3. 西方轉漬法檢測不同光質的設定對 COP23 含量概日韻律的影響
4.2 電穿孔法
實驗進行前，將聚球藻RF-1 藻液將細胞培養在 12L/12D（30 μmol photons m-2 s-1）到所需的細胞密度，接著按照實驗步驟取40 μl聚球 藻RF-1 細胞與不同濃度的DNA（0.2-10 μg/ml）混合，經電穿孔法 後，置於 28℃、連續光照（30 μmol photons m-2 s-1）下培養過夜，再 將細胞塗抹在含 25 mg/ml chloramphenicol的BG-110固體培養基上，
經 1 星期的培養後，發現皆無任何菌落生長（Fig. 11A）。
改變電穿孔法後細胞培養的光照條件，將原來培養在連續高光照
（30 μmol photons m-2 s-1）改為連續低光照（5 μmol photons m-2 s-1） 或連續黑暗中，仍無菌落產生（Fig. 11B and C）。
上述實驗都以BG110培養液或固體培養基培養，但因經過電穿孔
的細胞比較脆弱，可能無法自行行固氮作用而無法生存，故將培養液 或培養基更改為BG11 培養液或培養基，以提供氮源給聚球藻RF-1，
但果仍無任何菌落產生（Fig. 12）。
(A)
Rel a ti v e co nten ts of COP 2 3 (% )
0
（A）SDS-PAGE 分析後，以 0.25 ﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色。
12L/12D：培養在 12 小時光照、12 小時黑暗的環境中；LDLL：培養在 12 小時 光照、12 小時黑暗的環境三天，改置連續光照中。（B）利用 AlphaImager 1220 計算SDS-PAGE 結果的電泳帶 IDV（integrated density value）所做出的圖。第一 次取樣為進入連續光照中的第25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計八次。
圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字25、29…、53 為進入連續光 照之恆定環境中的取樣時間（小時）。
0
Relative contents of COP23 (%)
0
(A)SDS-PAGE 以 0.25﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色。12R/12D：
培養在12 小時紅光、12 小時黑暗的環境中；RDRR：培養在 12 小時紅光、
12 小時黑暗的環境三天，改置連續紅光中。RFrDRR：在上述 3 天的馴化期 中，分別在進入紅光光照期的第4、6、8、10、12 小時，以 10 分鐘的遠紅光 處理，再改置連續紅光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算 SDS-PAGE 結果的 電泳帶IDV 後所做出的圖。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後 每隔4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗 期，數字25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。
(A)
25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93
Relative contents of COP23 (%)
0
(A)SDS-PAGE 以 0.25﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色。12B/12D：
培養在12 小時藍光、12 小時黑暗的環境中；BDBB：培養在 12 小時藍光、
12 小時黑暗的環境三天，改置連續藍光中。BFrDBB：在上述 3 天的馴化期 中，分別在進入藍光光照期的第4、6、8、10、12 小時，以 10 分鐘的遠紅光 處理，再改置連續藍光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算 SDS-PAGE 結果的 電泳帶IDV 後所做出的圖。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後 每隔4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗 期，數字25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。
14.4 20.1 97.4
29 45 66.2
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Lane 1：誘導重組 COP23 蛋白在轉殖細菌大量表現。Lane 2：將細胞蛋白萃 取液通過親和性管柱後，收取之濾液。Lanes 3-9：將親和性管柱中與鎳離子 結合的重組COP23 蛋白沖提出來。Lane 10：當沖提濾液收集到足夠量時，利 用濾膜離心管濃縮COP23 重組蛋白，直到重組 COP23 蛋白濃度達到 1 mg/ml 為止。
Fig. 4. 利用親和性管柱純化 COP23 重組蛋白
127
(A)重組COP23 蛋白及聚球藻RF-1 蛋白萃取液分別作為測試的抗原，此為 SDS-PAGE經 0.25﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色的結果。(B)兔子 免疫第三週的血清中抗體之效價測試，Lanes 1-4： 抗原為COP23 重組蛋白，
Lanes 5-8：抗原為聚球藻RF-1 蛋白萃取液。測試的血清有未免疫的兔子血清 (Lanes 1, 5)、稀釋 103倍(Lanes 2, 6)、5×103倍(Lanes 3, 7)及 104倍(Lanes 4, 8) 的免疫後血清。
Fig. 5. COP23 多株抗體的效價測試（惠安生技股份有限公司）
(A) M 50 20 10 5 2 1 0.5 0.2 0.1
127
27 20
14 10 42 52 80
(B) M 50 20 10 5 2 1 0.5 0.2 0.1
127
27 20
14 10 42 52 80
