顯微鏡菌相觀察

微生物在不同的代謝途徑、有機負荷、水質狀況下均會有不同的菌相 產生，例如適合生長在高有機負荷的菌株，會有良好的產氣表現，但低有 機負荷時的生長表現或許就會不同，經過顯微鏡的菌相觀察，我們可以得 知在不同狀態下，不同優勢菌株的生長表現，經由不同菌株的外觀，也可 概略的判斷是何種菌種。

一、 位相差顯微鏡與螢光顯微鏡觀察菌相

在試程穩定狀態下，自反應槽中取出污泥，分別在位相差顯微鏡與螢 光顯微鏡下觀察、照相，其觀察流程如下（林明瑞，1989）：

（一）將取自於反應槽的污泥塗抹於載玻片後，蓋上蓋玻片。需注意的 是載玻

片上的污泥不宜太厚，水分避免遺留太多，造成在螢光顯微鏡下觀察 時的背景螢光干擾，而影響菌相的觀察。

（二）將製作好的樣品置於顯微鏡觀察平台，進行位相差與螢光顯微鏡 的菌相觀察、照相。先由螢光顯微鏡觀察菌相並照相，再轉至位相差 顯微鏡下進行同一位置的觀察與照相。本試驗中所使用的顯微鏡型號 為 Nikon ECLIPSE E600，操作條件為 Combination Name UV-2A，

Dichroic Mirror 400，Barrier Filter 420，所使用的放大倍率為 150 倍與 400 倍兩種。

二、以掃描式電子顯微鏡（SEM）觀察反應槽之菌相

在試程穩定狀態下，自反應槽中取出污泥， 以醋酸纖維濾紙過濾，

使污泥附著於濾紙上，並剪下一小段經以下前處理步驟後，再以掃描式電 子顯微鏡觀察、照相。前處理步驟如下（林明瑞，1990）：

（一）固定（fixation）與脫水（dewatering）：

1.將菌落取下，黏貼於雙面膠上，低上醛類固定液（0.1M 磷酸緩衝溶液

＋2.5％戊二醛 glutaraldehyde＋3％多聚甲醛 paraformaldehyde）， 在 4℃下保存 2 小時。

2.隨後移除醛類固定液，滴上同量之 0.1M 磷酸緩衝溶液，於 4℃中保存 15 分鐘，以洗去殘餘醛類固定液。

3.移除磷酸緩衝溶液，滴上鋨酸固定液（0.1M 磷酸緩衝溶液＋0.2％四氧 化鋨），在 4℃中保存 1 小時。

4.移除鋨酸固定液，滴上三倍體積的磷酸緩衝溶液，於 4℃中保存 15 分鐘，

以洗去殘留之鋨酸固定液。

5.移除磷酸緩衝溶液，滴上 50％酒精溶液（v/v），在室溫下保存 15 分鐘。

6.移除酒精溶液，滴上 70％酒精溶液（v/v），在室溫下保存 15 分鐘。

7.移除 70％酒精溶液，滴上 80％酒精溶液（v/v），在室溫下保存 15 分鐘。

8.移除 80％酒精溶液，滴上 90％酒精溶液（v/v），在室溫下保存 15 分鐘。

9.移除 90％酒精溶液，滴上 95％酒精溶液（v/v），在室溫下保存 15 分鐘。

10.移除 95％酒精溶液，滴上 100％酒精溶液（預先加入無水氯化亞鈷以 移除可能存在的水分），在室溫下保存 30 分鐘。

11.移除 100％酒精溶液，最後滴上 100％丙酮溶液，準備進行臨界點乾燥。

（二）臨界點乾燥（Critical point drying，CPD）：

將浸於丙酮中的菌落連同雙面膠至入臨界點乾燥機中，灌入七分滿之 液態二氧化碳，靜置五分鐘，之後放掉二氧化碳，再灌入，並改變溫度與 壓力到臨界點，保持 10 分鐘，放掉，最後再灌入臨界點二氧化碳，保持 一小時，再放掉，過程中可移除殘餘水分、酒精、丙酮以及少量可揮發性 有機物，而完成臨界點乾燥。

（三）覆膜（Coating）：

取出樣品，置入金屬離子覆膜機中（coating sputter），將樣品置於 操作室陽極，覆膜用的金片置於陰極，使操作室真空度達到 10^-2mmHg，通

上電壓，使殘留於操作室中之空氣分子離子化撞擊飛向陰極之金片，使金 原子散落於樣品表面形成均勻金屬薄膜，時間為 3 分鐘。

（四）上機觀察

使用掃描式電子顯微鏡（Topcon Abt 150s）觀察、照相，加速電壓 15kV，工作距離 15 公分。