國立宜蘭大學食品科學系（所）
Department of Food Science National Ilan University
碩士論文 Master Thesis
幾丁聚醣水解物對 Bifidobacteria 及
Enterobacteria 抗菌之研究及其互動之影響 The study of effects of chitosan hydrolysates
on the inhibition of and interaction between Bifidobacteria and Enterobacteria
指導教授： 林世斌 博士 Advisor ： Shih-Bin Lin , Ph. D.
研究生： 尹小曼 撰
Graduate Student : Hsiao-Man Yin
中華民國九十六年九月
摘要
益生乳酸菌與宿主營養的吸收，生理作用，藥物吸收，致癌物、
毒物的產生，老化，免疫作用，抵抗有害菌(病原菌)等息息相關。目 前 益 生 菌 中 廣 為 人 知 的 就 是 比 菲 德 氏 菌(Bifidobacterium) 。 Bifidobacterium 不易培養，生長環境較嚴苛，常與其他乳酸菌一起應
用於發酵乳品的製造，但是隨著保存時間的增加而逐漸死亡，造成品 管上的困難。近年來 chitin 及 chitosan 被發現具有抗菌功效，對於許 多病原菌皆有不錯的抑制效果，尤其是革蘭氏陰性菌。 本研究利用
兩 種 不 同 酵 素(Trichoderma viride crude enzyme 及 commercial cellulase)對去乙醯度 80％及 92％之幾丁聚醣(DD80、DD92)進行水解 得到幾丁聚醣水解物(DD80-CHtri、DD80-CHcel及 DD92-CHtri、 DD 92-CHcel)，並探討其對三株 Bifidobacterium 的抑制性，保護及益生作
用的效果。結果顯示 B. brevis、B. longum、B. aldolescens 不受上述兩 種幾丁聚醣水解物的抑制。DD80-CHtri 在 400 ppm 下無法抑制 E.
aerogenes、E. cloacae，在 100 ppm 下可抑制 E. coli，DD92-CHtri在 100 ppm 下可抑制上述三者，而 DD80-CHcel與 DD92-CHcel則無抑 制效果，以 DD92-CHtri 有較佳的抗菌效果。幾丁聚醣水解物添加於
市售產品中，發現儲存的 35 天期間內可有助於延緩商品中乳酸菌死
具有較佳的還原性外，其餘的水解物並不明顯。幾丁聚醣水解物 與 Enterobacteria
、
Bifidobacterium 共培養後發現，其不會對 Bifidoba- cterium 與 伺 機 腸 道 菌 造 成 毒 害 ， 在 適 當 比 例 添 加 下 可 幫 助Bifidobacterium 生長，不利於 Enterobacteria 增生，有助於改善腸道
菌相趨於健康。
關鍵字：比菲德氏菌、幾丁聚醣、幾丁聚醣水解物、腸桿菌、益生質
Abstract
The Lactic acid bacteria (LAB) probiotics influence host’s health, including the nutrient supplication, physiological functions, efficacy of antibiotic therapy, carcinogenic susceptibility, immune responses and aging, etc. Dietary modulation of the gut microflora by prebiotics is designed to improve health by stimulating numbers and activities of the bifidobacteria and lactobacilli. These bifidobacteria are usually used in combination with other desirable lactic acid bacteria in fermented milk products. These products may not exert probiotics effects because they gradually die during refrigeration and storage of products. Previous reports have indicated that chitosan has antibacterial effect against various pathogens. In this study, the hydrolysates prepared with crude chitinase (from Trichoderma viride) and commercial cellulase were tested for their inhibition, protection effect on three Bifidobacterium strains. The results revealed that B. brevis, B. longum and B. aldolescens could tolerate DD80-CHtri、DD80-CHcel及DD92-CHtri、DD92-CHcel. Four hundred ppm of DD80-CHtri couldn’t inhibit E. aerogenes and E.
cloacae, which could be inhibited by 100 ppm of DD92-CHtri. Besides E.
coli could be inhibited by 100 ppm of DD92-CHtri and DD80-CHtri. The addition of chitosan hydrolysate to commercial yoghurt product had beneficial effects on their survival in dairy products during 35 days storage. The effect seemed due to the reducing powers of chitosan hydrolysates. The result demonstrated that chitosan hydrolysates did not
ppm) did not influence Bifidobacterium and Enterobacteria in co-culture test. The chitosan hydrolysate combined the use of Bifidobacteria inhibit Enterobacteria in co-culture test and thus improved the microbial ecosystem in the human gut.
Keywords: Bifidobacterium ; Chitosan ; Chitosan hydrolysates ; Enterobacteria ; Prebiotics
目錄
中文摘要………I 英文摘要………..III 目錄………..V 表目錄………..XI 圖目錄……….XII
壹、前言………..1
貳、文獻整理………3
一、 腸道微生物與人體健康之關係………..3
（一） 腸道微生物對人體之影響……….…..3
（二） 腸道微生物組成……….………..4
（三） 益生菌……….………..8
1. 益生菌種類………....8
2. 益生菌應具備之條件………9
3. 益生菌安全性………...14
4. 益生菌生理功能 ………...14
（1） 維持腸道菌相平衡………...14
（2） 降低血膽固醇………...15
（4） 提高免疫力………...16
（5） 合成維生素 B、K………..…...16
（6） 促進鈣吸收………...16
（四） Bifidobacterium 特性………...20
1. 型態特性………...20
2. 培養特性………...20
3. 其他特性………...21
4. Bifidobacterium 代謝………....21
5. Bifidobacterium 生理功能………25
（1） 維持腸道菌相平衡……….…25
（2） 抗腫瘤活化免疫系統……….…25
（3） 降低血液中膽固醇……….…25
（4） 緩和乳糖不耐症……….……26
（5） 合成維生素 B 群……….……26
（6） 抗氧化……….27
6. Bifidobacterium 產品應用之限制………27
（1） Bifidobacterium 菌數計算之重要性………..27
（2） Bifidobacterium 在品質管制上之困難……..27
a. 定量………..27
b. 定性………..28
二、 益生質對人體的關係………29
（一） 益生質之條件………..29
（二） 益生質的結構………..30
（三） 益生質的種類………..30
（四） 益生的生理機能………..32
1. 促進益生菌生長………..32
2. 延長益生菌存活率………..33
3. 選擇性培養基………..33
4. synbiotic………....34
三、 幾丁質、幾丁聚醣與幾丁寡糖之關係……….35