分別將多株抗體稀釋(A) 2×104倍、 (B) 5×104倍後，以西方轉漬法偵測不同濃 度的聚球藻RF-1 蛋白萃取液，結果僅見 1 條條帶者為COP23 多株抗體與抗原 結合的最佳條件。圖上方的數字代表聚球藻RF-1 蛋白萃取液的總濃度，從 0.1 μg到 50 μg。M為蛋白質標準分子量樣本。
Fig. 6. COP23 多株抗體與抗原結合之最佳濃度測試
(A)
Time (hr) 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93
12R/12D
RDRR
12B/12D
BDBB
BFrDBB RFrDRR
(B)
Time (hr) 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93
Fig. 7. 西方轉漬法檢測光質與 COP23 概日韻律變化之建立
(A) 12R/12D 及(B) 12B/12D 所建立的 COP23 蛋白質含量的概日韻律。二條電 泳圖分別為 SDS-PAGE（上）及西方轉漬法（下）之結果。第一次取樣為進 入連續光照中的第25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方 的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字25、29…、93 為進入連續光照之 恆定環境中的取樣時間（小時）。遠紅光的處理（RFrDRR, BFrDRR）是在 3 天的馴化期中，分別在進入光照期的第4、6、8、10、12 小時，以 10 分鐘的 遠紅光處理，再改置連續紅光或藍光中。
(A)
Relative contents of COP23 (%)
0
RFrDRR：在上述 3 天的馴化期中，分別在進入紅光光照期的第 4、6、8、10、
12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，再改置連續紅光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算西方轉漬法結果的電泳帶 IDV 後所做出的圖。第一次取樣為進入連 續光照中的第25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白 黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字25、29…、93 為進入連續光照之恆定 環境中的取樣時間（小時）。
T im e (h r)
Relative contents of COP23 (%)
0
BFrDBB：在上述 3 天的馴化期中，分別在進入藍光光照期的第 4、6、8、10、
12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，再改置連續藍光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算 SDS-PAGE 結果的電泳帶 IDV (Integrated density value 後所做出的 圖。第一次取樣為進入連續光照中的第25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，
共計18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字 25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。
（A）高光照（30 μmol photons m-2s-1）
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖效率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
（B）低光照（5 μmol photons m-2s-1)
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖效率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
（C）黑暗
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fig. 10. 自然轉型法的實驗結果
聚球藻RF-1 細胞與不同濃度的DNA混合後，分別培養在（A）高光照（30 μmol photons m-2s-1）、（B）低光照（5 μmol photons m-2s-1）和（C）黑暗，
進行自然轉型法的實驗結果。
（A）高光照（30 μmol photons m-2s-1）
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
（B）低光照（5 μmol photons m-2s-1）
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
（C）黑暗
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fig. 11. 電穿孔法的實驗結果（一）
在（A）高光照（30 μmol photons m-2s-1）、（B）低光照（5 μmol photons m-2s-1） 和（C）黑暗，聚球藻RF-1 細胞與不同濃度的DNA混合後，利用電穿孔法 進行基因轉殖的實驗結果。
（A）BG110培養基或培養液
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
（B）BG11 固體培養基或培養液
DNA 濃度
(μg/ml) 0.2 0.5 1 1.5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌落數 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 轉殖率(％) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fig. 12.電穿孔法實驗結果（二）.
在進行電穿孔法轉殖過程中，分別使用（A）BG110固體培養基或培養液，
或（B）BG11 培養基或培養液的實驗結果。