相 MeOH : 0.1% TFA=25:75 條件下，樣品 L 於不同滯留 時間的質譜圖

60

圖 4-7 樣品 S 在流動相 MeOH/0.1%TFA 組成比例為（A）26/74（B）25/75 的 HPLC-UV-MS 分析結果

61

分離樣品 S 中不同聚合度 ε-PL 化合物的最佳流動相組成，也同樣 是在 MeOH/0.1% TFA 比例為 25 /75 時（圖 4-7），有趣的是，只是將 MeOH/0.1% TFA 比例調高為 26/74，不同聚合度的ε-PL 化合物就無法 有效分離，而不同聚合物的滯留時間有部分重疊，形成一個滯留時間跨

62