（一） 幾丁質………..….……35
1. α-chitin………..…35
2. β-chitin………..…35
3. γ-chitin………...…35
（二） 幾丁聚醣………...…37
（三） 幾丁質水解物………..…..39
1. 結構……….39
2. 製備方式……….40
（2） 酵素法……….40
3. 生理功能………....40
（1）降低脂肪代謝………40
（2）抗腫瘤活性……….40
（3）提高免疫力……….41
（4）抗氧化……….41
（5）促進傷口癒合、凝血………41
（6）抗菌性……….41
4. 新型態益生質………...42
參、材料與方法………...43
一、研究方法及策略………..43
二、研究架構………..44
三、實驗材料………..45
（一）菌株………..44
（二）培養基………....44
（三）藥品………....44
（四）幾丁聚醣………..46
（五）酵素………....46
四、實驗方法……….46
（一）Trichoderma viride 誘發 chitinase 及保存………46
（二）幾丁質水解物製備………...47
（三）幾丁聚醣水解物分子量之測定………....47
（四）菌種活化、保存………...48
（五）幾丁聚醣水解物抗菌測試………...49
（六）儲存試驗………...50
（七）益生質特性試驗………...50
（八）抗氧化分析………...51
1. 清除 DPPH 自由基能力的測定...51
2. 還原力的測定………...51
3. 金屬螯合試驗 - 銅離子螯合………...51
（九）幾丁聚醣水解物與腸道菌共培養試驗...52
肆、結果與討論………...53
一、幾丁聚醣水解物之製備與分子量分佈...53
二、幾丁聚醣水解物抑菌測試………..54
（一）幾丁聚醣水解物對伺機菌之影響………..54
（二）幾丁聚醣水解物對 Bifidobacterium 之影響………..55
三、幾丁聚醣水解物儲存試驗………...56
五、幾丁聚醣水解物抗氧化性分析………..60
六、幾丁聚醣水解物對腸道菌叢之影響………...62
伍、結論………65
陸、參考文獻………..66
柒、表………..87
捌、圖………..92
玖、附錄………..101
表目錄
表一 益生菌種類………11
表二 應用於產品之常見益生菌菌株………12
表三 益生菌對人體之影響………18
表四 寡醣類益生質之結構………31
表五 幾丁聚醣水解物對 Enterobacteria 抑菌測試………...87
表六 幾丁聚醣水解物對 Bifidobacteria 抑菌測試………88
表七 Bifidobacterium 與 Enterobacteria 對 NAG 之利用能力………..89
表八 DD80 幾丁聚醣水解物對腸道菌互動之影響………..90
表九 DD92 幾丁聚醣水解物對腸道菌互動之影響………..91
圖目錄
圖一 腸道菌之分佈………5
圖二 腸道菌與年齡的關係………6
圖三 腸道微生物區分圖………7
圖四 益生菌菌種應具備條件………13
圖五 益生菌之評估篩選………17
圖六 益生菌健康功效………19
圖七 B. longum.之型態………...22
圖八 乳酸菌代謝途徑………23
圖九 Bifidobacteria 代謝途徑………24
圖十 chitin 結構式及單體………..36
圖十一 Chitin 的三種排列方式……….36
圖十二 Chitosan 結構式及單體………38
圖十三 幾丁聚醣經酵素水解後之產物及其分子量變化………92
圖十四 市售產品（A）添加 400 ppm 幾丁聚醣水解物後儲存於 4℃其 益生菌菌數之變化………93
圖十五 市售產品（B）添加 400 ppm 幾丁聚醣水解物後儲存於 4℃其 益生菌菌數之變化………94
圖十六 市售產品（C）添加 400 ppm 幾丁聚醣水解物後儲存於 4℃其 益生菌菌數之變化………95 圖十七 2％ DD80-CHcel 對 Bifidobacteria 生長之影響………..96 圖十八 NAG 對 Bifidobacteria 生長之影響………..97 圖十九 幾丁聚醣與幾丁聚醣水解物去除 DPPH 自由基之能力…….98 圖二十 幾丁聚醣與幾丁質水解物之銅離子螯合力………99 圖二十一 1％幾丁聚醣與幾丁質水解物之還原力………100
壹、前言
時代變遷人們對於食物的定義已經不同，不只是注重口腹之慾而 已，更希望食物具有促進健康的功效，因此保健食品油然而生，其中 又以體內環保之概念最為大眾所知。諾貝爾得獎者蘇俄科學家 Elie Metchnikoff (1907) 提出保加利亞人的長壽與其飲用的酸奶有關，認
為酸奶中微生物能抑制腸道腐敗菌的生長，減少毒害物質的生成，此 為益生菌理論(probiotic theory)之開端(丁，2000)。十九世紀初科學家 們發現腸道細菌菌叢會影響宿主的健康，紛紛投入這個領域進行研 究，近年來發現包括營養的吸收，生理作用，藥物吸收，致癌物、毒 物的產生，老化，免疫作用，抵抗有害菌（病原菌），以及各種壓力 等 (Wilhelm et al., 1998 ) 。另外調查中發現日本長壽村長壽者的糞 便菌群在Bifidobacterium 菌數比都市中的老人高出很多，因此更確立 了腸內細菌對健康之影響。近年來 chitin 及 chitosan 因為用途廣泛而 引起注意，尤其在醫藥領域中發現具有抗菌功效，對於許多病原菌皆 有不錯的抑制效果。
本研究藉由具有抑菌活性之幾丁聚醣水解物篩選不受幾丁聚醣 水解物影響之乳酸菌，並找出能抑制但不傷害到一般腸道菌之幾丁聚 醣水解物最佳濃度。調配幾丁聚醣水解物與乳酸菌最適的條件比例，
觀察幾丁聚醣水解物對腸道菌抗菌活性之研究及腸道菌互動之影響
以開發幾丁聚醣與益生菌之複合配方，可使益生菌成為腸道優勢菌 株，藉以改善腸道菌相，促進人體腸道健康之保健食品。
貳、文獻回顧
一、 腸道微生物與人體健康之關係
（一） 腸道微生物對人體之影響
人體腸道微生物複雜多變，且參與人體許多生化反應，可以幫助 宿主加強養分吸收。一個正常人的腸道中至少有 400 多種細菌存在，
其中有99％主要是絕對厭氣菌（Moore et al., 1974；黃，1992；程，
2000；Guarner et al., 2003）。人體消化道中每段區域所含的菌種及菌
量都不相同，在胃中因為胃酸的緣故細菌不容易生長，因此菌量約在 103 CFU/g 以下，進入小腸後 pH 值逐漸升高菌數可達 107 CFU/g 以
上，而大腸則是細菌主要的聚集處，菌相最複雜且菌量可達1012 CFU/g 以上(Wilhelm et al., 1998；丁，2000；Steer et al., 2000；Fooks et al., 2002；黃，2004)。目前有 50 屬超過 400 種的菌株被分離出來，龐大
的細菌在腸道中形成一個生態系統，彼此以共生、拮抗、互惠等關係 維持生長並達到菌叢間穩定的生態平衡(圖一) (Wilhelm et al., 1998 )。
胎兒在出生前是完全無菌的狀態，腸道微生物的形成主要是母親 在分娩時，胎兒通過產道的過程中，與一些兼性厭氣菌和好氣菌接 觸，最後與分娩環境中的細菌接觸，經由皮膚、呼吸道、消化道、泌 尿生殖系統等進入體內生長增殖。
新生兒初生若以母乳哺育，則 Bifidobacteria 會成為腸道中優勢
菌種，離乳後的幼兒腸道菌相會趨近於成人的腸道菌相組成，隨著年 齡 及 飲 食 習 慣 的 改 變 ，Bifidobacteria 逐 漸 減 少 ， 其 他 有 害 菌 如 Clostridum perfringens、E. coli 及 Streptococcus 等迅速增加(黃，1992；
Kunz and Rudloff, 2006)（圖二）。當細菌的數量增加到某一程度時會
導致細菌個體間所得到養分相對減少，微生物菌相組成便會發生改 變，複雜性也隨之增加( Rotimi et al., 1981)。除此之外，人體腸道中 的菌相亦會受到宿主的壓力、生理狀況、老化、藥物服用、抗生素…
等等的影響而改變，進而影響人體健康。當宿主受到壓力時，潛在腸 內存在的少量病原性微生物會大量增生引起疾病。
（二） 腸道微生物組成
一般可將腸道菌叢區分為三種，有益菌、有害菌及伺機菌，有益 菌主要以Lactobacilli、Bifidobacteria 為主，有害菌則是 Staphylcocci、
Clostridia，而伺機菌則是 Enterobacteria 與 E. coli，在正常的情形下
不不會對人體造成影響，當宿主處於壓力的環境時，腸內菌叢失去平 衡，此類細菌便會開始大量增生，轉變成有害菌，其所產生的代謝產 物如短鏈脂肪酸及含氮廢物等，會對人體造成不良的傷害（圖三）
(Walker et al., 1998；Ziemer and Gibson, 1998；Hooper et al., 2002；
Dethlefsen et al., 2006)。
圖一 腸道菌之分佈
Fig 1 Microbial colonization of the human gastro-intestinal tract.
(Wilhelm et al., 1998 )
圖二 腸道菌與年齡的關係
Fig 2 The intestinal flora and its relation to the age.
(黃，1992)
圖三 腸道微生物區分圖
Fig 3 Dichotomy of microflira based on potentially toxic or beneficial properties.
