0.145 mL 樣品加入 0.145 mL（10 mM hexamine、10 mM KCl、
3 mM copper sulfate）混合液，加入 1 mM TMM 0.0145 mL 在室溫下 反應3 分鐘於 485 nm 測吸光值，吸光值越低表示樣本螯合金屬離子 效果越強。
（九）幾丁聚醣水解物與腸道菌共培養試驗
將菌種接種至液態培養基中，活化一天（菌量為 1~5×108/mL）。
基礎培養基中添加不同濃度（100 ppm 與 400 ppm）之幾丁聚醣水解 物（DD80-CHtri、DD80-CHcel、DD92-CHtri 及 DD92-CHcel），將 Bifidobacteria（等比例之 B. breve BCRC 14601、B. longum BCRC
14602 及 B. adolescentis BCRC 14606）與 Enterobacteria（等比例菌液
量之 E. aerogenes BCRC 10370、E.cloacae BCRC 10401 及 E. coli BCRC 10675）以不同菌數比例（1：1、4：1 及 10：1），於厭氣操 作台（Anaerobic Chamber SHEL BACTRON 1.5）內接種至上述培養 基中，37℃下培養（氣體調節為 N2 90％、H2 5％及 CO2 5％），48 小時後取樣、連續稀釋並分別塗抹於鑑別性培養基（BSM、MacConkey Agar ） 上 ， 於 恆 溫 厭 氣 培 養 （ Personal CO2/Multigas Incubator APC-30D/AMP-30D）中培養 48 小時後觀察菌數變化。
肆、結果與討論
一、幾丁聚醣水解物之製備與分子量分佈
幾丁聚醣常利用酵素進行水解而得到幾丁聚醣水解物，其分子量 主要是測量水解後黏度變化，以Mark Houwink 方程式計算分子量。
由圖十三中可發現未水解之幾丁聚醣分子量在300 kDa 以上，經過酵
素水解後分子量有逐漸降低之趨勢，並在水解 24 小時後分子量變化
趨於平緩，因此將幾丁聚醣酵素水解時間訂為24 小時。
在水解24 小時後幾丁聚醣水解物分子量降低至 20 kDa 以下，其 中分子量大小為DD92-CHtri（13.54 kDa）＞DD80-CHtri（9.64 kDa）
＞DD80-CHcel（8.07 kDa）＞DD92-CHcel（6.92 kDa）。以上述不同 酵素處理所得之水解物進行後續之研究。
二、幾丁聚醣水解物抑菌測試
（一）幾丁聚醣水解物對伺機菌之影響
幾丁聚醣水解物已被證實具有良好抑制病原菌之效果，表五即研 究腸道中的伺機腸道菌，包括E. aerogenes、E. cloacae 與 E. coli，對 幾丁聚醣水解物的耐受性，發現相同去乙醯度下以Trichoderma viride 產生的chitinase 粗酵素水解之產物有較佳之抑菌效果；若以相同水解 酵素來說，去乙醯度較大者有較好的抑菌能力；對 E. coli 而言，
DD92-CHtri的抑制效果最好（100 ppm），其次是 DD92-CHcel，再來 則是DD80-CHtri，最差的是DD80-CHcel。伺機腸道菌中又以E. coli 菌較陽性菌佳，約可抑制20-60％（Chen et al., 2002.），實驗中發現 三株伺機腸道菌耐受性皆不同，以 E. coli 最差。因此推測幾丁聚醣水
（二）幾丁聚醣水解物對Bifidobacterium 之影響
表 六 中 去 乙 醯 度 80% 、 92% 的 幾 丁 聚 醣 水 解 物 對 三 株 Bifidobacteria 較沒有抑制效果，三株 Bifidobacteria 中以 B. brevis 較
為敏感，DD80-CHtri、DD80-CHcel、DD92-CHtri 及 DD92-CHcel 在 400 ppm 下可抑制 B. brevis 生長。Gerasimenko 等（2004）的實驗結
果不同，他們發現分子量在 6～12 kDa 0.0025 ppm 即能抑制 B.
