聚球藻RF-1韻律蛋白COP23特性之研究

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(1)壹、緒論 1. 概日韻律之簡介生物時鐘（biological clock）或內生性韻律（endogenous rhythm）是指當生物在某些環境因子的規律變化設定後，會產生規律性的“內生機制變化＂，以控制生物在行為上、生理上或生物化學上的表現，且該表現在環境維持不變的情況下，仍可以維持一段時間的週期性變化。生物時鐘在生物體內扮演重要的一環，控制生物體對環境的適應情形。生物時鐘廣泛地存在於真核生物中，從動物的作息時間、豆科植物的睡眠運動到低等黏菌每日的孢子產生週期等，都受其控制（Brown and Schibler, 1999; Devlin, 2002）。但原核生物的生物時鐘一直被懷疑是否存在，直到 1986 年 Grobbelaar 等人發現藍綠藻中的聚球藻 RF-1（Synechococcus RF-1）的固氮酵素活動具有內生性週期韻律之現象，從此開啟原核生物之生物時鐘的研究領域。由於原核生物的細胞構造、基因表現及訊息傳導（signal transduction）都比真核生物單純，立即成為探討生物時鐘之起源及其調控機制的最好材料（Iwasaki and Kondo, 2000）。隨著生物種類的不同，生物時鐘的週期也會不同，但大多數生物. -1-.

(2) 時鐘的週期與日夜變化一致，該韻律週期約為 24 小時，故稱為概日韻律（circadian rhythm）。它主要有 4 個特點︰（1）概日韻律的表現需要某種環境因子（光暗週期或溫差變化）加以設定；（2）當概日韻律被設定後，在恆定環境中仍可維持一段時間；（3）概日韻律具有溫度補償性（temperature-compensated），即生物在生理溫度範圍內，概日韻律有一致的表現，不受溫度的影響；（4）概日韻律可以被重新設定（Bell-Pedersen et al., 2005）。一般生物時鐘的系統可以分三個部分：（1）時鐘設定的訊號輸入路徑（input pathway）；（2）韻律調控中心（circadian oscillator），負責整合訊號；（3）訊號輸出路徑（output pathway），使生物短暫調節特殊生理或生化反應來適應環境變化（Lin et al., 2003）。至目前為止，對於韻律調控中心的研究較完整，由於參與韻律調控中心的基因一直陸續被找到，像是果蠅（Drosophila melanogaster）有 per、tim、clk 基因（Page, 1994）；老鼠或人有 per1、per2、per3、tim、clk 基因（Karen and Steve, 2000）；阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）有 toc1、lhy、cca1 （Kevei and Nagy, 2003）；藍綠藻（Synechococcus PCC 7942）有 kai A、 kai B、kai C 基因（Ishiura et al., 1998）等。無論在哪種生物體內，韻律調控中心大多由數種時鐘基因（clock genes）組成，形成一個負向回饋圈（negative feedback loop），藉由輸出的路徑來調控下游基因的 -2-.

(3) 表現（Bell-Pedersen et al., 2005）。環境因子的訊號傳送到調控中心的相關研究較少，已知阿拉伯芥中光敏素（ phytochrome ）和隱花素（ cryptochrome ）等光接收器（ photoreceptors ）都被證實在生物時鐘的設定上佔有重要功能（Fankhauser and Staiger, 2002）。光敏素包括 PHY A、B、D、E，而隱花素包括 CRY1 與 CRY2，其中 PHY B、D 和 E 能將紅光的訊號輸入至韻律調控中心，而 PHY A、CRY 1 和 CRY 2 則負責輸入藍光的訊號到韻律調控中心。此外，PHY A 尚能偵測到紅外線的訊號（Devlin, 2002）。 2. 聚球藻 RF-1 之形態、構造及生理特性聚球藻 RF-1 是 1986 年自台灣南部水稻田分離得到（Huang & Chow, 1986 ），樣本保存於 Pasteur Institute of Culture Collection Center，編號為 PCC 8801。它是一種單細胞藍綠藻，分類上屬於藍綠菌綱（ Cyanophyta ）、色球藻目（ Chroococcales ）、色球藻科（Chroococcaceae）、聚球藻屬（Synechococcus），細胞成橢圓形，長軸約為 4 μm，短軸約為 3 μm。具有葉綠素 a（chlorophyll a）、β-胡蘿蔔素（β-carotene）、藻藍素（phycocyanin）、藻紅素（phycoerythrin）、以及異藻藍素（allophycocyanin），顏色呈墨綠色。在電子顯微鏡下可. -3-.

(4) 觀察到外膜（outer membrane）、肽聚醣（peptidoglycan）、以及細胞膜，但細胞外不具鞘（sheath）（周, 1987）。聚球藻RF-1 對於環境中汞離子、銅離子、銀離子及鉛離子有高度敏感性，可用來作為重金屬離子污染調查的生物指標（周, 1987）。聚球藻RF-1 屬於光合自營性原核生物，細胞以二分法進行繁殖。當細胞培養在含硝酸鹽之BG-11（Stanier et al., 1971）培養液、光照強度 35 μmol photons m-2 s-1時，一個世代（generation rate）約為三天，生長溫度約在 20 ℃-42 ℃（周, 1987; Huang and Chow, 1986; Huang and Chou, 1991）。若培養在不含硝酸鹽的BG110培養液，生長較緩慢，適合的生長溫度為 20 ℃- 37 ℃。即使培養在連續黑暗中仍然可存活二週以上，但是停止分裂，當回復到光照條件時，則可快速恢復正常的生長（Huang and Pen, 1994）。有些絲狀藍綠藻具有可進行光合作用的營養細胞，同時具有特殊的異形細胞（heterocysts），負責固氮作用，以避免固氮酵素受到氧的破壞（Bold and Wynne, 1985）。雖然聚球藻RF-1 是單細胞藍綠藻，但兼具光合作用及固氮作用的能力（Huang and Chow, 1986）。它具有固氮酵素，培養在不含硝酸鈉的BG110培養液時仍可以繼續存活（Huang et al., 1994）；若改培養在含硝酸鈉的BG11 培養液時，生長速率比較快，但測不到固氮酵素活性（Huang and Chou, 1991）。當聚球藻RF-1 -4-.

(5) 培養於連續光照下，可以持續進行固氮作用，但固氮效率差，且不穩定；若改培養於光/暗週期的條件下，則光合作用只在光週期進行，固氮作用只在暗週期進行，且固氮效率提高（ Huang and Chou, 1986）。此外，在進入黑暗期固氮作用前，細胞的呼吸作用有增強的現象，推論可能是供應固氮作用所需要的能量，以及迅速降低細胞內氧的濃度，以保護固氮酵素（Grobbelaar et al., 1987）。當聚球藻 RF-1 從 12 小時光照/12 小時黑暗的培養環境改為連續光照，其固氮作用仍只出現在暗週期，且可維持數個週期（Grobbelaar et al., 1986; Huang et al., 1990），顯示固氮作用有概日韻律的特性，這也是原核生物被發現受生理時鐘所調控的首例。自此之後，聚球藻 RF-1 的韻律特性陸續有報導產生：（1）固氮作用韻律包括固氮酵素活性及其基因表現都有概日韻律的現象（Huang et al., 1988; Huang and Chow, 1990）；（2）胺基酸的吸收韻律，其中以白胺酸（leucine）最明顯（Chen et al., 1991）；（3）光合作用釋氧速率的概日韻律（林, 2002; Yen et al., 2004）；（4）ATP 含量變化（Huang and Chen, 2003）；（5）細胞膜上一 180 kDa 蛋白酶活性（Lin et al., 2003）。此外，十餘種細胞膜蛋白質的合成亦具有韻律變化（Huang et al., 1994），其中針對分子量為 23 kDa 的蛋白質做更進一步的研究，因為它是一種概日韻律蛋白（circadian oscillating protein），故名 COP23。 -5-.

(6) 3. 聚球藻 RF-1 韻律蛋白 COP23 的特性聚球藻RF-1 以光暗或溫度設定後，蛋白質以SDS聚丙烯醯胺電泳膠（SDS-PAGE）分析，可清楚看出十餘種蛋白質具有韻律現象，其中包括COP23。當進一步分析COP23 在聚球藻RF-1 細胞內的分佈時，設定韻律之聚球藻RF-1 以35S-Methionine標誌而區分為懸浮層及碎片層，以電泳圖譜可看出，COP23 存在於細胞碎片層，並利用 SDS-PAGE及電子顯微鏡分析，得知COP23 位於細胞膜上。另外，從蔗糖梯度離心法也獲得相同的證據（陳, 1996）。細胞膜對於原核生物而言，佔有重要生理地位，例如離子輸送（ion transport）、訊息接受（signal reception）及 ATP 合成（ATP synthesis）等，都在細胞膜上進行。在生物時鐘之研究，尤其在生化機制上，很少探討關於細胞膜是否直接影響到生物時鐘的建立或其他相關基因的表現，卻有許多關於細胞膜在韻律建立過程中扮演重要角色之假說（Njus et al., 1974; Schweiger and Schweiger, 1977）。以聚球藻 RF-1 之固氮作用而言，細胞膜對氧氣的傳送具有調控作用（Huang et al., 1988），此外白胺酸的吸收亦需要藉由細胞膜的作用才發生（Chen et al., 1991），因此細胞膜上應有特殊蛋白質，能配合生物時鐘來調控其他蛋白質的表現。COP23 位於細胞膜上，是否和生物時鐘相關，則有待進一步確認。 -6-.