(Walker et al., 1998)
（三） 益生菌（probiotics）
早在十九世紀初科學家們發現腸道細菌菌叢會影響宿主的健 康，科學家們紛紛投入這個領域進行研究，近年來發現包括營養的吸 收，生理作用，藥物吸收，致癌物、毒物的產生，老化，免疫作用，
抵抗有害菌（病原菌），以及各種壓力等，都與腸道細菌有關，便逐 漸形成益生菌（probiotics）之觀念（王，2000；Steer et al., 2000；Bielecka et al., 2002；Bomba et al., 2002；Mattila-Sandholm et al., 2002；
Krasaekoopt et al., 2003）。
過去對於一些腸道細菌的疾病常以抗生素作為治療之策，長時間 下來已逐漸有抗藥性問題產生，若使用益生菌替代抗生素治療來維持 腸道健康，可減少服用抗生素的不適並可降低細菌抗藥性問題產生，
因此益生菌觀念日趨重要（Fuller, 1989；Stanton et al., 2001；吳, 2003；Finegold et al., 2004；Fang et al., 2006）。
益生菌（probiotics）的定義為，凡應用至人類或其他動物，藉由
改善內生微生物菌相，有益於宿主的活菌，不論是單一或混合菌株均 可視為益生菌（Ziemer and Gibson, 1998）。
1. 益生菌種類
益生菌主要包含Bifidobacterium、Lactobacillus 以及 Enterococcus
目 前 主 要 應 用 在 產 品 上 的 益 生 菌 可 分 為 四 大 類 ： 乳 酸 菌 屬 (Lactobacillus species)、比菲德氏菌屬(Bifidobacterium species)、其他
乳酸菌屬以及非乳酸菌屬，其中乳酸菌屬與比菲德氏菌屬主要應用在 食品方面，而非乳酸菌屬則應用在藥製品上(表二) (Wilhelm et al., 1998 ) 。
2. 益生菌應具備之條件
以健康和臨床方面為考量 probiotics 所需具備的條件包括：人類 來源、對酸及膽鹽具有抗性、可吸附於人體腸細胞、可於人類消化道 上定殖、需可產生抗菌物質、對於致癌物質及病原菌具有拮抗作用、
人類攝食後，對人體需具有安全性、需經臨床證實具有健康效用( Lee and Salminen, 1995)。
以穩定性及加工技術方面為考量probiotics 需具備的條件：
經加工處理過程後仍須維持其存活能力、經發酵後需維持其優良風味 及氣味、於儲藏期間維持產品溫和酸度之能力、加工及儲存期間仍須 維持其定殖能力、於發酵產品中具有優良儲存穩定性、經乾燥方法處 理後仍具有穩定性、使用前先進行實驗，取得有效劑量。
能夠符合上述條件之菌株並不多，故目前益生菌之使用首重安 全，其次應注重其在加工運輸過程中之穩定性。而 Saarela 等(2000) 認為有效的益生菌應符合下列條件：菌株本身專一性、pH 的耐受性、
良好的腸道吸附能力、相較於腸道病原菌有較佳的競爭能力、增強宿 主的免疫系統、菌株的穩定性、氧氣耐受性較優良、消費者接受性、
具有較佳之健康功效(Sarrela et al., 2000)。
表一、益生菌種類
Table 1. Classification of probiotic organisms
(Salminen et al., 1998)
Organism Infection potential
Lactobacillus
Mainly non-pathogens, some opportunistic infections (usually in immunocompromised patients)Lactococcus
Mainly non-pathogensLeuconostoc
Mainly non-pathogens, some isolated cases of infectionStreptococcus
Oral streptococci mainly non-pathogens (includingStreptococcus thermophilus); some may cause
opportunistic infections
Enterococcus
Some strains are opportunistic pathogens with haemolytic activity and antibiotic resistanceBifidobacterium
Mainly non-pathogens, some isolated cases of human infectionSaccharomyces
Mainly non-pathogens, some isolated cases of human infection表二、應用於產品之常見益生菌菌株 Table 2. Probiotics applied in products
Lactobacillus species Bifidobacterium species Other LAB
Non-lacticsL. acidophilus B. adolescentis Ent. faecalis Bacillus cereus (toyoi)
L. casei B. animalis Ent. faecium Escherichia coli (Nissle 1917)
L. crispatus B. bifidum Lactoc. lactis Propionibacterium freudenreichii
L. gallinarum B. breve Leuc. mesenteroides Saccharomyces cerevisiae
L. gasseri B. infantis Ped. acidilactici
(boulardii)L. johnsonii B. lactis Sporolactobacillus inulinus (L. paracasei) B. longum Strep. thermophilus
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
(Wilhelm et al., 1998 )
圖四、益生菌菌種應具備條件
Fig 4. The theoretical basis for selection of probiotic microorganisms.
（Saarela et al., 2000）
3. 益生菌安全性
早在千年前人類即開始食用發酵製品，乳酸菌長久以來廣泛應用 在乳品、蔬菜、醃漬物、麵包、穀類以及肉製品上。因此認定發酵用 乳酸菌為一般公認安全菌株( generally recognized as safe，GRAS )，在 食用上並無安全問題的限制。
益生菌對人體有許多健康功效，將益生菌添加在食品中已行之有 年，尤其是發酵乳品，飲用後藉以達到促進人體健康之效，目前還是 希望能發現更多具有活性的益生菌，Salminen 等(1998)提出一個評估
益生菌安全性之流程（圖五），受試菌針對菌株特性、腸道吸附性、
pH、胃酸、膽鹽的耐受性等，進行一連串的評估。
4. 益生菌生理功能
益生菌主要有維持腸道菌相平衡、降低血膽固醇、減緩乳糖不耐 症、提高免疫力、合成維生素B、K…..等生理功能(表三、圖六) (Ziemer and Gibson, 1998；賴，2000；Lourens-Hattingh and Viljoen, 2001；Saarela et al., 2002；許等，2003)。
（1） 維持腸道菌相平衡
益生菌在腸道中的吸附能力與吸附位置會與病原菌、伺機菌競 爭，此外益生菌產生的代謝物質包含過氧化氫（H2O2）、聯乙醯、細
Grattepanche et al., 2007）以及有機酸（Bearson et al., 1997；Bielecka et al., 2002； Carvalho et al., 2006；Vizoso Pinto et al., 2006）等等，皆
有抑制病原菌的效果，因而有維持腸道菌相平衡的作用（Ziemer and Gibson, 1998；Ouwehand et al., 1999； Saarela et al., 2000； Steer et al., 2000；Messens and Vuyst, 2002；Reid and Burton, 2002；Gill, 2003；
Krasaekoopt et al., 2003； Manning et al., 2004；Rastall, 2004；Hutt et al., 2006；Matijasic et al., 2007）。
（2） 降低血膽固醇
益 生 菌 在 代 謝 的 過 程 中 產 生 之 乳 酸 與 醋 酸 ， 能 夠 抑 制 Hydroxymethyglutaric-CoA reductase 的活性，因而抑制膽固醇的合成
（Homma, 1998），此外乳酸菌菌體具有吸附膽固醇的能力，可以使 膽固醇不容易被吸收（Tannock, 2001；Xiao et al., 2003），減少罹患 心血管疾病的風險。
（3） 減緩乳醣不耐症
乳醣不耐症（lactose intolerance）主要是缺少分解乳醣的酵素β- 半乳醣苷酶（β-galactosidase），導致乳醣在腸道中堆積，腸道為了 維持滲透壓平衡，吸入過多的水分而造成腹瀉。益生菌多含有β-半 乳醣苷酶（β-galactosidase）能幫助代謝牛乳中的乳醣，減緩乳糖不 耐症的產生（Ouwehand and Salminen, 1998；Ziemer and Gibson, 1998；
Bielecka et al., 2002；Krasaekoopt et al., 2003）。
（4） 提高免疫力
益生菌可以活化腸道內的巨噬細胞及淋巴細胞，使免疫球蛋白 A
（IgA）濃度，增加人體的免疫力（Holzapfel et al., 1998；Ouwehand and Salminen, 1998；Ziemer and Gibson, 1998；Cebra, 1999；Bielecka et al., 2002；Shu and Gill, 2002；Krasaekoopt et al., 2003）。
（5） 合成維生素 B、K
腸道中乳酸菌可合成維生素 B、K，在發酵過後將大分子分解為
小分子，可提高游離氨基酸含量（Sanders et al., 1996）。
（6） 促進鈣吸收
益生菌在代謝過程中會產生有機酸，可促使牛乳中的不溶性鈣鹽 轉變成乳酸鈣，讓人體容易吸收，可預防一些骨質疏鬆的情況產生
（Ziemer and Gibson, 1998）。
圖五、益生菌之評估篩選
Fig 5. Selection criteria for probiotics.
（Salminen et al., 1998）
表三、益生菌對人體之影響
Table 3. Reported effects of probiotic bacterial species
Reported effects Species
Stimulation of immune system
Lactobacillus acidophilus , L. casei , L. plantarum , L. delbruckii, L. rhamnosus
Balancing of intestinal microfloraL. acidophilus , L. casei , Bifidobacterium bifidum
Reduced faecal enzymes
L. acidophilus , L. casei , L. gasseri, L. delbruckii
Antitumor
L. acidophilus , L. casei , L. gasseri, L. delbruckii, L. plantarum, B. infantis , B. adolescentis , B. bifidum , B. longum
Prevention of travellers diarrhoea
Saccharomyces bulgaricus , mixture of L. acidophilus , B. bifidum , Streptococcus thermophilus , L. bulgaricus
Prevention of rotavirus diarrhoea
L. rhamnosus , B. bifidum
Prevention of C. difficile diarrhoeaL. rhamnosus , S. bulgaricus
Prevention of other diarrhoea
L. acidophilus , L. rhamnosus , B. bifidum
（Ziemer and Gibson, 1998）
圖六、益生菌健康功效
Fig 6. Proposed health benefits stemming from probiotic consumption.
