Synbiotics 為益生菌與益生質相加乘後之名稱，益生菌與益生質 對人體皆有益處，當兩者共用時具有加乘的功效，許多研究發現益生 質在體內或體外試驗中皆有促進益生菌生長的效果，更可提高益生菌 的生理功能（Brown et al., 1998；Collins et al., 1999； Asahara et al., 2001；Crittenden et al., 2002；Bielecka et al., 2002；Charalampopoulos et al., 2002；Tuohy et al., 2003；Rastall et al., 2005；Bruzzese et al.,
2006；Geier et al., 2007）。
一、 幾丁質、幾丁聚醣與幾丁寡糖之關係
（一） 幾丁質（Chitin）
Chitin （圖十）在自然界中的含量相當豐富，存在於許多甲殼動 物的外殼與真菌類的細胞壁中，為β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine 的直 鏈聚合物，在自然界中的含量僅次於纖維素，也是地球上除蛋白質外 類的外殼皆為α-chitin（Wood and Kellogg, 1988）。
2. β-chitin
β-chitin 為單斜晶系（monoclinic），分子鏈的排列為平行排列
（parallel packing），這樣的排列導致分子間的氫鍵較少，因此結構
較為鬆散，烏賊及尖鎖管的軟骨和鬚腕動物的軟管則為 β-chitin
（Wood and Kellogg, 1988）。
3. γ-chitin
γ-chitin 的分子鏈排列則為 α-chitin 及 β-chitin 的混合，主要存在於 藻類和真菌類中（Wood and Kellogg, 1988）。
圖十、chitin 結構式及單體 Fig 10. Structure of chitin.
(Kumar, 2000)
圖十一、Chitin 的三種排列方式
Fig 11. Arrangement of the chain in chitin.
(Wood and Kellogg, 1988)
（二）幾丁聚醣（chitosan）
chitin 經高溫及強鹼的作用進行去乙醯化（deacetylation）作用，
將部分或全部的乙醯基轉變成胺基，即為幾丁聚醣，其去乙醯基程度 由 65% 至 99% 不 等 ， 一 般 以 70~90% 最 常 見 。 幾 丁 聚 醣 為 β-1,4-D-glucosamine 的直鏈聚合物（圖 12），其鏈上的胺基（-NH2），
在酸中會呈現（-NH3+），使其成為帶有正電荷，因此 chitosan 具有
溶於酸性或弱酸性的有機酸及無機酸的特點，故 chitosan 的溶解度較 chitin 為佳，大部分以 5%的醋酸（acetic acid）當溶劑。經酸性溶劑 溶解後具有弱鹼性的陽離子電解質（cationic polyelectrolyte）特性，
且具有胺基（amino group）與氫氧基（hydroxyl group），利於化學 製備各種衍生化合物。通常可將其製成膠狀、纖維狀、珠狀、薄膜狀 及海綿狀等，以提供各種應用，常應用在污泥處理、食品加工與螯合 金屬離子等，但近年來正逐漸趨向於高價值的商品，例如化妝品、殺 菌劑、攜帶藥物者、食品添加物及健康食品….等等。例如利用低分
子量的 chitosan 做成 nanoparticles，攜帶破傷風類毒素（Tetanus toxoid），注入小鼠中，對於提高並維持較長時間的免疫反應有顯著 的效果（Vila et al., 2004）。
圖十二、Chitosan 結構式及單體 Fig 12. Structure of chitosan.