(7) COP23 含量的概日韻律類型和固氮作用的韻律相似（Huang et al., 1990），同樣在光/暗週期設定後，暗週期時表現達到高峰，光週期時表現量較少。該蛋白除了含量具有韻律變化外，其 mRNA 的表現量、蛋白質的合成以及分解作用上，也都具有概日韻律的現象（Chen et al., 1996）。目前已知其合成的韻律主要控制在轉錄的層次（Chen et al., 1996），但對於分解韻律則不清楚，僅知光照、鈣離子及新合成的蛋白對分解的調控是必須的（蔡, 2001）。有關 COP23 概日韻律的研究顯示，除了光暗的週期變化可建立概日韻律外，在生理範圍內 5 -10 ℃的溫度變化週期亦可建立概日韻律；而當二者設定條件並存時，以光暗週期的設定比較佔優勢（Lin et al., 1999），可知光量的改變對於韻律的建立是非常重要的。至於光質的種類對於韻律的建立是否也有關鍵性的影響？林（2002）的研究顯示，當紅光取代白光的光暗變化仍可建立光合作用釋氧速率的概日韻律，但藍光則否，由此可知光合作用韻律的建立與光質有關。若對於 COP23 因應環境的變化有多一些瞭解，將有助於解開其概日韻律建立之謎。 COP23 之生理功能尚不明確，依據胺基酸序列分析，位於成熟蛋白的第 38 及 103 胺基酸位置為半胱胺酸，可形成雙硫鍵，即 COP23 分子內含有一個雙硫鍵，且其氧化態與還原態在結構上有顯著的差異 -7-.

(8) （陳, 1996）。COP23 的基因序列已被定出（Chen et al.,1996），當進行基因資料庫（Genbank）比對時，沒有發現與其相似的基因，推測 COP23 在聚球藻 RF-1 細胞具有獨特之角色。此外，聚球藻 RF-1 的基因轉殖系統尚未建立，目前只有報告利用 NTG （N-methyl-N’-nitro-N- nitrosoguanidine）誘導細胞突變，以篩選出聚球藻 RF-1 的概日韻律突變株（Huang et al., 1993）。此方法只能被動的篩選突變株，在研究特定的基因或蛋白質功能時不適用，若是能建立基因轉殖系統，使 cop23 基因大量表現或表現量降低，再藉由觀察聚球藻 RF-1 生理現象的改變，對於推測 cop23 基因的功能有相當大的幫助。本論文以 COP23 為研究對象，分為二個部分作探討：（一）研究在不同光質條件下，對 COP23 蛋白質含量概日韻律的設定有何影響。（二）藉由建立聚球藻 RF-1 基因轉殖的技術，以探討當聚球藻 RF-1 之 cop23 基因突變時生理現象的改變，期盼這些結果對於了解聚球藻 RF-1 的概日韻律表現或生物時鐘的運轉機制有所助益。. -8-.

(9) 貳、材料與方法 1. 藻株的培養本論文使用的材料聚球藻RF-1（Synechococcus PCC8801）分離自台灣南部水稻田（Huang and Chow, 1986）。聚球藻RF-1 以不含硝酸鹽之BG110培養液（Stanier et al., 1971）（配方詳見附錄一）無菌培養，培養條件為 28 ℃、12 小時光照（光照強度 30 μmol photons m-2 s-1） /12 小時黑暗。 2. 不同光質馴化 COP23 的概日韻律將聚球藻 RF-1 培養在連續光照 7 天，作為不同光質馴化的實驗前處理，以減少藻類原有的概日韻律。接著將聚球藻 RF-1 分別培養在 12 小時藍光/12 小時黑暗（12B/12D）或 12 小時紅光/12 小時黑暗（12R/12D）的環境中馴化 3 天後，改置於連續藍光或連續紅光中，在進入連續光照環境後的第 25 小時開始，每 4 小時收取一次樣本，共計 18 次，以分析 COP23 的含量變化。遠紅光的處理：在上述 3 天的馴化期中，分別在進入光照期或黑暗期的第 4、6、8、10、12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，以打斷光照期或黑暗期，其餘步驟同上，抽取次數共計 18 次。上述所用的紅光（主要波長為 614 nm）、藍光（主要波長為 436 -9-.

(10) nm）及遠紅光（主要波長為 720 nm）之強度都是 6 μmol photons m-2 s-1。 3. 膜蛋白質的萃取及定量 3.1 細胞的收集將 30 ml 聚球藻 RF-1 藻液裝入離心管中，以震盪器（Vortex Genie-2）最高轉速震盪 1 分鐘後，以 5,867 g、4 ℃離心 4 分鐘。倒去上清液後，再加入 10 ml 二次水震盪 1 分鐘，使細胞懸浮並洗去附於細胞上的膠體，接著離心、去除上清液。如此重複 2 次以收集細胞。 3.2 膜蛋白的抽取將上述收集的聚球藻 RF-1 細胞懸浮於 1 ml 二次水中，移至 1.5 ml 之離心管，離心 1 分鐘（4 ℃, 15,493 g），去除上清液。加入 200 μl 蛋白質萃取緩衝液（protein extraction buffer）（62.5 mM Tris, pH 6.8； 2％ (w/v) SDS；10％ glycerol）懸浮沈澱之細胞，以沸水處理 10 分鐘、冰浴 5 分鐘後，離心 2 分鐘（4 ℃, 15,493 g），收集上清液。萃取的蛋白質樣本經定量後，直接進行 SDS-PAGE 分析，或保存於-20 ℃ 備用（陳, 1996）。 3.3 膜蛋白的定量利用 Lowry 反應分析蛋白質樣本。以小牛血清蛋白（bovine serum. - 10 -.

(11) albumin, BSA, 1 mg/ml）溶液為標準品，將其稀釋為 0.2、0.4、0.6、 0.8 mg/ml 備用。取 7 支微量離心管，按下列各項次序添加（體積為 μl）： BSA 濃度 (mg/ml). 0 (blank). 0.2. 0.4. 0.6. 0.8. 1. 膜蛋白樣本. 溶液 D. 1000. 1000. 1000. 1000. 1000. 1000. 1000. 蛋白質. 100. 100. 100. 100. 100. 100. 100. 溶液D包含 49 ml 2％ Na2CO3（in 0.1 M NaOH）、0.5 ml 1％ CuSO4、 0.5 ml 2％ sodium tartrate。混合均勻後，在室溫下靜置 10 分鐘，再分別加入 100 ml Folin-Ciocalteu phenol試劑（Sigma），混合均勻，在室溫下靜置 30 分鐘後，測定各樣品的OD660值。各BSA溶液的OD660值需減去對照組（blank）的OD660值，再以BSA 已知濃度對OD660做圖，畫出一正相關曲線，利用此標準曲線算出未知濃度的膜蛋白樣本。 4. SDS-PAGE 4.1 SDS-PAGE 蛋白質樣本從-20 ℃回溫後，經 100 ℃加熱 5 分鐘，冰浴 5 分鐘，再離心 2 分鐘（4 ℃, 15,493 g），取上清液，進行 14％ SDS-PAGE（配方詳見附錄二）電泳分析，所使用電泳裝置為Bio-Rad Mini-PRTEAN 3 Cell。電泳在室溫下進行，每一個樣品槽（well）加入 10 μg的蛋白 - 11 -.