（Saarela et al., 2002）
（四） Bifidobacterium
益生菌已證實對人體健康有許多益處，其中又以Bifidobacterium 最為重要，約有 11 種 Bifidobacterium 存在於人類中，包括口腔、胃 腸消化道中，主要有B. infantis、B. breve、B. longum、B. adolescentis、
B. bifidum（楊等，1998；Mitsuoka, 1990），以下介紹 Bifidobacterium
的一些基本特性。
1. 型態特性
Bifidobacterium 是 革 蘭 氏 陽 性 菌 （ Gram-positive ） ， 不 產 孢
（nonsporing），不具有運動性(nonmobile)，在顯微鏡下型態主要成 桿狀、棒狀、彎曲狀、Ｖ或Ｙ字形，Bifidobacterium 之型態會隨著培 養環境的變化而有不同的型態（蔡，1998；Lapierre et al., 1992；李，
2000；Sun and Griffiths, 2000）（圖七）。
2. 培養特性
Bifidobacterium 生長溫度範圍在 25~45℃，最適培養溫度主要是
37~41℃；其生長 pH 範圍在 4.5~8.5，最適則在 pH 6.5~7.0 左右；
Bifidobacterium 屬於厭氧菌，在培養的時候需製造厭氧的環境，對於
氧氣的耐受性會隨species 不同而有異。
3. 其他特性
Bifidobacterium 觸 酶 反 應 呈 陰 性 （ catalase-negative ） ；
Bifidobacterium 含有 galactosidase 與 glucosidase 酵素，Bifidobacterium
因為此兩種酵素，而能利用果寡醣類當作碳源生長 (黃, 1992)。在醣 類代謝過程中以醋酸及乳酸為主要的代謝產物。
4. Bifidobacterium 的代謝
乳酸菌發酵一般可分為兩種，同型發酵（homoferment）與異型 發酵（heteroferment），同型發酵只會產生一種代謝物質，即為乳酸；
異 型 發 酵 會 代 謝 產 生 醋 酸 、 酒 精 與 二 氧 化 碳 等 等 （ 圖 八 ） 。 Bifidobacterium 屬於異質發酵菌株，但因 Bifidobacterium 缺少磷酸果
糖激酶（phosphofructose kinase）不能進行 EMP 醣類代謝，因而有獨 特的代謝途徑，稱為Bifido shunt（圖九）（Ostlie et al., 2003），其 產物為醋酸及乳酸，比例為3：2，不會產生酒精與二氧化碳。
圖七、B. longum 之型態
Fig 7. Photographs showing the morphological of B. longum.
(http://sci.agr.ca/crda/indust/microscope_e.htm)
圖八、乳酸菌代謝途徑
Fig 8. Generalized scheme for the fermentation of glucose in lactic acid bacteria.
（Caplice and Fitzgerald, 1999）
圖九、Bifidobacteria 代謝途徑
Fig 9. Schematic diagram of bifidobacterial sugar metabolism.
1,Enzymes of the bifidobacterial fructose-6-phosphate shunt; 2, pyruvate kinase (pyk); 3, lactate dehydrogenase (ldh); 4, pyruvate formate lyase (pfl); 5, phosphotransacetylase (pta) and acetate kinase (ack); 6, acetaldehyde dehydrogenase (adh) and alcohol dehydrogenase (adh); 7, phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc); 8, malate dehydrogenase (coding sequence not found in either B.
longum genome); 9, fumarase (coding sequence not found in either B. longum genome); 10, succinate dehydrogenase (sdh). The values in boxes are the percentages of conversion of acetyl-CoA.
5. Bifidobacterium 生理功能
（1） 維持腸道菌相平衡
Bifidobacterium 生長時會與腸道中其他的病原菌、伺機菌競爭營
養源與腸黏膜上的定殖位置，抑制病原菌藉以維持腸道菌相平衡。另 外 Bifidobacterium 發酵醣類後會產生乳酸、醋酸，降低腸道中的 pH 值，不利於病原菌的生長。另外也會產生具有殺菌效果的細菌素等物 質（Ibrahim et al., 1993；Arunachalam, 1999；Bevilacqua et al., 2003；
Toure et al., 2003；Kheadr et al., 2004；Collado et al., 2005；Makras and Vuyst, 2006；Nieto-Lozano et al., 2006）。
（2） 抗腫瘤活化免疫系統
腸 道 中 的 酵 素 會 將 一 些 致 癌 的 前 趨 物 質 轉 換 為 致 癌 物 ， 如 nitrosamine，而 Bifidobacterium 已被證實可以減少這些酵素的活性，
降低罹患癌症的機率（Arunachalam, 1999；邱，2004）。腸道中的 Bifidobacterium 細胞壁含有一些抗原可以刺激免疫系統，增加巨噬細
胞活性，強化免疫球蛋白 A（Ig A）的濃度，以抵抗病原菌，提升免 疫力（Fukushima et al., 1998；Collins et al, 1998）。
（3） 降低血液中膽固醇
人體內的膽酸（bile acid）與牛磺酸（taurine）及甘胺酸（glycine）
結合成為結合型的膽鹽，而未與其結合者稱為未結合型膽鹽，當環境
pＨ小於 6 時，未結合型膽鹽會與膽固醇沈澱排出體外，許多 Bifidobacterium 皆具備將膽鹽去結合化的作用，可降低膽固醇含量
（Tahri et al., 1996；Smet et al., 1998；Chung et al., 1999；Tanaka et al., 1999），減少罹患心血管疾病的風險。
（4） 緩和乳糖不耐症
乳醣不耐症主要是腸道內缺乏乳醣酶（lactase），無法被分解的
乳醣進入大腸後被微生物發酵代謝，產生的二氧化碳與短鏈脂肪酸會 改變腸道滲透壓，導致腹部脹氣、腹瀉，Bifidobacterium 因為含有β -半乳醣苷酶（β-galactosidase）可將乳醣分解為葡萄糖及半乳糖，供 人體吸收利用，Bifidobacterium 在乳品中可將乳醣先進行發酵，分解 成小分子，這可改善乳醣不耐症者不能飲用乳品的問題（Jiang et al., 1996.）。
（5） 合成維生素 B 群
人體無法自行合成維生素B 群，主要是由腸道中的微生物合成，
人體再吸收利用，研究指出 Bifidobacterium 會合成維生素Ｂ1、維生 素Ｂ2、維生素Ｂ6、維生素Ｂ12、維生素 C、葉酸、菸鹼酸、維生素 Ｈ等等（Denter and Bisping, 1994；Fukushima et al., 1998）。
（6）抗氧化力
Bifidobacterium 具有螯合二價鐵離子之能力，亦可阻止三價鐵離
子氧化沈澱（賴，1999）。
6. Bifidobacterium 產品應用之限制
（1）Bifidobacterium 菌數計算之重要性
Bifidobacterium 是益生菌，目前發現對人體有許多生理功能，因
此常添加於市售發酵乳品中，所以產品中含有的Bifidobacterium 菌數 是 相 當 重 要 的 ， 此 不 僅 會 影 響 產 品 的 品 質 也 會 影 響 產 品 的 價 格
（Sanders, 1998）。但是 Bifidobacterium 是厭氧菌，對培養時環境含
氧量的改變有相當大的敏感性，在產品儲存期間亦容易死亡，存活率 會逐漸降低，所以在培養計算菌數時容易造成計算誤差 (Shah et al., 1995；Dave and Shah, 1997；Krasaekoopt et al., 2006；Matto et al., 2006；Cristina et al., 2007；Donkor et al., 2007)。
（2）Bifidobacterium 菌屬在品質管制上困難 在品質管制上主要分為兩種：
a 定量
Bifidobacterium 是厭氧菌，對培養環境的變化相當敏感，尤其會
隨著儲存時間的增長而逐漸死亡，因此不易培養計數，所以了解產品 中菌數回收率及存活率上有一定的困難。
b 定性
產品單獨以Bifidobacterium 進行發酵時風味不佳，故在發酵的過 程 中 常 常 是 在 發 酵 末 期 或 是 發 酵 完 成 後 才 將 具 機 能 性 之 Bifidobacterium 添加，尤其 Bifidobacterium 與其他乳酸菌的特性相
似，因此，如何在培養的同時將Bifidobacterium 與其他乳酸菌區隔開 來亦有難度（Dave and Shah, 1996；Pacher and Kneifel, 1996；Vinderola and Reinheimer, 1999；Vinderola and Reinheimer, 2000；Roy, 2001；
Hadadji et al., 2005）。
二、 益生質（prebiotics）對人體的關係
隨著益生菌的觀念日益加深，益生質的觀念亦逐漸受到重視。在 食物原料中有些物質會因為化學結構、鍵結方式，無法被人體的消化 酵素分解、吸收而進入大腸，人體無法吸收的碳水化合物如抗性澱 粉、膳食纖維、寡醣….等，這些統稱為結腸性食物（colonic food）。
結腸性食物進入大腸後能同時促進腸道中各種不同的微生物生長、代 謝；但益生質是僅能被腸道中的益生菌利用，故稱作結腸性食物的雖 多，但被定義為益生質卻在少數，其中就以寡醣類居多。
益生質（prebiotics）的定義為，凡在腸胃到無法被消化吸收的食
物原料，在大腸中能被益生菌選擇性發酵，藉以改善腸道菌相促進宿 主的健康（Gibson and Roberffroid, 1995；Van Loo et al., 1999；Kaplan and Hutkins, 2000；Schrezenmeir and de Vrese, 2001）。
（一） 益生質的條件
成為益生質的條件需符合：
1. 在腸胃道中不能被水解或吸收 2. 在腸道中能被選擇性發酵
3. 改變腸道中菌相趨於健康良好的組成 4. 能誘發宿主的免疫反應
（二） 益生質之結構
益生質必須在腸胃道中不會被水解吸收，寡醣類益生質如果寡 醣、半乳寡醣、異麥芽寡醣等，都是以β-醣苷鍵來鍵結，而人體消 化道中的醣解酵素主要是α型，因此這些寡醣類益生質無法被腸胃道 的消化酵素水解（Barreteau et al., 2006；Mussatto and Mancilha, 2007）。
（三） 益生質的種類
許多學者發現益生質對益生菌的生長及生理都有很多助益，常見
的 益 生 質 包 括 fructo-oligosaccharides 、 gluco-oligosaccharides 、 galacto-oligosaccharides 、 transgalacto-oligosaccharides 、 isomalto- oligosaccharides、xylo- oligosaccharides（Moura et al., 2007）、soybean- oligosaccharides （陳，1992；譚，1999；Matteuzzi et al., 2004；
Tomomatsu, 1994；Huebner et al., 2007；Kukkonen et al., 2007）、
Raffinose (Gopal et al., 2001 ； Gulewicz et al., 2002 ； Martinez- Villaluenga and Gomez, 2007；Crittenden and Playne, 2002；Jaskari et al., 1998)、Alginate oligosaccharides（Wang et al., 2006）
表四、寡醣類益生質之結構
Table 4. Non-dugestible oligosaccharides with bifidogenic functions commercially available.