(Kumar, 2000)
（三）幾丁質水解物（Chitooligosaccharides；COS）
1. 結構
由於 chitin 及 chitosan 水溶性差，也因此人們就試著製造出能夠 溶於水中，並且具備其生理活性的 chitooligosaccharides。幾丁質水解 物一般可分為N-乙醯幾丁寡醣（N-acetyl-chitooligosaccharides）與幾 丁寡醣(chito-oligosaccharides)，N-乙醯幾丁寡醣由 2-10 個的 N-乙醯 葡萄糖胺形成的；而幾丁寡醣是以葡萄糖胺為單體形成的醣類。幾丁 質水解物可溶於水，在食品方面仍具有多醣的特性，如保水、吸濕及 抗菌等，在農業、醫學、食品領域上擁有高度價值。如用酵素粗萃取 液（crude enzyme：cellulase from Trichoderma viride 和 Acremonium cellulolyticus 、 lipase 、 hemicellulase 、 pectinase ） 所 製 造 的
N-acetyl-D-glucosamine，其可提高關節滑液的黏性、改善軟骨的代謝
與 增 強 肌 關 節 的 活 動 功 能 ， 故 有 利 於 受 損 關 節 軟 骨 的 修 復 治 療
（Sashiwa et al., 2003）。
2. 製備方式
使用酵素法雖然成本高（Qin et al., 2004），但是毒性低（Ilyina et al., 2000），能以少量的酵素就可以得到較高的產率，目前較常被使
用的酵素為chitinase、chitosanase、celluase、lyzozyme 及 glycosidase 等。
3. 生理功能
幾丁質、幾丁聚醣、幾丁質水解物被廣泛應用在農業、生醫及食 品領域（Shahidi et al., 1999），以下介紹其幾個重要生理活性：
（1）降低脂肪代謝
幾丁聚醣本身的正電荷會與帶負電的脂肪結合，形成膠狀物質，因此 阻斷脂肪被小腸吸收代謝（Deuchi et al., 1994；Ormrod et al., 1998）。
（2）抗腫瘤活性
瘤細胞外圍形成一個膜，導致腫瘤細胞生長受到限制（Saiki et al., 1990；Tsukada et al., 1990）
（3）提高免疫力
幾丁質類物質能夠促進免疫球蛋白的活性，誘發巨噬細胞，有助 於增強免疫系統（Meada et al., 1992；Shibata et al., 1997）
（4）抗氧化性
目前以發現幾丁質類物質及其衍生物具有良好的抗氧化力，以發 現其能夠抑制脂質過氧化、抑制TBARS（thiobarbituric acid reactive substance）生成，且對羥基自由基（hydroxy radical）有良好的清除 能力（Matsugo et al., 1998；Xue et al., 1998；Xie et al., 2001；Huang et al., 2005；Chien et al., 2007；Kim and Thomas, 2007；Yen et al., 2007）
（5）促進傷口癒合、凝血
幾丁質類物質使用在傷口上，除了具有抗菌的功效且其不會引起 發炎反應，在受傷部位會促進受傷區域重新生成，故有促進傷口癒合 之能力（Biagini et al., 1991；Chung et al., 1994）。除此之外幾丁質類
物質被發現具有凝集作用，會促進血小板分泌凝血因子，進而達到止 血的效果（Subar et al., 1992；Hirano, 1999）。
（6）抗菌
利用cellulase 水解 chitosan 所水解出之產物，其聚合度為 1～8，
其中大於hexamer 的重量比為 44.3％，這個 chitooligosaccharides 的混 合 液 具 有 很 強 抗 菌 效 果 ， 對 於 常 見 的 病 原 菌 如 Aeromonas hydrophila、E. coli、Listeria monocytogenes、Pseudomonas aeruginosa、
Salmonella typhimurium、Shigella dysenteriae、Staphylococcus aureus、
Vibrio cholerae 及 V. parahaemolyticus 之 MIC 為 5~29 ppm，若用
chitosan 則 需 要 的 濃 度 則 為 50~1000ppm ， 所 以 相 對 於 chitooligosaccharides 來說，chitosan 所需要的量就大很多，如果添加 0.24％到牛奶中，可有效抑制牛奶中腐敗菌及病原菌生長，藉以延長 其保存期限（Hirano and Nagao, 1989；Jeon and Kim, 2000；Tsai et al., 2000；Choi et al., 2001；Jeon et al., 2001；No et al., 2002；Gerasimenko et al., 2004；Yang et al., 2005） 菌具有良好的抗菌活性 (Tsai et al., 2000)。Lee 等人（2002）認為幾 丁聚醣水解物具有良好抗菌活性，但並未抑制乳酸菌，且可幫助其生