(12) 質萃取液（西方轉漬法時加入 5 μg的蛋白質萃取液即可），以 90 伏特進行 100 分鐘分離蛋白質樣本。電泳完成後，將膠片置於 0.25％ (w/v) Coomassie brilliant blue R 250 中染色 30 分鐘，之後改置於褪染液（10 ％ (v/v) glacial acetic acid, 45％(v/v) methanol, 45％ (v/v) H2O）中褪染至色帶清晰可見為止。 4.2 計算電泳帶中蛋白質之相對含量利用 AlphaImager 1220 計算電泳帶 IDV （Integrated density value）後，以電泳膠片上沒有蛋白質條帶的背景當 0％，計算出各電泳帶之間相對含量。 5. COP23 多株抗體之製備 5.1 COP23 重組蛋白之製備由林榮芳博士提供含cop23 基因之質體（pQE60-cop23，質體圖譜詳見附錄三）的轉殖菌株。取 5 μl儲存之菌液，加入 5 ml LB培養基（含 100 μg/ml ampicillin及 50 μg/ml kanamycin），以 37 ℃隔夜震盪培養。取 1 ml隔夜培養之菌液，加入 100 ml新鮮LB培養基中，在 37 ℃下震盪培養至OD600為 0.6 時，以 100 μM IPTG誘導蛋白質表現，時間約為 4 小時。離心 15 分鐘（4 ℃, 5000 g）收集菌體，並以PBS buffer 清洗一次後，加入 10 ml lysis buffer（50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, - 12 -.

(13) 10 mM imidazole, pH 8.0）懸浮菌體，並於 100 ℃加熱 10 分鐘，冰浴 5 分鐘後，抽取蛋白質。取少量蛋白質以 14％ SDS-PAGE分析蛋白質，確定無誤後，再以親和性管柱（Ni-NTA Agarose Column, QIAGEN）純化目標蛋白質（target protein）。純化之COP23 蛋白質經定量後，委託惠安生物化學股份有限公司製作抗體。 5.2 多株抗體之製備及效價測試惠安生物化學股份有限公司經由墨點法（dot blotting）進行兔子篩選，確定兔子體內無 COP23 之抗體。再將 COP23 重組蛋白注射到兔子腹腔，引發免疫反應，並於每週抽血，檢測血清中 COP23 抗體的效價。效價檢測方法為西方轉漬法，詳細步驟見 5，所用蛋白質樣本為 COP23 重組蛋白及聚球藻RF-1 膜蛋白萃取液，分別在SDS-PAGE的樣品槽內注入 1 μg和 50 μg的樣本溶液。將每週獲得的兔子血清分別稀釋 103、5×103、104、2×104、5×104倍，用以偵測COP23，西方轉漬法的結果必須達到兔子血清對COP23 有專一性，且血清經稀釋 5×104 倍後仍能偵測COP23，未達此標準時，可再次將COP23 注入兔子體內引發二次免疫反應。. - 13 -.

(14) 5.3 COP23 多株抗體與抗原結合最佳濃度之測試利用西方轉漬法確定抗原與抗體結合之濃度，結果僅見 1 條條帶（band）為最佳條件。測試之蛋白質樣本為聚球藻RF-1 膜蛋白萃取液，分別在SDS-PAGE的樣品槽內注入 50 μg、20 μg、10 μg、5 μg、2 μg、1 μg、0.5 μg、0.2 μg、0.1 μg的樣本溶液。多株抗體測試濃度則分別為稀釋 2×104和 5×104倍以偵測COP23。 6. 西方轉漬法（western blotting） 6.1 蛋白質的解析及轉漬將 4.1 步驟中 SDS-PAGE 的電泳膠片，以三明治方式夾於 PVDF （polyvinylidene difluoride）轉印膜及濾紙間，利用轉漬緩衝液（25 mM Tris, 192 mM glycine, 20％ Methanol），以 250 mA、40 V 通電轉漬（此時電泳膠片方向在負極，PVDF 膜在正極），通電時間在 30 分鐘至 1 小時間，完成後以 TBS （10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5）稍做浸潤，轉放入含 5％脫脂奶粉的 TBS 中，於 37 ℃作用 1 小時，以便充分將膜上無蛋白質沾附的部分完全佔滿。 6.2 COP23 的偵測將抗體（Rabbit anti-COP23 多株抗體）以含 1 ％脫脂奶粉之TBS 溶液稀釋 5×104倍，加入含PVDF膜的容器，置於室溫下輕搖 1 小時。 - 14 -.

(15) 將膜取出，以含 0.0 ％ Tween-20 的TBS清洗 3 次，每次各 10 分鐘。將PVDF膜置於含二級抗體（goat anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase）的TBS溶液中，室溫下作用 1 小時後，以上述方法再洗滌 3 次。然後用alkaline phosphatase （AP）受質溶液（100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2）處理 10 分鐘後，加入 2 ml呈色溶液（10μl nitroblue tetrazolium - 5μl X-phosphate in AP受質溶液），使之呈色。最後將PVDF膜取出以二次水清洗一次，以濾紙吸乾膜上的水分，再利用熱感應照相系統照相存檔。 7. 聚球藻 RF-1 之 DNA 製備參考Chen et al.（1996）的DNA製備法。聚球藻RF-1 之細胞表面含有中和lysozyme之藻膠，故DNA的抽取方法有別於其他藍綠藻。將離心收集的聚球藻RF-1 以二次水震盪 1 分鐘後，離心（4 ℃，5,867 g， 5 分鐘），去除上清液，上述步驟重複二次，以充分洗去藻膠。再利用 6 M guanidine-HCl作用 5 分鐘，使細胞穿孔，離心（4 ℃，15,493 g， 1 分鐘）後可見上清液呈藍紫色。沉澱之細胞以二次水清洗，除去 guanidine-HCl後，加入TE buffer（pH 8.0）、lysozyme（最後濃度 10 mg/ml）及RNase A（最後濃度 10 μg/ml），在 37℃下處理 1 小時後，離心（4℃，15,493 g，1 分鐘）去除上清液，再加入proteinase K（最後濃度 100 mg/ml）和 2％ SDS（此時總體積 500 μl），於 60 ℃下處 - 15 -.

(16) 理 2 小時。之後依序以phenol/chloroform（4：1）和phenol/chloroform （1：1）萃取，離心（4℃，15,493 g，1 分鐘）後取上層液，最後以 chloroform萃取一次，上層液加入 5 M NaCl（最終濃度 0.2 M）及兩倍體積之 99.5％酒精，混合後可見白色絲狀的DNA沉澱，離心（4℃， 15,493 g，3 分鐘）除去上清液。DNA沉澱以 1 ml 75％酒精洗去鹽類，待DNA沉澱陰乾後，加入 100 μl二次水溶解。測量DNA溶液之OD260和 OD280吸光值，計算DNA之濃度（流程圖見附錄四）。此外，DNA溶液之OD260/OD280比值應介於 1.8－2 之間，此外若低於 1.8，表示抽取的DNA純度不夠，須以phenol/chloroform處理再次純化。. 8.聚球藻 RF-1 之基因轉殖 8.1 E. coli DH5α 勝任細胞（competent cells）之製備及保存將冷凍保存的E. coli DH5α取出並塗抹在LB細菌培養皿上，隔天挑取單一菌落，培養在 2 ml LB培養液中，在 37 ℃下隔夜振盪培養。準備 5 ml LB培養液，加入 1 ml 隔夜培養的菌液，放在 37 ℃下振盪培養 2 小時，並測得OD600值在 0.5-0.7 之間。將菌液置於冰上 10 分鐘後，離心（4℃， 5,867 g，10 分鐘）除去上清液，以 2 ml CCMB 溶液（10 mM Potassium acetate，pH 7，80 mM CaCl2，20 mM MnCl2， - 16 -.

(17) 10 mM MgCl2，10％ Glycerol）懸浮細胞沈澱物，置於冰上 20 分鐘，離心（4，5,867 g，10 分鐘）除去上清液，以 0.5 ml CCMB溶液懸浮沈澱之細胞，並分裝至微量離心管中備用，或是保存於液態氮中。 8.2 質體 pRL271 的製備及保存由林榮芳博士提供轉殖質體（pRL271，質體圖譜詳見附錄五）。取二組勝任細胞置於冰浴，一組不做任何轉型（transformation），直接塗抹在含 25 mg/ml chloramphenicol 之固態 LB 培養基上；另一組勝任細胞加入 10 pg 的質體，混合後冰浴 20 分鐘，接著將混合液放置在 42 ℃ 90 秒，再迅速放回冰浴中。在混合液中加入 400 μl LB 培養液，置於 37 ℃振盪培養 1 小時後，取 90 μl LB 培養液到新的微量離心管，並加入 10 μl 轉型之細胞（10 倍稀釋），混合均勻後塗抹在含 25 mg/ml chloramphenicol 之 LB 固體培養基上，於 37 ℃培養 12-16 小時。取出細菌培養皿，挑出轉型成功之菌落，放入 5 ml LB 培養液中，於 37 ℃振盪培養，以保存及抽取質體備用。抽取質體 pRL271 的過程參照 QIAprep Spin Miniprep Kit （QIAGEN）的操作手冊（見附錄六），抽取完畢後，測量DNA溶液之OD260和OD280吸光值，並計算DNA之濃度。 8.3 自然轉型法（nature transformation）. - 17 -.