（Mussatto and Mancilha, 2007）
（四） 益生質的生理機能 1. 促進益生菌生長
文獻中比較常見乳酸菌與腸道病原菌對於各種醣類之利用，結果 顯示乳酸菌對於醣類的利用率明顯比腸內病原菌來的好，尤其以 Coistidium jejuni 對各種醣類的利用率極低，幾乎不能利用 (Fooks et al., 2002；Mikkelsen and Jensen, 2004；Vulevic et al., 2004；Mountzouris
et al., 2006) 。為了探討益生質對益生菌抑制病原菌的功效是否有幫 助，將益生菌B. bifidium Bb12 與腸道病原菌在不同碳源下混合培養，
發現不同的益生質皆能促進益生菌的生長提高菌量，對於三株腸道病 原菌都能抑制其生長，其中以 Clostidium jejuni 的抑制最為顯著 (Fooks et al., 2002；Montesi et al., 2005) 。
由於益生質對益生菌選擇性發酵的特性。研究中以各種不同醣類 取代培養基中的醣類物質，觀察益生質對乳酸菌生長之影響。以乳醣 作為控制組，實驗組中個別加入果寡醣（FOS）與 oligo-fructose（OF）
作為碳源，其兩者主要為聚合度與純度上的差異，發現，FOS、OF 對B. longum
、
B. animalis、B. catenulatum 有明顯幫助生長的現象，可提高1.1-5.2 倍的菌量 (Bielecka. et al., 2002)。
2. 延長益生菌存活率
近年來體內環保的觀念被大眾重視，市售發酵乳品中常添加對人 體有益的益生菌，但是由於乳酸桿菌與 Bifidobacterium 是厭氣菌，所 以隨著儲存時間的增加，發酵乳品中的益生菌量會逐漸降低的現象 (Shan et al., 1995)。因此學者就利用益生質的觀念，將益生質添加在 乳品中，希望能改善益生菌菌量的問題（Alander et al., 2001；Capela et al., 2006）。Martínez-Villaluenga 等人選用常添加在乳品中的益生
菌L. acid- ophilus 與 B. lactis Bb-12，在乳品中添加 raffinose 寡糖類 後，每週觀察一次菌數，共觀察3 週，由表 5 發現添加寡醣，在 4℃
儲存3 週後可以延緩乳酸菌降低一個 log (Martínez-Villaluenga et al., 2006)。
3. 選擇性培養基
Bifidobacterium 在乳品中常常是額外添加的機能性乳酸菌，會混
合其他發酵用的乳酸菌菌酛，因此如何準確的計算出具有機能性的 Bifidobacterium 顯得非常重要，常會利用選擇性培養基來做定性與定
量。選擇性培養基主要是讓目標菌株生長，而會抑制其他非目標菌株 的微生物生長。以往Bifidobacterium 與一般乳酸菌比較起來對抗生素 有較高的耐受性，因此常常添加抗生素於培養基中作為選擇性培養基
（Kim et al., 1995；Yazid et al., 2000；Moubareck et al., 2005）。但是
因為每種菌株對於抗生素的耐受性皆不相同，且容易引起抗藥性的問 題，因此利用抗生素作為選擇性培養基的風險較大。學者發現添加 raffinose 寡糖類於培養基時，因為其他菌無法利用這種碳源，因此無
法生長，對於Bifidobacterium 則是良好的碳源，對其生長無礙，可以 有效將菌區分開而有較佳的選擇性(Hartemink et al., 1996)。
4. Synbiotics
Synbiotics 為益生菌與益生質相加乘後之名稱，益生菌與益生質 對人體皆有益處，當兩者共用時具有加乘的功效，許多研究發現益生 質在體內或體外試驗中皆有促進益生菌生長的效果，更可提高益生菌 的生理功能（Brown et al., 1998；Collins et al., 1999； Asahara et al., 2001；Crittenden et al., 2002；Bielecka et al., 2002；Charalampopoulos et al., 2002；Tuohy et al., 2003；Rastall et al., 2005；Bruzzese et al.,
2006；Geier et al., 2007）。
一、 幾丁質、幾丁聚醣與幾丁寡糖之關係
（一） 幾丁質（Chitin）
Chitin （圖十）在自然界中的含量相當豐富，存在於許多甲殼動 物的外殼與真菌類的細胞壁中，為β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine 的直 鏈聚合物，在自然界中的含量僅次於纖維素，也是地球上除蛋白質外 數量最大的含氮天然有機化合物。自然界中存在的chitin 具有三種不 同型態，分別為α、β 與 γ-chitin，如圖十一所示。
1. α-chitin
α-chitin 為斜方晶系（rhombic），分子鏈排列為逆向平行排列
（antiparallel packing），因為這樣的排列分子間的氫鍵較多，結構緊 密，因此 α-chitin 的分子結構最穩定，大部分的昆蟲或蝦、蟹等甲殼 類的外殼皆為α-chitin（Wood and Kellogg, 1988）。
2. β-chitin
β-chitin 為單斜晶系（monoclinic），分子鏈的排列為平行排列
（parallel packing），這樣的排列導致分子間的氫鍵較少，因此結構
較為鬆散，烏賊及尖鎖管的軟骨和鬚腕動物的軟管則為 β-chitin
（Wood and Kellogg, 1988）。
3. γ-chitin
γ-chitin 的分子鏈排列則為 α-chitin 及 β-chitin 的混合，主要存在於 藻類和真菌類中（Wood and Kellogg, 1988）。
圖十、chitin 結構式及單體 Fig 10. Structure of chitin.
(Kumar, 2000)
圖十一、Chitin 的三種排列方式
Fig 11. Arrangement of the chain in chitin.
(Wood and Kellogg, 1988)
（二）幾丁聚醣（chitosan）
chitin 經高溫及強鹼的作用進行去乙醯化（deacetylation）作用，
將部分或全部的乙醯基轉變成胺基，即為幾丁聚醣，其去乙醯基程度 由 65% 至 99% 不 等 ， 一 般 以 70~90% 最 常 見 。 幾 丁 聚 醣 為 β-1,4-D-glucosamine 的直鏈聚合物（圖 12），其鏈上的胺基（-NH2），
在酸中會呈現（-NH3+），使其成為帶有正電荷，因此 chitosan 具有
溶於酸性或弱酸性的有機酸及無機酸的特點，故 chitosan 的溶解度較 chitin 為佳，大部分以 5%的醋酸（acetic acid）當溶劑。經酸性溶劑 溶解後具有弱鹼性的陽離子電解質（cationic polyelectrolyte）特性，
且具有胺基（amino group）與氫氧基（hydroxyl group），利於化學 製備各種衍生化合物。通常可將其製成膠狀、纖維狀、珠狀、薄膜狀 及海綿狀等，以提供各種應用，常應用在污泥處理、食品加工與螯合 金屬離子等，但近年來正逐漸趨向於高價值的商品，例如化妝品、殺 菌劑、攜帶藥物者、食品添加物及健康食品….等等。例如利用低分
子量的 chitosan 做成 nanoparticles，攜帶破傷風類毒素（Tetanus toxoid），注入小鼠中，對於提高並維持較長時間的免疫反應有顯著 的效果（Vila et al., 2004）。
圖十二、Chitosan 結構式及單體 Fig 12. Structure of chitosan.