參、材料方法
一、研究方法及策略
近年來 chitin 及 chitosan 因為用途廣泛而引起注意，尤其在醫藥 領域中發現具有抗菌功效，對於許多病原菌皆有不錯的抑制效果，但 因其不溶於水之特性，導致應用時受到限制。
本研究利用溶解性較佳之具有抑菌活性之幾丁聚醣水解物篩選 不受幾丁聚醣水解物影響之乳酸菌，並找出能抑制但不傷害到一般腸 道菌之幾丁聚醣水解物最佳濃度，調配幾丁聚醣水解物與乳酸菌最適 的條件比例。觀察幾丁聚醣水解物對腸道菌抗菌活性之研究及腸道菌 互動之影響，以開發使益生菌成為腸道優勢菌株之幾丁聚醣與益生菌 之複合配方，藉以改善腸道菌相，促進人體腸道健康。
二、研究架構
幾丁聚醣（去乙醯度80、92%)
（水解物 CHtri、CHcel )
幾丁聚醣酵素水解物
Bifidobacteria Enterobacteria
共培養試驗
市售乳酸發酵乳
儲存試驗
耐受性試驗 耐受性
試驗 益生質特性分析
抗氧化分析
Crude chitinase及Commercial cellulase
三、實驗材料
（一）菌株
Bifidobacterium breve BCRC 14601 Bifidobacterium longum BCRC 14602 Bifidobacterium adolescentis BCRC 14606 Enterobacterium aerogenes BCRC 10370 Enterobacterium cloacae BCRC 10401 Enterobacterium coli BCRC 10675 Trichoderma viride BCRC 32054
實驗菌株購自新竹食品工業發展研究所 生物資源保存及研究中心。
（二）培養基
MRS lactobacilli broth、Peptone、YE（BD，美國）；Nature broth ( NB )、
Tryptic soy agar ( TSA )（HIMEDIA，印度)；Agar powder（OXOID，
英國）；BSM、BSM 營養補充劑 ( Fluka，瑞士)；MacConkey broth
（Difco）。
（三）藥品
Acetic acid ( Fluka，瑞士)；L-cysteine hydrochloride、bile salts、hemin、
vitamin K、N-acteyl-D-glucosamine、2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl、
（DPPH）、Vit. C、tetramethylmurexide (TMM)（Sigma，美國）；
1-propanol (J.T.Baker ， 美 國 ) ； ammonia solution (25%) 、 sodium actetate、H2SO4、ethanol (99.8%) ( RDH，德國)；KH2PO4、hexamine、
potassium chloride、copper sulfate、ferric chloride、Na2HPO4、NaH2PO4、 FeSO4‧7H2O、potassium ferricyanide、trichloroacetic acid （TCA）；
N-acetyl-D-glucosamine （ NAG ） （ Merck ， 美 國 ） ； NaHCO3、 MgSO4.7H2O、NaCl、NaOH、Na2CO3、CaCl2、MgCl2.6H2O、glucose、
sucros、NaNO3（Yakuri，日本）。
（四）幾丁聚醣
去乙醯度80％、92％，購自應化企業有限公司，台灣。分子量約 300 kDa，聚合度約為 1850 DP。
（五）酵素
Cellulase（EC 3.2.1.4）：Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921，購自於 Sigma C2730。
四、實驗方法
（一） Trichoderma viride 誘發 chitinase 及保存（Chen and Lin, 2004）
由-80℃冰箱（Sanyo MOF-U2086S）凍管中取出 Trichoderma viride 100 μL 置於 PDA 培養基中央，於室溫下培養 7 天，以接種
環取孢子置於PDA 培養基中央再於室溫下培養 7 天（二代），用2 mL RO 洗下孢子，置入一培培養基，於室溫下培養 5 天，以紗布過濾，
取得菌絲體，用RO 將菌絲體表面糖分洗去置入二培培養基，於室溫
抽氣過濾（濾膜孔徑0.45 μm），再過 0.22 μm 膜，分裝成小量，置 於15 mL 離心管內置於-20℃冰箱中（Whirlpool，東穎惠而浦）保存。
Trichoderma viride 幾丁質酶誘發一培培養基（菌絲體放大培養