(18) 根據Onai et al.（2004）之方法修正。收集聚球藻RF-1 的細胞後，以二次水清洗細胞二次，去除藻膠，離心 10 分鐘（4 ℃，6,000 g）後，去除上清液，以BG11 液態培養基（1/10 原來體積）懸浮沈澱的細胞，此時細胞數約 2.5×1010 cells/ml。取 200 μl細胞及不同濃度DNA （分別是 0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/ml）混合後，放入 28 ℃ 中培養過夜。然後將其塗抹在含 25 μg/ml Chloramphenicol的BG-110固體培養基上，觀察菌落生成的情形。計算轉殖成功的細胞數或菌落數，可得到自然轉型法的轉殖效率。 8.4 電穿孔法（electroporation）根據Billi et al.（2001）及Onai et al.（2004）之方法修正。收集細胞的方法如 7.2，最後將細胞懸浮於二次水中，細胞濃度約 109 cells/ml。處理後將細胞放於冰上預冷，同時將electroporate cuvette （2-mm gap）置於冰上預冷 5 分鐘。取 40 μl細胞及不同濃度DNA（分別是 0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/ml）混合後，加入cuvette中，利用Gene Pulser（Bio-Rad）給予單一電擊（電壓 10 kV/cm、電容 25 μF、電阻 200 Ω），隨即加入 2 ml BG-110液態培養液，將cuvette中的細胞洗出，置於乾淨的試管中，置於 28℃培養過夜。將菌液塗抹在含 25 μg/ml chloramphenicol的BG-110固體培養基上，計算轉殖成功的細胞數或菌落數。 - 18 -.

(19) - 19 -.

(20) 參、結果 1.不同光質的設定對 COP23 含量概日韻律的影響 1.1 白光黑暗建立的 COP23 概日韻律當聚球藻 RF-1 以 12 小時白光、12 小時黑暗（12L/12D）處理後，隨著時間的改變， COP23 蛋白質的表現有韻律性的變化（Fig. 1），光照期的 COP23 含量較少，而黑暗期的 COP23 則較多，韻律的週期大約是 24 小時。若將聚球藻 RF-1 以 12L/12D 馴化三天後，改置入連續白光（free running time, LDLL）中，COP23 的含量仍維持大約 26 小時的規律性週期變化（Fig. 1），在原設定光照期的 COP23 蛋白質量較少，大約在原設定光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 5 小時（即進入連續光照第 41 小時），COP23 大量增加，維持這樣的含量到下一個原設定光照期的第 5 小時（即進入連續光照第 53 小時），COP23 的蛋白質含量又開始顯著減少。此證明 12L/12D 的週期可以建立 COP23 含量的概日韻律，且在連續的白光環境中維持數個週期。. - 20 -.

(21) 1.2 紅光黑暗建立的 COP23 概日韻律當聚球藻 RF-1 培養在 12 小時紅光、12 小時黑暗（12R/12D）的條件下，COP23 蛋白質的含量隨著時間的變化而有週期性的改變（Fig. 2），COP23 在紅光光照期第 5 小時開始減少，而在黑暗期的第 9 小時開始增加，COP23 高峰期出現在黑暗末期，週期大約是 24 小時。若將聚球藻 RF-1 以 12R/12D 的條件馴化三天後，改置入連續紅光（RDRR），其 COP23 的含量仍維持週期大約 24 小時的規律性變化，在原設定光照期的 COP23 蛋白質量較少，大約在原設定紅光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 1 小時（即進入連續光照第 37 小時）時，COP23 大量增加，維持這樣的含量到下一個原設定紅光光照期的第 5 小時（即進入連續光照第 53 小時），COP23 的蛋白質含量又開始顯著減少，這樣的週期性變化可以維持至少 3 個循環（Fig. 2）。此證明 12R/12D 的週期可以建立 COP23 蛋白質含量的概日韻律，且在連續的紅光環境中可以維持數個週期。當聚球藻 RF-1 在 12R/12D 馴化過程中，以 10 分鐘遠紅光處理紅光光照期中的第 4、6、8、10、12 小時，打斷紅光光照期的連續性，如此處理 3 天後，將聚球藻 RF-1 改置入連續紅光下（RFrDRR），結. - 21 -.

(22) 果顯示，COP23 蛋白質的表現仍然保持週期性的變化（Fig. 2），韻律的週期大約是 24 小時，大約在原設定紅光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 9 小時（即進入連續光照第 45 小時）時，COP23 蛋白質量大量增加，維持這樣的含量到下一個原設定紅光光照期的第 5 小時（即進入連續光照第 53 小時），COP23 的蛋白質含量又開始顯著減少，這樣的週期性變化可以維持至少 3 個循環。如此證明在 12R/12D 馴化過程中，加入遠紅光的處理，不會影響 COP23 蛋白質概日韻律的建立，僅影響概日韻律相位的表現。 1.3 藍光黑暗建立的 COP23 概日韻律由 Fig. 3 的結果可知，當聚球藻 RF-1 培養在 12 小時藍光、12 小時黑暗（12B/12D）的條件下，COP23 蛋白質量亦有週期性的表現，在藍光光照期時蛋白質量較少，而在黑暗期時蛋白質量較多。COP23 蛋白質量大約從藍光光照期第 5 小時開始減少，直到進入黑暗期時才增加，如此的韻律週期大約是 24 小時。若將聚球藻 RF-1 以 12B/12D 的條件馴化三天後，改置入連續藍光（BDBB）中，COP23 的表現仍維持週期大約 24 小時的規律性變化（Fig. 3），在原設定光照期 COP23 蛋白質量較少，大約在原設定. - 22 -.

(23) 藍光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 5 小時（即進入連續光照第 41 小時）時，COP23 大量增加，維持這樣的含量到下一個原設定藍光光照期的第 5 小時（即進入連續光照第 53 小時），COP23 又開始顯著減少，這樣的週期性變化可維持至少 3 個循環。此證明 12B/12D 可以建立 COP23 蛋白質表現的概日韻律，且在連續的藍光環境中仍維持數個週期。當聚球藻 RF-1 在 12B/12D 的馴化過程中，在藍光光照期中的第 4、6、8、10、12 小時加入遠紅光的處理，打斷藍光光照期的連續性，如此處理 3 天後，改置入連續藍光下（BFrDBB），COP23 的表現仍然保持週期性的變化（Fig. 3），韻律的週期大約是 24 小時，大約在原設定藍光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 5 小時（即進入連續光照第 41 小時）COP23 大量增加，維持這樣的含量到下一個原設定藍光光照期的第 5 小時（即進入連續光照第 53 小時），COP23 的含量又開始顯著減少，這樣的週期性變化可維持至少 3 個循環。證明在 12B/12D 的馴化過程中，加入遠紅光的處理並未影響 COP23 概日韻律的建立，即 COP23 蛋白質仍有週期性的變化，週期約是 24 小時。. - 23 -.

(24) 2. COP23 多株抗體之製備 2.1 COP23 重組蛋白之製備 COP23 重組蛋白在轉殖菌株被大量誘導後，將細胞打破以獲得細胞的蛋白質，接著利用親和性管柱純化 His 標定（His-tag）的 COP23 重組蛋白，從 SDS-PAGE 的結果（Fig. 4）確認純化的蛋白質。 Fig. 4 中Lane 1 的樣本為轉殖細菌的細胞蛋白質，在約 23 kDa的位置上有COP23 重組蛋白的條帶，表示轉殖菌株表現COP23 重組蛋白。將細胞蛋白質萃取液通過親和性管柱後，收取從管柱滴漏下的濾液，經SDS-PAGE分析（Fig. 4, Lane 2）可看到在約 23 kDa的位置少了COP23 的條帶，表示具有His標定的COP23 重組蛋白有結合到親和性管柱裡的鎳離子（Ni+）上。接著利用沖提緩衝液（elution buffer）沖提親和性管柱，並收取從管柱滴漏下的濾液，將每ml按照順序分別裝在微量離心管中，以SDS-PAGE分析（Fig. 4, Lane 3-9），發現，從濾液的第 2 ml開始（Fig. 4, Lane 4），在約 23 kDa位置的COP23 重組蛋白開始出現，一直持續到第 7 ml （Fig. 4, Lane 9）仍可看到CO P23 重組蛋白被沖提出來。為了快速收取COP23 重組蛋白，之後的實驗直接收取第 2 ml到第 5 ml的沖提濾液，當沖提濾液收集到足夠量時，利用濾膜離心管（10 μm, Millipore）濃縮COP23 重組蛋白，直到COP23. - 24 -.