(Kumar, 2000)
（三）幾丁質水解物（Chitooligosaccharides；COS）
1. 結構
由於 chitin 及 chitosan 水溶性差，也因此人們就試著製造出能夠 溶於水中，並且具備其生理活性的 chitooligosaccharides。幾丁質水解 物一般可分為N-乙醯幾丁寡醣（N-acetyl-chitooligosaccharides）與幾 丁寡醣(chito-oligosaccharides)，N-乙醯幾丁寡醣由 2-10 個的 N-乙醯 葡萄糖胺形成的；而幾丁寡醣是以葡萄糖胺為單體形成的醣類。幾丁 質水解物可溶於水，在食品方面仍具有多醣的特性，如保水、吸濕及 抗菌等，在農業、醫學、食品領域上擁有高度價值。如用酵素粗萃取 液（crude enzyme：cellulase from Trichoderma viride 和 Acremonium cellulolyticus 、 lipase 、 hemicellulase 、 pectinase ） 所 製 造 的
N-acetyl-D-glucosamine，其可提高關節滑液的黏性、改善軟骨的代謝
與 增 強 肌 關 節 的 活 動 功 能 ， 故 有 利 於 受 損 關 節 軟 骨 的 修 復 治 療
（Sashiwa et al., 2003）。
2. 製備方式
（1） 化學法
化學法可使用強酸或強鹼兩種進行，但是化學方法常因為酸、
鹼液的種類、濃度、作用時間而有影響，再現性不佳，且使用的酸、
鹼液也容易造成環境污染，因此雖然使用化學法製備幾丁聚醣水解物 的成本較低，但目前更傾向於利用酵素法來進行水解。
（2） 酵素法
使用酵素法雖然成本高（Qin et al., 2004），但是毒性低（Ilyina et al., 2000），能以少量的酵素就可以得到較高的產率，目前較常被使
用的酵素為chitinase、chitosanase、celluase、lyzozyme 及 glycosidase 等。
3. 生理功能
幾丁質、幾丁聚醣、幾丁質水解物被廣泛應用在農業、生醫及食 品領域（Shahidi et al., 1999），以下介紹其幾個重要生理活性：
（1）降低脂肪代謝
幾丁聚醣本身的正電荷會與帶負電的脂肪結合，形成膠狀物質，因此 阻斷脂肪被小腸吸收代謝（Deuchi et al., 1994；Ormrod et al., 1998）。
（2）抗腫瘤活性
瘤細胞外圍形成一個膜，導致腫瘤細胞生長受到限制（Saiki et al., 1990；Tsukada et al., 1990）
（3）提高免疫力
幾丁質類物質能夠促進免疫球蛋白的活性，誘發巨噬細胞，有助 於增強免疫系統（Meada et al., 1992；Shibata et al., 1997）
（4）抗氧化性
目前以發現幾丁質類物質及其衍生物具有良好的抗氧化力，以發 現其能夠抑制脂質過氧化、抑制TBARS（thiobarbituric acid reactive substance）生成，且對羥基自由基（hydroxy radical）有良好的清除 能力（Matsugo et al., 1998；Xue et al., 1998；Xie et al., 2001；Huang et al., 2005；Chien et al., 2007；Kim and Thomas, 2007；Yen et al., 2007）
（5）促進傷口癒合、凝血
幾丁質類物質使用在傷口上，除了具有抗菌的功效且其不會引起 發炎反應，在受傷部位會促進受傷區域重新生成，故有促進傷口癒合 之能力（Biagini et al., 1991；Chung et al., 1994）。除此之外幾丁質類
物質被發現具有凝集作用，會促進血小板分泌凝血因子，進而達到止 血的效果（Subar et al., 1992；Hirano, 1999）。
（6）抗菌
利用cellulase 水解 chitosan 所水解出之產物，其聚合度為 1～8，
其中大於hexamer 的重量比為 44.3％，這個 chitooligosaccharides 的混 合 液 具 有 很 強 抗 菌 效 果 ， 對 於 常 見 的 病 原 菌 如 Aeromonas hydrophila、E. coli、Listeria monocytogenes、Pseudomonas aeruginosa、
Salmonella typhimurium、Shigella dysenteriae、Staphylococcus aureus、
Vibrio cholerae 及 V. parahaemolyticus 之 MIC 為 5~29 ppm，若用
chitosan 則 需 要 的 濃 度 則 為 50~1000ppm ， 所 以 相 對 於 chitooligosaccharides 來說，chitosan 所需要的量就大很多，如果添加 0.24％到牛奶中，可有效抑制牛奶中腐敗菌及病原菌生長，藉以延長 其保存期限（Hirano and Nagao, 1989；Jeon and Kim, 2000；Tsai et al., 2000；Choi et al., 2001；Jeon et al., 2001；No et al., 2002；Gerasimenko et al., 2004；Yang et al., 2005）
4. 新型態益生質
幾丁質與幾丁聚醣的用途相當廣泛包括農藥、生化工程、生醫、
生醫材料、食品加工…等，其中最受到重視的就是在生醫上的抗菌效 果，但是因為其不容於水的特性大大的降低其應用，因此可溶性的幾 丁寡醣就受到重視，而且許多研究報告亦指出幾丁寡醣對常見的病原 菌具有良好的抗菌活性 (Tsai et al., 2000)。Lee 等人（2002）認為幾 丁聚醣水解物具有良好抗菌活性，但並未抑制乳酸菌，且可幫助其生
參、材料方法
一、研究方法及策略
近年來 chitin 及 chitosan 因為用途廣泛而引起注意，尤其在醫藥 領域中發現具有抗菌功效，對於許多病原菌皆有不錯的抑制效果，但 因其不溶於水之特性，導致應用時受到限制。
本研究利用溶解性較佳之具有抑菌活性之幾丁聚醣水解物篩選 不受幾丁聚醣水解物影響之乳酸菌，並找出能抑制但不傷害到一般腸 道菌之幾丁聚醣水解物最佳濃度，調配幾丁聚醣水解物與乳酸菌最適 的條件比例。觀察幾丁聚醣水解物對腸道菌抗菌活性之研究及腸道菌 互動之影響，以開發使益生菌成為腸道優勢菌株之幾丁聚醣與益生菌 之複合配方，藉以改善腸道菌相，促進人體腸道健康。
二、研究架構
幾丁聚醣（去乙醯度80、92%)
（水解物 CHtri、CHcel )
幾丁聚醣酵素水解物
Bifidobacteria Enterobacteria
共培養試驗
市售乳酸發酵乳
儲存試驗
耐受性試驗 耐受性
試驗 益生質特性分析
抗氧化分析
Crude chitinase及Commercial cellulase
三、實驗材料
（一）菌株
Bifidobacterium breve BCRC 14601 Bifidobacterium longum BCRC 14602 Bifidobacterium adolescentis BCRC 14606 Enterobacterium aerogenes BCRC 10370 Enterobacterium cloacae BCRC 10401 Enterobacterium coli BCRC 10675 Trichoderma viride BCRC 32054
實驗菌株購自新竹食品工業發展研究所 生物資源保存及研究中心。
（二）培養基
MRS lactobacilli broth、Peptone、YE（BD，美國）；Nature broth ( NB )、
Tryptic soy agar ( TSA )（HIMEDIA，印度)；Agar powder（OXOID，
英國）；BSM、BSM 營養補充劑 ( Fluka，瑞士)；MacConkey broth
（Difco）。
（三）藥品
Acetic acid ( Fluka，瑞士)；L-cysteine hydrochloride、bile salts、hemin、
vitamin K、N-acteyl-D-glucosamine、2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl、
（DPPH）、Vit. C、tetramethylmurexide (TMM)（Sigma，美國）；
1-propanol (J.T.Baker ， 美 國 ) ； ammonia solution (25%) 、 sodium actetate、H2SO4、ethanol (99.8%) ( RDH，德國)；KH2PO4、hexamine、
potassium chloride、copper sulfate、ferric chloride、Na2HPO4、NaH2PO4、 FeSO4‧7H2O、potassium ferricyanide、trichloroacetic acid （TCA）；