bifidum，因為菌株本身對幾丁聚醣水解物的耐受性不盡相同，推測是
因為B. bifidum 的耐受性較差所導致。
No 等（2002）發現分子量 22 kDa 的幾丁聚醣對革蘭氏陽性菌及 革蘭氏陰性菌會降低1～2 log CFU/ml。根據學者研究發現低分子量 的幾丁聚醣水解物對革蘭氏陽性菌中的乳酸菌之 MIC 為 500-1000 ppm，此與本文結果亦有所出入。
三、幾丁聚醣水解物儲存試驗
益生菌目前發現對人體有許多生理功能，因此常添加於市售發酵 乳品中，所以產品中含有的益生菌菌數是相當重要的，此會影響產品 的品質也會影響產品的價格（Sanders, 1998）。尤其益生菌對儲存時 環境含氧量的改變有相當大的敏感性（Krasaekoopt et al., 2006；Matto et al., 2006；Cristina et al., 2007；Donkor et al., 2007），在產品儲存
期 間 亦 容 易 死 亡 ， 存 活 率 逐 漸 降 低 。 因 此 本 實 驗 選 擇 不 抑 制 Bifidobacteria 但可抑制 Enterobacteria 的幾丁聚醣水解物濃度，將 400 ppm 的 DD80-CHtri、DD80-CHcel、DD92-CHtri及 DD92-CHcel添加
於市售產品中，儲存在 4℃下 35 天，觀察市售發酵乳品中乳酸菌之
有關。
許多文獻證實添加益生質於含益生菌之發酵乳品中，可以降低益 生菌隨儲存時間的延長而死亡的情形，Capela 等（2006）發現對發酵 乳 中 的 菌 種 L. acidophilus 、 L. casei 及 B. longum 添 加 2 ％ Fructooligosaccharides 與 Inulin 等益生質，在 4℃下儲存 4 星期後，可 延緩菌數死亡1 log CFU/ml。Martínez-Villaluenga 等（2006）在乳品 中添加raffinose 寡糖類後，在 4℃儲存 3 週後可以延緩乳酸菌降低一 個log。
陸陸續續已經有許多益生質寡醣類物質發現可幫助益生菌生 長、提高益生菌的存活率，本實驗添加幾丁聚醣水解物後發現亦有此 效果，此外幾丁聚醣具有在人體中不被水解吸收之特性，因此推測幾 丁聚醣水解物可能具有益生質特性，因此進行以下實驗確認之。
四、幾丁聚醣水解物益生質特性評估
Lactobacillus sp.與 Bifidobacteria 生長濁度約 0.25 左右（Lee et al.,
2002）。
本實驗將最不具有抑制性的幾丁聚醣水解物 DD80-CHcel添加在 基礎培養基中取代碳源，培養三株 Bifidobacteria。圖十七發現 B.
breve、B. longum 及 B. adolescentis 均無法有效利用 DD80-CHcel生長。
進一步以幾丁質的單體 NAG 來做確認，將 0.5％ NAG 添加至含有 1.5％葡萄糖之基礎培養基中作為碳源（圖十八），結果顯示相較於 葡萄糖，NAG 對於菌種生長並無幫助。為了進行確認，乃比對菌種 鑑定資料庫系統（Biolog，USA）中三株 Bifidobacteria 對 NAG 之使 用率，表七發現B. longum 及 B. adolescentis 無法利用 NAG，而 B. breve 的利用率為 46％（意即在 100 株受試菌株當中，只有 46 株會使用
BCRC 14601 不能使用 NAG 來作為生長之用。而 Enterobacteria 三者
對 NAG 的使用率則皆在 75％以上，相對高很多。本實驗所使用之 Bifidobacteria 菌株，不能使用 NAG。也因此，NAG 所組成之聚合物
並不能作為 Bifidobacteria 的益生質，這個結果與 Lee 等人（2002）
相左。Lee 學者使用的基礎培養基是 MRS，其是專門用來培養乳酸菌 之培養基，含有相當豐富之營養，而本研究中使用之基礎培養基是不 含任何碳源之basal media，主要是將幾丁聚醣水解物作為基礎培養基 中碳源，因為兩者使用的基礎培養基不同，其可能導致不同的結果。
五、幾丁聚醣水解物抗氧化性分析
若以去乙醯度觀之，則是以 92%比 80%較佳，可能是因為去乙醯度 92%的溶解度較好，酵素水解所產生的還原醣較多，因此還原力比較 好，也因此幾丁聚醣水解物添加在市售產品中保護益生菌延緩菌數死 亡 的 情 形 。 其 可 能 來 自 於 其 具 有 之 還 原 力 ， 降 低 了 氧 氣 對 Bifidobacteria 的傷害。
六、幾丁聚醣水解物對腸道菌叢之影響
人體健康與腸道細菌組成息息相關，菌相組成亦相當複雜，其中 Bifidobacteria 是益生菌，可促進人體健康，而少量伺機菌存在腸道
中，可幫助人體進行代謝功能，菌量過多或過少對人體皆有不良影 響 。 已 發 現 幾 丁 聚 醣 水 解 物 對 於 常 見 病 原 菌 如 Aeromonas hydrophila、E. coli、Listeria monocytogenes、Pseudomonas aeruginosa、
Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Vibrio cholerae 及 V.