(25) 重組蛋白濃度達到 1 mg/ ml為止。 2.2 COP23 多株抗體之效價測試 COP23 多株抗體之效價委託惠安生物化學股份有限公司測試，將兔子免疫後第三週的血清作 COP23 多株抗體之效價測試，結果如 Fig. 5。測試使用的抗原有 COP23 重組蛋白及聚球藻 RF-1 膜蛋白萃取液二種，前者的濃度為 1 μg，後者為 40 μg（Fig. 5A）。接著以兔子血清偵測 COP23 的表現（Fig. 5B），從西方轉漬法的結果顯示，以 COP23 重組蛋白（Fig. 5B, Lanes 1-4）或聚球藻 RF-1 蛋白萃取液中的 COP23 蛋白質（Fig. 5B, Lanes 5-8）作為抗原，兔子血清中的 COP23 多株抗體皆能專一性的偵測到。確定COP23 多株抗體的專一性後，接著觀察抗體量是否達到需要的標準。在做效價測試過程，先將兔子的血清稀釋不同的倍率，分別是 103倍、5×103倍及 104倍，以測試兔子血清中COP23 多株抗體對 COP23 抗原的敏感度。Fig. 5B顯示，以COP23 重組蛋白（Lanes 1-4）作為抗原時，兔子血清稀釋 5×103倍所偵測的條帶較稀釋 103倍來得清晰（Lanes 2 and 3），這是人為誤差所致。若以聚球藻RF-1 蛋白萃取液中的COP23 蛋白質作為抗原（Lanes 5-8），當兔子血清稀釋 103倍（Lanes 2 and 6）和 5×103倍（Lanes 3 and 7）時，抗原明顯可偵測。. - 25 -.

(26) 但是當兔子血清稀釋到 104倍（Lanes 4 and 8）時，條帶則不明顯，這表示兔子血清中COP23 多株抗體的量尚不足，未達到所需要的標準。之後惠安生物化學股份有限公司對兔子進行再次免疫，讓其產生更多 COP23 多株抗體，直到最後收取的兔子血清中，COP23 多株抗體在稀釋 5×104倍時仍可靈敏地偵測到COP23 抗原。 2.3 多株抗體與抗原結合最佳濃度之測試因為兔子血清中所含的抗體屬於抗COP23 的多株抗體，為了使抗原與抗體的專一性結合達到最佳化，即西方轉漬法分析只在約 23 kDa處偵測到一條條帶，結果如Fig. 6 所示。實驗中以不同濃度的聚球藻RF-1 膜蛋白萃取液（0.1-50 μg）當作抗原，當多株抗體的濃度稀釋 2×104倍時，抗體的靈敏度可偵測到 2 μg總蛋白量，2 μg以下則看不到條帶（Fig. 6A）；若多株抗體的濃度稀釋到 5×104倍，靈敏度則到 5 μg總蛋白量，在 5 μg以下則看不到條帶（Fig. 6B）。從Fig. 6 的結果發現，當總蛋白量過多時，會出現一些非專一性的條帶，但是當總蛋白量減少到 5 μg時，只會出現一條條帶，即COP23 的位置，因此進行西方轉漬法時，選擇每個樣本加入 5 μg總蛋白量，而多株抗體濃度則選擇稀釋 5×104倍，亦可減少抗體的使用量。. - 26 -.

(27) 3. 西方轉漬法檢測不同光質的設定對 COP23 含量概日韻律的影響利用西方轉漬法檢測不同光質對 COP23 含量概日韻律的影響，結果顯示，無論何種光質的設定下，COP23 皆有概日韻律的表現（Fig. 7），但與 SDS-PAGE 的結果有出入，因 SDS-PAGE 無法看出 COP23 專一性的表現，在接近的分子量處，可能有其他分子量接近的韻律蛋白質存在而干擾結果，而西方轉漬法則可以確定 COP23 專一性的含量概日韻律表現。 3.1 紅光黑暗建立 COP23 概日韻律當聚球藻 RF-1 培養在 12R/12D 的條件下，COP23 蛋白質在紅光光照期量少，黑暗期量多，且有週期性的現象（Fig. 8），與 SDS-PAGE 的結果相符。從紅光光照期第 5 小時 COP23 蛋白質量開始減少，而黑暗期的第 5 小時 COP23 蛋白質量開始增加，韻律的週期大約是 24 小時。若將聚球藻 RF-1 以 12R/12D 馴化三天後，改置入連續紅光（RDRR）中，COP23 蛋白質的表現仍維持週期大約 24 小時的規律性變化，在原設定光照期的 COP23 蛋白質量較少，大約在原設定紅光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 1 小時（即進入連續光照第 37 小時）則大量增加，. - 27 -.

(28) 維持這樣的含量到下一個原設定紅光光照期的第 1 小時（即進入連續光照第 49 小時），COP23 的蛋白質含量又開始顯著減少，這樣的週期性變化可以維持至少 2 個循環。由西方轉漬法證明 12R/12D 的週期可以建立 COP23 蛋白質表現的概日韻律，且在連續的紅光環境中仍可維持數個週期。當聚球藻 RF-1 在 12R/12D 馴化過程中，在紅光光照期中的第 4、 6、8、10、12 小時加入遠紅光的處理，以打斷紅光光照期的連續性，如此處理 3 天後，將其改置入連續紅光下（RFrDRR），COP23 蛋白質的表現量仍然保持週期性的變化（Fig. 8），韻律的週期大約是 24 小時，大約在原設定紅光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 1 小時（即進入連續光照第 37 小時）則大量增加，維持這樣的含量到下一個原設定紅光光照期的第 1 小時（即進入連續光照第 49 小時），COP23 的蛋白質含量又開始顯著減少，這樣的週期性變化可以維持至少 3 個循環。 3.2 藍光黑暗建立的 COP23 概日韻律當聚球藻 RF-1 培養在 12B/12D 的條件下，COP23 蛋白質有韻律性的表現，週期大約是 24 小時。如同 12L/12D 的情形一樣，COP23 在藍光光照期量多，而黑暗期量少（Fig. 9）。. - 28 -.

(29) 若將聚球藻 RF-1 以 12B/12D 馴化三天後，改置入連續藍光（BDBB）中，COP23 蛋白質的表現量仍維持週期大約 24 小時的規律性變化（Fig. 9），在原設定光照期 COP23 蛋白質量較少，大約在原設定藍光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 5 小時（即進入連續光照第 41 小時）則增加，維持這樣的含量到下一個原設定藍光光照期的第 1 小時（即進入連續光照第 49 小時），COP23 的蛋白質含量又開始顯著減少，這樣的週期性變化可以維持至少 3 個循環。當聚球藻 RF-1 在 12B/12D 的馴化過程中，在藍光光照期中的第 4、6、8、10、12 小時加入遠紅光的處理，以打斷藍光光照期的連續性，如此處理 3 天後，將其改置入連續藍光下（BFrDBB）， COP23 的表現仍然保持週期性的變化（Fig. 9），韻律的週期大約是 24 小時，大約在原設定藍光光照期第 5 小時（即進入連續光照第 29 小時）明顯減少，而進入原設定黑暗期第 5 小時（即進入連續光照第 41 小時）則大量增加，維持這樣的含量到下一個原設定藍光光照期的第 1 小時（即進入連續光照第 49 小時），COP23 的蛋白質含量又開始顯著減少，這樣的週期性變化可以維持至少 3 個循環。. - 29 -.

(30) 4.聚球藻 RF-1 之基因轉殖 4.1 自然轉型法實驗進行前，將聚球藻RF-1 藻液將細胞培養在 12L/12D（光照強度 30 μmol photons m-2 s-1）到所需的細胞密度，接著按照實驗步驟取 200 μl聚球藻RF-1 細胞分別與不同濃度的DNA（0.2-10 μg/ml）混合後，放入 28 ℃、連續光照（30 μE m-2 s-1）培養過夜。然後將細胞塗抹在含 25 mg/ml chloramphenicol的BG-110固體培養基上，經過 1 星期的培養，發現皆無任何菌落生長（Fig. 10A）。改變聚球藻RF-1 細胞與不同濃度DNA混合後的光照條件，將原來培養在連續高光照（30 μmol photons m-2 s-1）改為連續低光照（5 μmol photons m-2 s-1）或連續黑暗中，結果仍無菌落產生（Fig. 11B and C）。 4.2 電穿孔法實驗進行前，將聚球藻RF-1 藻液將細胞培養在 12L/12D（30 μmol photons m-2 s-1）到所需的細胞密度，接著按照實驗步驟取 40 μl聚球藻RF-1 細胞與不同濃度的DNA（0.2-10 μg/ml）混合，經電穿孔法後，置於 28℃、連續光照（30 μmol photons m-2 s-1）下培養過夜，再將細胞塗抹在含 25 mg/ml chloramphenicol的BG-110固體培養基上， - 30 -.