N-acetyl-D-glucosamine （ NAG ） （ Merck ， 美 國 ） ； NaHCO3、 MgSO4.7H2O、NaCl、NaOH、Na2CO3、CaCl2、MgCl2.6H2O、glucose、
sucros、NaNO3（Yakuri，日本）。
（四）幾丁聚醣
去乙醯度80％、92％，購自應化企業有限公司，台灣。分子量約 300 kDa，聚合度約為 1850 DP。
（五）酵素
Cellulase（EC 3.2.1.4）：Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921，購自於 Sigma C2730。
四、實驗方法
（一） Trichoderma viride 誘發 chitinase 及保存（Chen and Lin, 2004）
由-80℃冰箱（Sanyo MOF-U2086S）凍管中取出 Trichoderma viride 100 μL 置於 PDA 培養基中央，於室溫下培養 7 天，以接種
環取孢子置於PDA 培養基中央再於室溫下培養 7 天（二代），用2 mL RO 洗下孢子，置入一培培養基，於室溫下培養 5 天，以紗布過濾，
取得菌絲體，用RO 將菌絲體表面糖分洗去置入二培培養基，於室溫
抽氣過濾（濾膜孔徑0.45 μm），再過 0.22 μm 膜，分裝成小量，置 於15 mL 離心管內置於-20℃冰箱中（Whirlpool，東穎惠而浦）保存。
Trichoderma viride 幾丁質酶誘發一培培養基（菌絲體放大培養
基）：glucose 40 g，sucrose 12 g，NaNO3 1.2 g，MgSO4‧7H2O 0.2 g，
KCl 0.2 g，FeSO4‧7H2O 0.004 g，K2HPO4 0.4 g，ddH2O 定量至 400 mL，pH 調至 7.2（pH Meter：Suntex SP-701 pH / mV / TEMP Meter）。
Trichoderma viride 幾丁質酶誘發二培培養基（酵素誘發培養
基）：colloidal chitin 6 g [1.5%（final）]，NaNO3 1.2 g，MgSO4‧7H2O 0.2 g，KCl 0.2 g，FeSO4‧7H2O 0.004 g，K2HPO4 0.4 g，ddH2O 定量
至400 ml，pH 調至 7.2。
（二）幾丁質水解物製備
1％ 幾丁聚醣溶於 acetic buffer（100 mM，pH=4）中，加入粗酵 素液20％（濃縮酵素液用量 1％）在 42℃水浴（Firstek Scientific B 201）
下作用24 hrs～168 hrs 取樣，以沸水浴煮 15 min 使酵素失活，冷卻 至室溫（重複最後兩個步驟3 次，以達無菌狀態）。
（三）幾丁聚醣水解物分子量之測定
使用黏度計 Brookfield HADV-Ⅱ＋（Programmable DV-Ⅱ＋
Viscometer），探頭為 H1 探頭，設定轉速為 100 rpm。於水解過程中，
每3、6、9、24、48、72、96、120、144、168 小時，取 400 mL 至燒
杯中，測其黏度（cp）變化，並以 Mark Houwink 方程式推估分子量。
Mark Houwink 方程式：
［η］= KMa K = 1.64 × 10-30 × DD14 a = -1.02 × 10-2 × DD + 1.82
（四）菌種活化、保存
將購自於食品工業研究所之菌株先擦拭玻璃外管後，在酒精燈上 加熱玻璃管頂端，待玻璃管頂端灼熱時立即以無菌水滴加在玻璃外 管，出現裂縫後以鑷子輕敲外管擊破玻璃，已滅過菌的鑷子取出隔熱 纖維紙、棉花塞，滴加0.3～0.5 mL MRS broth 於內管中使粉狀菌體 懸浮在培養基中，取300 μL 加至 MRS broth，培養於 37℃厭氣的環 境下24 小時。
在厭氣操作台（Anaerobic Chamber SHEL BACTRON 1.5）中將 B. breve（BCRC 14601）、B. longum（BCRC 14602）、B. adolescentis
（BCRC 14606）培養於含 0.05％ L-cysteine 的 MRS 中，於 37℃厭
氣環境下培養24 小時（氣體狀態為 5% H2、95% CO2)。E. aerogenes
（BCRC 10370）、E.cloacae（BCRC 10401）培養於 NB，30℃。E. coli
（BCRC 10675）培養在 NB、37℃的環境。
（五）幾丁聚醣水解物抗菌測試
Bifidobacteria（BCRC 14602, BCRC 14602, BCRC 14606）培養
於含0.05％ L-cysteine的MRS broth；Enterobacteria（BCRC 10370, BCRC 10401, BCRC 10675 ） 培 養 於 NB ， 由 -80℃ 冰 箱 （ Sanyo MOF-U2086S）取出凍管保存液，取50 μL置於培養基中活化兩代，
兩種菌種皆在37℃中培養（培養箱：Low-temp incubator LT1601），
Bifidobacteria置於厭氧培養缸（DON WHITLEY A0002）中，在84%
H2、16% CO2下培養（產氣包；Oxoid，英國）。
將菌種接種至液態培養基中，活化一天（菌量為 1~5×108/mL）。
將酵素水解物取10~50 μL 加入 96 孔微量盤中，再加入等體積的 200 mM phosphate buffer pH 7.0 調整 pH 至中性，並將其校正到等體積 100 μL。再將活化後的菌液取 10 μL 加入 5 mL 兩倍濃度液態培養基中(接 菌量為1~5x105/mL)，取 150 μL 分裝到含有各種濃度之幾丁聚醣水解 物的 96 孔微量盤中共同培養，定時以 ELISA reader OD 590 nm
（BioLog E11010）觀察吸光值之變化，並決定其最小抑制濃度(MIC)。
最低抑制濃度（Minimum inhibitory concentration；MIC）定義：
抑菌分子可將菌體限制在遲滯期(lag phase)至少 48 小時以上，所需要 的最低濃度。
抑制時間（Inhibitory time；IT）定義：
菌株生長在遲滯期（lag phase）狀態所延長之時間。
抑制時間＝實驗組菌株生長於 lag phase 之時間－控制組菌生長於 lag phase 之時間
（六）儲存試驗
購買三種市售優酪乳產品（A、B、C )分別加入去乙醯度 80％、
92％幾丁聚醣水解物 400 ppm，儲存於 4℃、35 天，定時進行取樣、
稀釋並塗抹於MRS Agar 計算菌數，觀察變化。
（七）益生質特性試驗
將 DD80-CHcel 幾丁聚醣水解物 2%添加於基礎培養基中，取代 培養基中的碳源，三株 Bifidobacteria 菌液取 20～50 μL 接種至培養 基37℃下在厭氧培養缸中厭氣培養，定時以 ELISA reader OD 590 nm
（BioLog E11010）觀察吸光值之變化。
進一步以 0.5％ NAG 與 1.5％Glucose 混合液取代基礎培養基中 之碳源，將三株 Bifidobacteria 分別接種於培養基中，37℃下在厭氧 培養缸中厭氣培養，且定時以 ELISA reader OD 590 nm（BioLog E11010）觀察吸光值之變化。
（八）抗氧化分析
1. 清除 DPPH 自由基能力的測定（Shimada et al., 1992）
0.1 mL 樣品加入 0.1 mL DPPH 甲醇溶液混合均勻，在暗室反應 30min，使用分光光度計檢測 517 nm 之吸光值。
清除能力（％）＝(1-absorbancesample/ absorbancecontrol)*100％
2. 還原力的測定（Oyaizu, 1986）
0.5 mL 樣品加入 0.5 mL 0.2M 磷酸緩衝溶液（pH 6.6）及 0.5 mL K3Fe(CN)6（1%）於 50℃水浴反應 20 分鐘後迅速冷卻至室溫，加入 0.5 mL 10% TCA 溶液於 3000 rpm 離心 10 分鐘，取 0.5 mL 上清液加 入 0.5 mL RO 和 0.1 mL 0.1% 氯化鐵反應 10 分鐘後在 700 nm 下 測吸光值，吸光值越高表示還原力越好。
3. 金屬螯合試驗 - 銅離子螯合（Qin, 1993）
0.145 mL 樣品加入 0.145 mL（10 mM hexamine、10 mM KCl、
3 mM copper sulfate）混合液，加入 1 mM TMM 0.0145 mL 在室溫下 反應3 分鐘於 485 nm 測吸光值，吸光值越低表示樣本螯合金屬離子 效果越強。
（九）幾丁聚醣水解物與腸道菌共培養試驗
將菌種接種至液態培養基中，活化一天（菌量為 1~5×108/mL）。