基）：glucose 40 g，sucrose 12 g，NaNO3 1.2 g，MgSO4‧7H2O 0.2 g，
KCl 0.2 g，FeSO4‧7H2O 0.004 g，K2HPO4 0.4 g，ddH2O 定量至 400 mL，pH 調至 7.2（pH Meter：Suntex SP-701 pH / mV / TEMP Meter）。
Trichoderma viride 幾丁質酶誘發二培培養基（酵素誘發培養
基）：colloidal chitin 6 g [1.5%（final）]，NaNO3 1.2 g，MgSO4‧7H2O 0.2 g，KCl 0.2 g，FeSO4‧7H2O 0.004 g，K2HPO4 0.4 g，ddH2O 定量
至400 ml，pH 調至 7.2。
（二）幾丁質水解物製備
1％ 幾丁聚醣溶於 acetic buffer（100 mM，pH=4）中，加入粗酵 素液20％（濃縮酵素液用量 1％）在 42℃水浴（Firstek Scientific B 201）
下作用24 hrs～168 hrs 取樣，以沸水浴煮 15 min 使酵素失活，冷卻 至室溫（重複最後兩個步驟3 次，以達無菌狀態）。
（三）幾丁聚醣水解物分子量之測定
使用黏度計 Brookfield HADV-Ⅱ＋（Programmable DV-Ⅱ＋
Viscometer），探頭為 H1 探頭，設定轉速為 100 rpm。於水解過程中，
每3、6、9、24、48、72、96、120、144、168 小時，取 400 mL 至燒
杯中，測其黏度（cp）變化，並以 Mark Houwink 方程式推估分子量。
Mark Houwink 方程式：
［η］= KMa K = 1.64 × 10-30 × DD14 a = -1.02 × 10-2 × DD + 1.82
（四）菌種活化、保存
將購自於食品工業研究所之菌株先擦拭玻璃外管後，在酒精燈上 加熱玻璃管頂端，待玻璃管頂端灼熱時立即以無菌水滴加在玻璃外 管，出現裂縫後以鑷子輕敲外管擊破玻璃，已滅過菌的鑷子取出隔熱 纖維紙、棉花塞，滴加0.3～0.5 mL MRS broth 於內管中使粉狀菌體 懸浮在培養基中，取300 μL 加至 MRS broth，培養於 37℃厭氣的環 境下24 小時。
在厭氣操作台（Anaerobic Chamber SHEL BACTRON 1.5）中將 B. breve（BCRC 14601）、B. longum（BCRC 14602）、B. adolescentis
（BCRC 14606）培養於含 0.05％ L-cysteine 的 MRS 中，於 37℃厭
氣環境下培養24 小時（氣體狀態為 5% H2、95% CO2)。E. aerogenes
（BCRC 10370）、E.cloacae（BCRC 10401）培養於 NB，30℃。E. coli
（BCRC 10675）培養在 NB、37℃的環境。
（五）幾丁聚醣水解物抗菌測試
Bifidobacteria（BCRC 14602, BCRC 14602, BCRC 14606）培養
於含0.05％ L-cysteine的MRS broth；Enterobacteria（BCRC 10370, BCRC 10401, BCRC 10675 ） 培 養 於 NB ， 由 -80℃ 冰 箱 （ Sanyo MOF-U2086S）取出凍管保存液，取50 μL置於培養基中活化兩代，
兩種菌種皆在37℃中培養（培養箱：Low-temp incubator LT1601），
Bifidobacteria置於厭氧培養缸（DON WHITLEY A0002）中，在84%
H2、16% CO2下培養（產氣包；Oxoid，英國）。
最低抑制濃度（Minimum inhibitory concentration；MIC）定義：
抑菌分子可將菌體限制在遲滯期(lag phase)至少 48 小時以上，所需要 的最低濃度。
抑制時間（Inhibitory time；IT）定義：
菌株生長在遲滯期（lag phase）狀態所延長之時間。
抑制時間＝實驗組菌株生長於 lag phase 之時間－控制組菌生長於 lag phase 之時間
（六）儲存試驗
購買三種市售優酪乳產品（A、B、C )分別加入去乙醯度 80％、
92％幾丁聚醣水解物 400 ppm，儲存於 4℃、35 天，定時進行取樣、
稀釋並塗抹於MRS Agar 計算菌數，觀察變化。
（七）益生質特性試驗
將 DD80-CHcel 幾丁聚醣水解物 2%添加於基礎培養基中，取代 培養基中的碳源，三株 Bifidobacteria 菌液取 20～50 μL 接種至培養 基37℃下在厭氧培養缸中厭氣培養，定時以 ELISA reader OD 590 nm
（BioLog E11010）觀察吸光值之變化。
進一步以 0.5％ NAG 與 1.5％Glucose 混合液取代基礎培養基中
進一步以 0.5％ NAG 與 1.5％Glucose 混合液取代基礎培養基中