(31) 經 1 星期的培養後，發現皆無任何菌落生長（Fig. 11A）。改變電穿孔法後細胞培養的光照條件，將原來培養在連續高光照（30 μmol photons m-2 s-1）改為連續低光照（5 μmol photons m-2 s-1）或連續黑暗中，仍無菌落產生（Fig. 11B and C）。上述實驗都以BG110培養液或固體培養基培養，但因經過電穿孔的細胞比較脆弱，可能無法自行行固氮作用而無法生存，故將培養液或培養基更改為BG11 培養液或培養基，以提供氮源給聚球藻RF-1，但果仍無任何菌落產生（Fig. 12）。. - 31 -.

(32) (A) 25. Time. 29. 33. 37. 41. 45. 49. 53. 57. 12L/12D LDLL. (B). 120. Relative contents of COP23 (%). 100. LDLD. 80 60 40 20 0 120 100. LDLL. 80 60 40 20 0 25. 30. 35. 40. 45. 50. 55. Time (hr) Fig. 1. 12L/12D 建立 COP23 概日韻律（A）SDS-PAGE 分析後，以 0.25 ﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色。 12L/12D：培養在 12 小時光照、12 小時黑暗的環境中；LDLL：培養在 12 小時光照、12 小時黑暗的環境三天，改置連續光照中。（B）利用 AlphaImager 1220 計算 SDS-PAGE 結果的電泳帶 IDV（integrated density value）所做出的圖。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計八次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字 25、29…、53 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。. - 32 -.

(33) (A) 25. Time (hr). 29. 33 37. 41 45. 49 53. 57 61 65. 69 73 77. 81 85. 89 93. 12R/12D RDRR RFrDRR. (B). 120. RDRD. 100 80 60. Relative contents of COP23 (%). 40 20 120. RDRR. 100 80 60 40 20 120. RFrDRR. 100 80 60 40 20 0 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. T im e (h r). Fig. 2. 12R/12D 建立 COP23 概日韻律 (A)SDS-PAGE 以 0.25﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色。12R/12D：培養在 12 小時紅光、12 小時黑暗的環境中；RDRR：培養在 12 小時紅光、 12 小時黑暗的環境三天，改置連續紅光中。RFrDRR：在上述 3 天的馴化期中，分別在進入紅光光照期的第 4、6、8、10、12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，再改置連續紅光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算 SDS-PAGE 結果的電泳帶 IDV 後所做出的圖。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字 25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。. - 33 -.

(34) (A) 25. Time (hr). 29. 33 37. 41 45. 49 53. 57 61 65. 69 73 77. 81 85. 89 93. 12B/12D BDBB BFrDBB. (B). 120. BDBD. 100 80 60. Relative contents of COP23 (%). 40 20 120 100. BDBB. 80 60 40 20 120. BFrDBB. 100 80 60 40 20 0 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. Tim e (h r). Fig. 3. 12B/12D 建立 COP23 概日韻律 (A)SDS-PAGE 以 0.25﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色。12B/12D：培養在 12 小時藍光、12 小時黑暗的環境中；BDBB：培養在 12 小時藍光、 12 小時黑暗的環境三天，改置連續藍光中。BFrDBB：在上述 3 天的馴化期中，分別在進入藍光光照期的第 4、6、8、10、12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，再改置連續藍光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算 SDS-PAGE 結果的電泳帶 IDV 後所做出的圖。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字 25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。 - 34 -.

(35) M. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 97.4 66.2 45 29 20.1 14.4. Fig. 4. 利用親和性管柱純化 COP23 重組蛋白 Lane 1：誘導重組 COP23 蛋白在轉殖細菌大量表現。Lane 2：將細胞蛋白萃取液通過親和性管柱後，收取之濾液。Lanes 3-9：將親和性管柱中與鎳離子結合的重組 COP23 蛋白沖提出來。Lane 10：當沖提濾液收集到足夠量時，利用濾膜離心管濃縮 COP23 重組蛋白，直到重組 COP23 蛋白濃度達到 1 mg/ml 為止。. - 35 -.

(36) (A) M. COP23 Cell extracts 40 μg 1 μg. 2. 3. 127 80 52 42 27 20 14 10 (B) M. 1. 4. 5. 6. 7. 8. 98 64 50 36 22 16 6 4. Fig. 5. COP23 多株抗體的效價測試（惠安生技股份有限公司） (A)重組COP23 蛋白及聚球藻RF-1 蛋白萃取液分別作為測試的抗原，此為 SDS-PAGE經 0.25﹪(w/v) Coomassie brilliant blue R 250 染色的結果。(B)兔子免疫第三週的血清中抗體之效價測試，Lanes 1-4：抗原為COP23 重組蛋白， Lanes 5-8：抗原為聚球藻RF-1 蛋白萃取液。測試的血清有未免疫的兔子血清 (Lanes 1, 5)、稀釋 103倍(Lanes 2, 6)、5×103倍(Lanes 3, 7)及 104倍(Lanes 4, 8) 的免疫後血清。. - 36 -.

(37) (A). M. 50. 20. 10. 5. 2. 1. 0.5. 0.2. 0.1. M. 50. 20. 10. 5. 2. 1. 0.5. 0.2. 0.1. 127 80 52 42 27 20 14 10. (B) 127 80 52 42 27 20 14 10. Fig. 6. COP23 多株抗體與抗原結合之最佳濃度測試分別將多株抗體稀釋(A) 2×104倍、 (B) 5×104倍後，以西方轉漬法偵測不同濃度的聚球藻RF-1 蛋白萃取液，結果僅見 1 條條帶者為COP23 多株抗體與抗原結合的最佳條件。圖上方的數字代表聚球藻RF-1 蛋白萃取液的總濃度，從 0.1 μg到 50 μg。M為蛋白質標準分子量樣本。. - 37 -.

(38) (A) Time (hr). 25. 29 33 37. 41 45 49 53 57. 61. 65 69. 73 77. 81 85. 89 93. 25. 29 33 37. 41 45 49 53 57. 61. 65 69. 73 77. 81 85. 89 93. 12R/12D. RDRR. RFrDRR. (B) Time (hr) 12B/12D. BDBB. BFrDBB. Fig. 7. 西方轉漬法檢測光質與 COP23 概日韻律變化之建立 (A) 12R/12D 及(B) 12B/12D 所建立的 COP23 蛋白質含量的概日韻律。二條電泳圖分別為 SDS-PAGE（上）及西方轉漬法（下）之結果。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字 25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。遠紅光的處理（RFrDRR, BFrDRR）是在 3 天的馴化期中，分別在進入光照期的第 4、6、8、10、12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，再改置連續紅光或藍光中。 - 38 -.

(39) (A) 25. Time (hr). 29. 33 37. 41 45. 49 53. 57 61 65. 69 73 77. 81 85. 89 93. 12R/12D RDRR RFrDRR. (B). 120. RDRD. 100 80 60. Relative contents of COP23 (%). 40 20 120. RDRR. 100 80 60 40 20 120. RFrDRR. 100 80 60 40 20 0 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. T im e (h r). Fig. 8. 西方轉漬法檢測 12R/12D 建立 COP23 概日韻律 (A)西方轉漬法之結果。12R/12D：培養在 12 小時紅光、12 小時黑暗的環境中；RDRR：培養在 12 小時紅光、12 小時黑暗的環境三天，改置連續紅光中。 RFrDRR：在上述 3 天的馴化期中，分別在進入紅光光照期的第 4、6、8、10、 12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，再改置連續紅光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算西方轉漬法結果的電泳帶 IDV 後所做出的圖。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字 25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。 - 39 -.

(40) (A) 25. Time (hr). 29. 33 37. 41 45. 49 53. 57 61 65. 69 73 77. 81 85. 89 93. 12B/12D BDBB BFrDBB. (B). 120. BDBD. 100 80 60. Relative contents of COP23 (%). 40 20 120 100. BDBB. 80 60 40 20 120. BFrDBB. 100 80 60 40 20 0 20. 30. 40. 50. 60. 70. 80. 90. 100. T im e (h r). Fig. 9. 西方轉漬法檢測 12B/12D 建立 COP23 概日韻律 (A)西方轉漬法之結果。12B/12D：培養在 12 小時藍光、12 小時黑暗的環境中；BDBB：培養在 12 小時藍光、12 小時黑暗的環境三天，改置連續藍光中。 BFrDBB：在上述 3 天的馴化期中，分別在進入藍光光照期的第 4、6、8、10、 12 小時，以 10 分鐘的遠紅光處理，再改置連續藍光中。(B)利用 AlphaImager 1220 計算 SDS-PAGE 結果的電泳帶 IDV (Integrated density value 後所做出的圖。第一次取樣為進入連續光照中的第 25 小時，之後每隔 4 小時取樣一次，共計 18 次。圖上方的白黑區塊分別代表光照期與黑暗期，數字 25、29…、93 為進入連續光照之恆定環境中的取樣時間（小時）。 - 40 -.

