2.1 COP23 重組蛋白之製備
COP23 重組蛋白在轉殖菌株被大量誘導後，將細胞打破以獲得
細胞的蛋白質，接著利用親和性管柱純化 His 標定（His-tag）的 COP23 重組蛋白，從SDS-PAGE 的結果（Fig. 4）確認純化的蛋白質。
Fig. 4 中Lane 1 的樣本為轉殖細菌的細胞蛋白質，在約 23 kDa的 位置上有COP23 重組蛋白的條帶，表示轉殖菌株表現COP23 重組蛋
白。將細胞蛋白質萃取液通過親和性管柱後，收取從管柱滴漏下的濾 液，經SDS-PAGE分析（Fig. 4, Lane 2）可看到在約 23 kDa的位置少 了COP23 的條帶，表示具有His標定的COP23 重組蛋白有結合到親和 性管柱裡的鎳離子（Ni+）上。接著利用沖提緩衝液（elution buffer）
沖提親和性管柱，並收取從管柱滴漏下的濾液，將每ml按照順序分別 裝在微量離心管中，以SDS-PAGE分析（Fig. 4, Lane 3-9），發現，從 濾液的第2 ml開始（Fig. 4, Lane 4），在約 23 kDa位置的COP23 重組 蛋白開始出現，一直持續到第 7 ml （Fig. 4, Lane 9）仍可看到CO P23 重組蛋白被沖提出來。為了快速收取COP23 重組蛋白，之後的實驗 直接收取第2 ml到第 5 ml的沖提濾液，當沖提濾液收集到足夠量時，
利用濾膜離心管（10 μm, Millipore）濃縮COP23 重組蛋白，直到COP23
重組蛋白濃度達到1 mg/ ml為止。
2.2 COP23 多株抗體之效價測試
COP23 多株抗體之效價委託惠安生物化學股份有限公司測試，
將兔子免疫後第三週的血清作 COP23 多株抗體之效價測試，結果如 Fig. 5。測試使用的抗原有 COP23 重組蛋白及聚球藻 RF-1 膜蛋白萃 取液二種，前者的濃度為 1 μg，後者為 40 μg（Fig. 5A）。接著以兔子 血清偵測 COP23 的表現（Fig. 5B），從西方轉漬法的結果顯示，以 COP23 重組蛋白（Fig. 5B, Lanes 1-4）或聚球藻 RF-1 蛋白萃取液中
的COP23 蛋白質（Fig. 5B, Lanes 5-8）作為抗原，兔子血清中的 COP23 多株抗體皆能專一性的偵測到。
確定COP23 多株抗體的專一性後，接著觀察抗體量是否達到需 要的標準。在做效價測試過程，先將兔子的血清稀釋不同的倍率，分 別是103倍、5×103倍及 104倍，以測試兔子血清中COP23 多株抗體對 COP23 抗原的敏感度。Fig. 5B顯示，以COP23 重組蛋白（Lanes 1-4）
作為抗原時，兔子血清稀釋 5×103倍所偵測的條帶較稀釋 103倍來得 清晰（Lanes 2 and 3），這是人為誤差所致。若以聚球藻RF-1 蛋白萃 取液中的COP23 蛋白質作為抗原（Lanes 5-8），當兔子血清稀釋103倍
（Lanes 2 and 6）和 5×103倍（Lanes 3 and 7）時，抗原明顯可偵測。
但是當兔子血清稀釋到104倍（Lanes 4 and 8）時，條帶則不明顯，這 表示兔子血清中COP23 多株抗體的量尚不足，未達到所需要的標準。
之後惠安生物化學股份有限公司對兔子進行再次免疫，讓其產生更多 COP23 多株抗體，直到最後收取的兔子血清中，COP23 多株抗體在 稀釋5×104倍時仍可靈敏地偵測到COP23 抗原。
2.3 多株抗體與抗原結合最佳濃度之測試
因為兔子血清中所含的抗體屬於抗COP23 的多株抗體，為了使
抗原與抗體的專一性結合達到最佳化，即西方轉漬法分析只在約 23 kDa處偵測到一條條帶，結果如Fig. 6 所示。實驗中以不同濃度的聚 球藻RF-1 膜蛋白萃取液（0.1-50 μg）當作抗原，當多株抗體的濃度
稀釋2×104倍時，抗體的靈敏度可偵測到 2 μg總蛋白量，2 μg以下則 看不到條帶（Fig. 6A）；若多株抗體的濃度稀釋到 5×104倍，靈敏度 則到5 μg總蛋白量，在 5 μg以下則看不到條帶（Fig. 6B）。
從Fig. 6 的結果發現，當總蛋白量過多時，會出現一些非專一性 的條帶，但是當總蛋白量減少到5 μg時，只會出現一條條帶，即COP23 的位置，因此進行西方轉漬法時，選擇每個樣本加入5 μg總蛋白量，
而多株抗體濃度則選擇稀釋5×104倍，亦可減少抗體的使用量。