基礎培養基中添加不同濃度（100 ppm 與 400 ppm）之幾丁聚醣水解 物（DD80-CHtri、DD80-CHcel、DD92-CHtri 及 DD92-CHcel），將 Bifidobacteria（等比例之 B. breve BCRC 14601、B. longum BCRC
14602 及 B. adolescentis BCRC 14606）與 Enterobacteria（等比例菌液
量之 E. aerogenes BCRC 10370、E.cloacae BCRC 10401 及 E. coli BCRC 10675）以不同菌數比例（1：1、4：1 及 10：1），於厭氣操 作台（Anaerobic Chamber SHEL BACTRON 1.5）內接種至上述培養 基中，37℃下培養（氣體調節為 N2 90％、H2 5％及 CO2 5％），48 小時後取樣、連續稀釋並分別塗抹於鑑別性培養基（BSM、MacConkey Agar ） 上 ， 於 恆 溫 厭 氣 培 養 （ Personal CO2/Multigas Incubator APC-30D/AMP-30D）中培養 48 小時後觀察菌數變化。
肆、結果與討論
一、幾丁聚醣水解物之製備與分子量分佈
幾丁聚醣常利用酵素進行水解而得到幾丁聚醣水解物，其分子量 主要是測量水解後黏度變化，以Mark Houwink 方程式計算分子量。
由圖十三中可發現未水解之幾丁聚醣分子量在300 kDa 以上，經過酵
素水解後分子量有逐漸降低之趨勢，並在水解 24 小時後分子量變化
趨於平緩，因此將幾丁聚醣酵素水解時間訂為24 小時。
在水解24 小時後幾丁聚醣水解物分子量降低至 20 kDa 以下，其 中分子量大小為DD92-CHtri（13.54 kDa）＞DD80-CHtri（9.64 kDa）
＞DD80-CHcel（8.07 kDa）＞DD92-CHcel（6.92 kDa）。以上述不同 酵素處理所得之水解物進行後續之研究。
二、幾丁聚醣水解物抑菌測試
（一）幾丁聚醣水解物對伺機菌之影響
幾丁聚醣水解物已被證實具有良好抑制病原菌之效果，表五即研 究腸道中的伺機腸道菌，包括E. aerogenes、E. cloacae 與 E. coli，對 幾丁聚醣水解物的耐受性，發現相同去乙醯度下以Trichoderma viride 產生的chitinase 粗酵素水解之產物有較佳之抑菌效果；若以相同水解 酵素來說，去乙醯度較大者有較好的抑菌能力；對 E. coli 而言，
DD92-CHtri的抑制效果最好（100 ppm），其次是 DD92-CHcel，再來 則是DD80-CHtri，最差的是DD80-CHcel。伺機腸道菌中又以E. coli 最為敏感，在100 ppm 的 D80-CHtri、DD92-CHtri 及 DD92-CHcel受 到抑制。幾丁聚醣水解物去乙醯度會影響其抗菌效果，研究中發現不 同去乙醯度之幾丁聚醣水解物其在相同水解酵素作用時，去乙醯度較 高之幾丁聚醣水解物有較佳的抑菌效果，此與 Chen 等（2002）研究 之結果相似。經celluase 酵素作用之幾丁聚醣水解物其抑菌效果差，
推測可能是其所產生之水解物分子量較小，伺機菌可以此水解物為營 養來源，生長不受影響。一般而言，幾丁聚醣水解物抑制革蘭氏陰性 菌較陽性菌佳，約可抑制20-60％（Chen et al., 2002.），實驗中發現 三株伺機腸道菌耐受性皆不同，以 E. coli 最差。因此推測幾丁聚醣水
（二）幾丁聚醣水解物對Bifidobacterium 之影響
表 六 中 去 乙 醯 度 80% 、 92% 的 幾 丁 聚 醣 水 解 物 對 三 株 Bifidobacteria 較沒有抑制效果，三株 Bifidobacteria 中以 B. brevis 較
為敏感，DD80-CHtri、DD80-CHcel、DD92-CHtri 及 DD92-CHcel 在 400 ppm 下可抑制 B. brevis 生長。Gerasimenko 等（2004）的實驗結
果不同，他們發現分子量在 6～12 kDa 0.0025 ppm 即能抑制 B.
bifidum，因為菌株本身對幾丁聚醣水解物的耐受性不盡相同，推測是
因為B. bifidum 的耐受性較差所導致。
No 等（2002）發現分子量 22 kDa 的幾丁聚醣對革蘭氏陽性菌及 革蘭氏陰性菌會降低1～2 log CFU/ml。根據學者研究發現低分子量 的幾丁聚醣水解物對革蘭氏陽性菌中的乳酸菌之 MIC 為 500-1000 ppm，此與本文結果亦有所出入。
三、幾丁聚醣水解物儲存試驗
益生菌目前發現對人體有許多生理功能，因此常添加於市售發酵 乳品中，所以產品中含有的益生菌菌數是相當重要的，此會影響產品 的品質也會影響產品的價格（Sanders, 1998）。尤其益生菌對儲存時 環境含氧量的改變有相當大的敏感性（Krasaekoopt et al., 2006；Matto et al., 2006；Cristina et al., 2007；Donkor et al., 2007），在產品儲存
期 間 亦 容 易 死 亡 ， 存 活 率 逐 漸 降 低 。 因 此 本 實 驗 選 擇 不 抑 制 Bifidobacteria 但可抑制 Enterobacteria 的幾丁聚醣水解物濃度，將 400 ppm 的 DD80-CHtri、DD80-CHcel、DD92-CHtri及 DD92-CHcel添加
於市售產品中，儲存在 4℃下 35 天，觀察市售發酵乳品中乳酸菌之 穩定性。
本研究結果發現，對 A（圖十四）、B（圖十五）兩牌的市售發
酵乳品中不止有延緩乳酸菌死亡的效果，且約可提高 1～2 log
CFU/ml 菌數；而添加幾丁聚醣水解物之 C 牌產品（圖十六），其菌 數與控制組並無明顯差異。推測可能是因為市售產品中乳酸菌的菌種 差異所造成，因此菌種之間的共生、拮抗等競菌作用較複雜。添加幾 丁聚醣水解物確實能改善益生菌隨著儲存時間菌數逐漸死亡的情 形，推測有兩種可能性：幾丁聚醣水解物為一種新的益生質，添加於
有關。
許多文獻證實添加益生質於含益生菌之發酵乳品中，可以降低益 生菌隨儲存時間的延長而死亡的情形，Capela 等（2006）發現對發酵 乳 中 的 菌 種 L. acidophilus 、 L. casei 及 B. longum 添 加 2 ％ Fructooligosaccharides 與 Inulin 等益生質，在 4℃下儲存 4 星期後，可 延緩菌數死亡1 log CFU/ml。Martínez-Villaluenga 等（2006）在乳品 中添加raffinose 寡糖類後，在 4℃儲存 3 週後可以延緩乳酸菌降低一 個log。
陸陸續續已經有許多益生質寡醣類物質發現可幫助益生菌生 長、提高益生菌的存活率，本實驗添加幾丁聚醣水解物後發現亦有此 效果，此外幾丁聚醣具有在人體中不被水解吸收之特性，因此推測幾 丁聚醣水解物可能具有益生質特性，因此進行以下實驗確認之。
四、幾丁聚醣水解物益生質特性評估
益生質需具備：在腸胃道中不能被水解或吸收、在腸道中能被選 擇性發酵、改變腸道中菌相趨於健康良好的組成、能誘發宿主的免疫 反應等特性。研究發現幾丁聚醣水解物添加在市售產品中可提高存活 率，此外具有無法被人體吸收之特性，因此成為益生質之可能大為提 高。Lee 等人在 2002 年提出幾丁聚醣水解物是一種新型態益生質益
生質，他在基礎培養基中添加 0.1％幾丁聚醣水解物後，可提高
Lactobacillus sp.與 Bifidobacteria 生長濁度約 0.25 左右（Lee et al.,
2002）。
本實驗將最不具有抑制性的幾丁聚醣水解物 DD80-CHcel添加在 基礎培養基中取代碳源，培養三株 Bifidobacteria。圖十七發現 B.
breve、B. longum 及 B. adolescentis 均無法有效利用 DD80-CHcel生長。
進一步以幾丁質的單體 NAG 來做確認，將 0.5％ NAG 添加至含有 1.5％葡萄糖之基礎培養基中作為碳源（圖十八），結果顯示相較於 葡萄糖，NAG 對於菌種生長並無幫助。為了進行確認，乃比對菌種 鑑定資料庫系統（Biolog，USA）中三株 Bifidobacteria 對 NAG 之使 用率，表七發現B. longum 及 B. adolescentis 無法利用 NAG，而 B. breve 的利用率為 46％（意即在 100 株受試菌株當中，只有 46 株會使用
BCRC 14601 不能使用 NAG 來作為生長之用。而 Enterobacteria 三者
對 NAG 的使用率則皆在 75％以上，相對高很多。本實驗所使用之 Bifidobacteria 菌株，不能使用 NAG。也因此，NAG 所組成之聚合物
並不能作為 Bifidobacteria 的益生質，這個結果與 Lee 等人（2002）
相左。Lee 學者使用的基礎培養基是 MRS，其是專門用來培養乳酸菌 之培養基，含有相當豐富之營養，而本研究中使用之基礎培養基是不 含任何碳源之basal media，主要是將幾丁聚醣水解物作為基礎培養基 中碳源，因為兩者使用的基礎培養基不同，其可能導致不同的結果。