(41) （A）高光照（30 μmol photons m-2s-1） DNA 濃度 (μg/ml). 0.2 0.5. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖效率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. （B）低光照（5 μmol photons m-2s-1) DNA 濃度 (μg/ml). 0.2 0.5. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖效率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. （C）黑暗 DNA 濃度 (μg/ml). 0.2 0.5. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. Fig. 10. 自然轉型法的實驗結果聚球藻RF-1 細胞與不同濃度的DNA混合後，分別培養在（A）高光照（30 μmol photons m-2s-1）、（B）低光照（5 μmol photons m-2s-1）和（C）黑暗，進行自然轉型法的實驗結果。. - 41 -.

(42) （A）高光照（30 μmol photons m-2s-1） DNA 濃度 (μg/ml). 0.2 0.5. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. （B）低光照（5 μmol photons m-2s-1） DNA 濃度 (μg/ml). 0.2 0.5. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. （C）黑暗 DNA 濃度 (μg/ml). 0.2 0.5. 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. Fig. 11. 電穿孔法的實驗結果（一）、（B）低光照（5 μmol photons m-2s-1）在（A）高光照（30 μmol photons m-2s-1）和（C）黑暗，聚球藻RF-1 細胞與不同濃度的DNA混合後，利用電穿孔法進行基因轉殖的實驗結果。. - 42 -.

(43) （A）BG110培養基或培養液 DNA 濃度 0.2 0.5. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. (μg/ml) 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. （B）BG11 固體培養基或培養液 DNA 濃度 0.2 0.5. 1. 1.5. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. (μg/ml) 菌落數. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 轉殖率(％). 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. Fig. 12.電穿孔法實驗結果（二）. 在進行電穿孔法轉殖過程中，分別使用（A）BG110固體培養基或培養液，或（B）BG11 培養基或培養液的實驗結果。. - 43 -.

(44) 肆、討論光質對植物是很重要的環境因子，因為光是植物的能量來源，且光對於植物的生長和發育具有多方面的影響，例如發芽、去白化（de-etiolation）、開花、向性和概日韻律的建立等，甚至影響植物的基因表現（Vince-Prue, 1994）。高等植物透過光接受器對光產生反應，光接受器包括光敏素、隱花素及向光素（phototropin），光敏素包括 PHY A-E，主要吸收 600-800 nm 的紅光和遠紅光（Quail, 1998），而隱花素（CRY 1 and 2）及向光素（PHOT 1 and 2）則以接收藍光和紫外光為主，主要吸收波長為 350-500 nm（Ahmad, 1999），但對於紫外光 B 的光接受器直至目前為止，仍未被鑑定出來。目前在原核生物中類似光敏素的基因序列， Lamparter et al. （ 1997 ）將藍綠藻 Synechocystis sp. PCC6803 的類似光敏素基因序列轉殖到大腸桿菌中，可以製造類似光敏素的蛋白，除了構造類似，亦有相似的吸收光譜，其他學者也報導數種其他藍綠藻具有類似光敏素的蛋白（Montgomery, 2007），對於藍綠藻接受紅光或藍光後產生不同的生理反應。此外，非光合細菌（Deinococcus radiodurans 和 Pseudomonas aeruginosa）也發現這類蛋白，幫助非光合細菌避免受光的侵害（Davis et al., 1999）。藍綠藻中也發現隱花素（Hitomi et al., 2000）和向光素. - 44 -.

(45) （Fiedler et al., 2005），隱花素和向光素的序列在 Synechocystis sp. PCC6803 偵測到，隱花素的功能較類似對光反應的轉錄調控因子（light-responsive transcriptional regulator），而向光素在藍綠藻的角色還未確定（Montgomery, 2007）。聚球藻 RF-1 已分離出類似光敏素的核酸序列，但尚未證實具有光敏素的功能（莊, 2003），而是否有類似隱花素和向光素的核酸序列以及這些光接受器與概日韻律的建立之間有何關係？則有待進一步的研究。 COP23 位於細胞膜上，它的合成、分解都具有韻律性，表現量上也有韻律的變化（Chen et al.,1996）。以白光/黑暗建立韻律後，回到恆定不變的環境時，COP23 會在光週期分解至幾乎看不到，而在暗週期又會大量合成（陳, 1996; 蔡, 2001）。本論文得到相似的結果，只要是有光/暗變化，不論是白光/黑暗、紅光/黑暗或藍光/黑暗的光暗週期皆可建立 COP23 含量變化的概日韻律（Fig. 1, 8, 9）。以 12R/12D 和 RDRR 分別處理聚球藻 RF-1，從 SDS-PAGE 分析顯示，兩者表現的 COP23 含量概日韻律週期相同，但以 RDRR 處理的相位（phase）比 12R/12D 早 4 小時出現，即 12R/12D 的處理可觀察到 COP23 含量的波鋒出現在黑暗期末到進入光照期間，而 RDRR 的波峰在黑暗期中（Fig. 2B），當有遠紅光干擾時（RFrDRR），其相位與 12R/12D 相同（Fig. 2B）。但西方轉漬法分析顯示，12R/12D 和 RDRR 分別處理 - 45 -.

(46) 的 COP23 含量概日韻律，週期和相位皆相似（Fig. 8B）。當有遠紅光干擾時（RFrDRR），其週期與相位亦無改變（Fig. 8B），因抗體對 COP23 有專一性，西方轉漬法的可信度較高，可知遠紅光的處理對於 COP23 含量所呈現的概日韻律之建立並無影響，光敏素可能非直接參與在概日韻律的建立途徑。由於 SDS-PAGE 和西方轉漬法的結果不一致，推測是因類似 COP23 分子量的蛋白質的呈現，而西方轉漬法使用的抗體無法偵測該蛋白。此外推測該蛋白可能受光敏素影響，且對紅光敏感；在 12R/12D 時該蛋白含量較多，影響 COP23 含量概日韻律的 SDS-PAGE 結果。而在 RDRR 時因對連續紅光（RR）敏感而含量少，未影響 SDS-PAGE 結果。當遠紅光干擾馴化期時，會使光敏素（Pfr）量降低，即使為連續紅光處理，該蛋白表現量不會受到抑制，而類似 12R/12D 情形，故從 SDS-PAGE 上看到概日韻律相位有所差異。以 12B/12D 和 BDBB 所建立的 COP23 含量概日韻律表現類型在 SDS-PAGE 和西方轉漬法分析上類似，週期約為 24 小時，相位亦接近（Fig. 3B and 9B），推測該類似分子量的蛋白質在藍光下表現量低或不表現。當有遠紅光干擾時（BFrDBB），COP23 含量概日韻律的建立及表現皆不受影響（Fig. 9B），因此排除光敏素參與概日韻律的建立，可能有藍光接受器參與其中。此外，藍光/黑暗所建立的 COP23 - 46 -.

(47) 含量概日韻律較不明顯（Fig. 7B），推測該藍光接受器作用強度較小所致。本論文證實光質的種類不影響 COP23 含量變化的概日韻律建立，這點和聚球藻 RF-1 的光合作用釋氧概日韻律不一樣，紅光/黑暗可以建立光合作用釋氧概日韻律，但藍光/黑暗馴化則不能建立（林, 2002），顯示光合作用釋氧速率和 COP23 含量變化概日韻律的建立，可能屬於不同的調控機制。另外，光合作用釋氧概日韻律的表現由紅光/黑暗建立後，可藉由遠紅光的干擾消除，顯示光合作用釋氧韻律的建立可能與光敏素有關（林, 2002）。但是 COP23 含量的概日韻律建立並不受遠紅光干擾，可能與光敏素（Pfr）含量無關，顯示黑暗條件方有促進 COP23 含量增高的作用。由此推測，聚球藻 RF-1 的生理時鐘可能有二種以上的光接受器參與調控，以感應外在環境的變化，調整其生理反應。 COP23 概日韻律的相關研究多，但其生理功能仍未知，欲知某特定基因之功能，一般可朝兩方向進行，分別是使目標基因過量表現（over expression），或使基因突變而不表現或表現量大幅降低，再藉由觀察生物之生理現象的改變，以推測該基因的功能。許多研究利用這類方法探討藍綠藻基因的功能，而這些藍綠藻都已建立基因轉殖系. - 47 -.