parahaemolyticus 有良好的抑制效果（Seo et al., 1992. Tsai et al,
2000.），且實驗發現 Bifidobacteria 對幾丁聚醣水解物耐受性較高，
因 此 利 用 體 外 共 培 養 試 驗 觀 察 幾 丁 聚 醣 水 解 物 對 腸 道 菌 中 Bifidobacteria 與 Enterobacteria 互動之影響。
去乙醯度 80%與 92％的幾丁聚醣水解物對腸道菌共培養有相似 結果，表八及表九發現當 Bifidobacteria 與 Enterobacteria 單獨與水解 物共培養時並未對其生長造成影響，其中 DD80-CHcel的添加對兩者 之生長皆有所幫助，且濃度越高其助益越大，推測是其具有分子量小 與還原力等作用。而 DD92-CHcel者並未有明顯提高菌量的現象，推
測可能是去乙醯度高的 DD92 水解物本身的抑菌效果較佳。總括來
說，幾丁聚醣水解物具有還原力，對 Bifidobacteria 可減少環境中氧
作為生長營養來源。
在1 比 1 的比例下共培養時幾丁聚醣水解物並未對 Bifidobacteria 與Enterobacteria 造成影響(表八與表九)，發現 Enterobacteria 的菌數 較Bifidobacteria 多 1 log CFU/ml，可能是 Bifidobacteria 本身的遲滯 期長，Enterobacteria 在培養初期即成為優勢菌株，對 Bifidobacteria
生長產生壓力，導致生長不良的情形發生。當 Bifidobacteria 與 Enterobacteria 的比例逐漸變大時，若以 4：1 的比例混合，結果發現
在未添加水解物時是以 Enterobacteria 的菌量較多，加入水解物後 DD80-CHtri 400 ppm 可 提 高 Bifidobacteria 菌 數 ， 而 抑 制 Enterobacteria。將 Bifidobacteria 與 Enterobacteria 的比例拉大為 10：
1 時 ， 發 現 Enterobacteria 的 菌 數 有 受 到 抑 制 的 跡 象 ， 推 測 是 Bifidobacteria 一開始就是優勢菌株所以抑制 Enterobacteria 的生長，
再加上幾丁聚醣水解物的抑制效果，可有效降低腸桿菌的菌數。
Vernazza 等（2005）將不同分子量大小之幾丁聚醣與腸道菌共培 養，發現不同分子量對總菌數並無明顯影響，分子量在50～375 kDa 可抑制Bacteroides 與 Clostridia 約 1 log CFU/ml，對 Bifidobacteria 無 顯著影響；較低分子量（50～190 kDa）則對 Lactobacilli 會造成毒害；
分 子 量 若 小 於 5 kDa 的 幾 丁 寡 醣 對 Bacteroides 、 Clostridia 及 Bifidobacteria 皆能提高菌數。此結果與本研究之發現有相似之處。本
研 究 中 使 用 之 幾 丁 聚 醣 水 解 物 其 分 子 量 在 7 ～ 14 kDa 對 Enterobacteria 有抑制性，對 Bifidobacteria 則無顯著影響，其中以
cellulase 水解之水解產物皆能提高 Bifidobacteria 生長。因此幾丁聚醣 水解物在適當比例下可幫助 Bifidobacteria 生長而伺機腸道菌受威脅 不易增生，可幫助人體腸道趨於健康正相。
伍、結論
去乙醯度為 80 及 92 之幾丁聚醣（分子量約 300 kDa）經過 chitinase 與 celluase 酵素水解 24 小時後皆可降低至 15 kDa 以下。
Bifidobacteria 對上述條件所製備之幾丁聚醣水解物耐受性高，而腸道
中伺機菌雖可被抑制但不會造成死亡的效果，不致妨礙腸道中伺機菌
之正常生長。幾丁聚醣水解物添加市售產品中，發現儲存 35 天期間
內有助於延緩商品中乳酸菌死亡的情形。發現celluase 水解之幾丁聚 醣水解物具有較佳的還原力，可減少環境中氧氣對乳酸菌之傷害。適 當比例之幾丁聚醣水解物與腸道菌共培養後，可幫助 Bifidobacteria 成為優勢，而腸道中伺機菌有被抑制的現象。
綜合以上結果，幾丁聚醣水解物與 Bifidobacteria 的相乘效果下 能抑制腸道中伺機菌的過度生長，未來可進一步應用至人體試驗，藉 以改善腸道菌相，希望能促進人體健康。
陸、參考文獻
賴怡君。1999。乳酸菌之抗氧化性及抗致突變性對細胞株 Intestin 407 之影響。國立中興大學食品科技研究所碩士論文。
譚靜芬。1999。機能性寡醣之介紹。食品工業。31（7）：1-8。
Alander M, Matto J, Kneifel W, Johansson M, Kogler B, Crittenden R, Mattila-Sandholm T and Saarela M. 2001. Effect of galacto-oligosacc haride supplementation on human faecal microflora and on survival
Alander M, Matto J, Kneifel W, Johansson M, Kogler B, Crittenden R, Mattila-Sandholm T and Saarela M. 2001. Effect of galacto-oligosacc haride supplementation on human faecal microflora and on survival