(48) 統。應用於藍綠藻基因轉殖的技術主要有自然轉型、接合作用（conjugation）及電穿孔法（Koksharova and Wolk, 2002）。自然轉型是一種最簡單且方便的轉型方法，直接將懸浮培養的藍綠藻與質體混合，放在黑暗環境培養，使細胞自行吸收質體，接著再使用抗生素篩選轉型成功的藻株，目前僅在少數藍綠藻的研究中使用，例如耐熱型藍綠藻 Thermosynechoccus elongates BP-1（Onai et al., 2004）。在 Synechocystis PCC 6803 的相關研究中，也成功利用自然轉型取得轉殖株（Anderson and McIntosh, 1991; Yoshihara et al., 2001; Nakasugi et al., 2006）。接合作用和電穿孔法是較常用於藍綠藻的基因轉殖方法，接合作用是藉由細胞間的接觸傳送 DNA，利用大腸桿菌作為媒介，其體內具有接合質體（conjugal plasmid），能運送自己或其他質體到藍綠藻（Thiel, 1994），如 Synechococcus PCC 7942 常利用此方法研究各種基因的表現（Aldehni et al., 2003），且接合作用的轉殖效率較自然轉型佳（Tsinoremas et al., 1994）。Prochlorococcus MIT9313 也成功利用接合作用完成轉殖工作，找出更多基因的功能（Tolonen et al., 2006）。電穿孔法則是利用高電壓脈衝，使藍綠藻細胞膜短暫出現小孔，使外來 DNA 進入細胞（Matsunaga et al., 1990）。在 Chiang et al. （ 1992 ）的研究中，同時使用接合作用和電穿孔法將質體轉入 Fremyella diplosiphon，以研究藍綠藻對於光接收的訊號傳遞，且顯示. - 48 -.

(49) 這兩種轉殖方法的效率相似。大部分藍綠藻基因的相關研究會同時使用接合作用和電穿孔法，但接合作用的方法較繁雜，在轉殖成功後必須移除大腸桿菌，相對的電穿孔法較容易進行。故本藍綠藻的研究中，主要以電穿孔法進行基因轉殖，若能建立此系統，可用於研究 cop23 基因的功能，對研究聚球藻 RF-1 的生理反應有相當大的幫助。. 聚球藻RF-1 尚無適當的質體作為基因轉殖的載體，不像Nostoc PCC 7524 具內生性的質體（Reaston et al., 1982），或是Synechococcus NKBG 042902 具有三種可作載體的質體（Matsunaga et al., 1990）。當經由轉型作用將質體送回Nostoc PCC 7524 或Synechococcus NKBG 042902 的細胞內時，質體可在藍綠藻細胞內自行複製且表現。在建立聚球藻RF-1 的轉殖系統時，我們選用質體pRL271 作為載體，如果質體在細胞內可以表現，轉殖的聚球藻 RF-1 即可生長在含 chloramphenicol的BG110固體培養基。但實驗結果顯示，無論利用自然轉型法或電穿孔法都無法轉殖成功（Fig. 10, 11, 12）。自然轉型法在藍綠藻轉殖系統中只有少數研究成功轉殖，而聚球藻RF-1 本身可能無法自行吸收質體，故此方法無法建立轉殖系統。電穿孔法失敗的原因可能有：（1）聚球藻RF-1 的細胞外圍有一層藻膠保護，且未處理細胞壁，可能影響電穿孔時的效率，以植物為例，會先移除其細胞壁，分離出原生質體（protoplast），再經由電穿孔法將DNA送入（Rech - 49 -.

(50) et al., 1988）。（2）選用的抗生素濃度可能過高，即使轉殖成功的聚球藻RF-1 也無法生長。（3）pRL271 不適合作為聚球藻RF-1 之載體，可能被送入聚球藻RF-1 細胞內，但無法有效產生蛋白質來分解篩選用的抗生素。. 綜合前人研究及本論文的結果得到下列結論：（一）光暗週期對 COP23 含量概日韻律的建立很重要，且不同光質的設定皆能建立 COP23 的概日韻律，表示光受器和 COP23 之間具有某種程度的關聯。（二）聚球藻 RF-1 的基因組定序已接近完成，經由基因庫比對，發現聚球藻 RF-1 有 80 ％的未知基因（未發表結果），若轉殖系統無法建立，將對基因功能的研究造成阻礙。而電穿孔法廣泛用於動物、植物、細菌或藍綠藻的轉殖作用（Rech et al., 1988; Fiedler and Wirth, 1988; Thiel, 1994; Butler, 2005），相信其對於聚球藻 RF-1 轉殖系統的建立具有相當大的幫助，這部分在未來需更進一步的探討。. - 50 -.

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(60) 附錄一 BG110培養基配方 (1) EPPS. 2.523 g. (2) 磷酸氫鉀（K2HPO4）. 0.052 g. (3) 硫酸鎂（MgSO4）. 0.075 g. (4) 氯化鈣（CaCl2）. 0.036 g. (5) 檸檬酸（Citric Acid）. 0.006 g. (6) Ferric Ammonium citrate. 0.006 g. (7) EDTA. 0.0001 g. (8) 碳酸鈉（Na2CO3）. 0.02 g. (9) A5（Trace-metal mix）. 1 ml. Trace-metal mix（g/L）硼酸（H3BO3）. 2.860 g. 氯化錳（MnCl2）. 1.810 g. 硫酸鋅（ZnSO4）. 0.222 g. Na2MoO4. 0.390 g. 硫酸銅（CuSO4）. 0.079 g. 氯化鈷（CoCl2）. 0.050 g. 取 1000 ml 錐形瓶，加入二次蒸餾水，將以上(1)～(9)種藥品秤重後，加入並溶解之。以 1 N NaOH 將培養液調整為 pH 8.0，再加入二次蒸餾水至 1 公升，最後以高溫高壓滅菌處理。. - 60 -.

(61) 附錄二 14﹪SDS-PAGE 配方 Resolution gel. vol.. 1M Tris, pH 8.7. 2.5 ml. 30﹪A/B (acrylamide：bisacrylamide= 29.2：0.8). 4.66 ml. 10﹪SDS. 100 μl. 10﹪AP (ammonium persulfate). 50 μl. TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylene-diamine). 20 μl. dd.H2O. 2.7 ml. Stacking gel. vol.. 1M Tris, pH 6.8. 375 μl. 30﹪A/B (acrylamide：bisacrylamide=29.2：0.8). 200 μl. 10﹪SDS. 15 μl. 10﹪AP (ammonium persulfate). 7.5 μl. TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylene-diamine). 3.75 μl. dd.H2O. 915 μl. - 61 -.

(62) 附錄三 pQE60 質體圖譜（Qiagen）. pQE60-COP23 重組質體構築圖. COP23 (700 bp). - 62 -.

(63) 附錄四聚球藻 RF-1 之 DNA 製備流程圖離心收集聚球藻 RF-1 細胞，去除藻膠利用 6M guanidine-HCl 作用 5 分鐘，使細胞穿孔離心（4℃, 15,493 g、1 分鐘）去除上清液加入 TE buffer（pH 8.0）、lysozyme（最後濃度 10 mg/ml）及 RNase A（最後濃度 10μg/ml），在 37℃下處理 1 小時離心（4℃, 15,493 g、1 分鐘）去除上清液加入 proteinase K（最後濃度 100 mg/ml）和 2﹪SDS（此時總體積 500 μl）60℃ 下處理 2 小時等體積 phenol/chloroform（4：1）處理，取上層液等體積 phenol/chloroform（1：1）處理，取上層液等體積 chloroform 處理、取上層液加入 5 M NaCl（最終濃度 0.2 M）及兩倍體積之 99.5﹪冰酒精處理，混合後可見白色絲狀的 DNA 沉澱離心（4℃, 15,493 g、3 分鐘），去除上清液 DNA 沉澱以 1 ml 75﹪酒精洗去鹽類離心（4℃, 15,493 g、3 分鐘），去除上清液待 DNA 沉澱陰乾後，加入 100 μl 二次水溶解測量DNA溶液之OD260和OD280之吸光值 - 63 -.

(64) 附錄五 pRL271 質體圖譜（Black et al., 1993）. - 64 -.

(65) 附錄六 QIAperp Spin Miniprep Kit Protocol 1. Resuspend pelleted bacterial cells in 250 μl Buffer P1 and transfer to a microfuge tube. 2. Add 250 μl Buffer P2 and gently invert the tube 4-6 times to mix. 3. Add 350 μl Buffer N3 and invert the tube immediately but gently 4-6 times. 4. Centrifuge at 12,000 g for 10 min. 5. During centrifugation, place a QIAprep spin column in a 2-ml collection tube. 6. Apply the supernatants from step 4 to the QIAperp column by decanting or pipetting. 7. Centrifuge at 12,000 g for 1 min. Discard the flowthrough. 8. Wash QIAprep spin column by adding 0.75 ml Buffer PE and centrifuging at 12,000 g for 1 min. 9. Discard the flow-through, and centrifuge an additional 1 min with 12,000 g to remove residual wash buffer. 10. Place QIAprep column in a clean 1.5-ml microfuge tube. To elute DNA, add 50 μl Buffer EB to the center of each QIAprep column, let stand for 1 min, and centrifuge at 12,000 g for 1 min.. - 65 -.

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