（1）Bifidobacterium 菌數計算之重要性
Bifidobacterium 是益生菌，目前發現對人體有許多生理功能，因
此常添加於市售發酵乳品中，所以產品中含有的Bifidobacterium 菌數 是 相 當 重 要 的 ， 此 不 僅 會 影 響 產 品 的 品 質 也 會 影 響 產 品 的 價 格
（Sanders, 1998）。但是 Bifidobacterium 是厭氧菌，對培養時環境含
氧量的改變有相當大的敏感性，在產品儲存期間亦容易死亡，存活率 會逐漸降低，所以在培養計算菌數時容易造成計算誤差 (Shah et al., 1995；Dave and Shah, 1997；Krasaekoopt et al., 2006；Matto et al., 2006；Cristina et al., 2007；Donkor et al., 2007)。
（2）Bifidobacterium 菌屬在品質管制上困難
b 定性
產品單獨以Bifidobacterium 進行發酵時風味不佳，故在發酵的過 程 中 常 常 是 在 發 酵 末 期 或 是 發 酵 完 成 後 才 將 具 機 能 性 之 Bifidobacterium 添加，尤其 Bifidobacterium 與其他乳酸菌的特性相
似，因此，如何在培養的同時將Bifidobacterium 與其他乳酸菌區隔開 來亦有難度（Dave and Shah, 1996；Pacher and Kneifel, 1996；Vinderola and Reinheimer, 1999；Vinderola and Reinheimer, 2000；Roy, 2001；
Hadadji et al., 2005）。
二、 益生質（prebiotics）對人體的關係 主的健康（Gibson and Roberffroid, 1995；Van Loo et al., 1999；Kaplan and Hutkins, 2000；Schrezenmeir and de Vrese, 2001）。
（一） 益生質的條件
（二） 益生質之結構
益生質必須在腸胃道中不會被水解吸收，寡醣類益生質如果寡 醣、半乳寡醣、異麥芽寡醣等，都是以β-醣苷鍵來鍵結，而人體消 化道中的醣解酵素主要是α型，因此這些寡醣類益生質無法被腸胃道 的消化酵素水解（Barreteau et al., 2006；Mussatto and Mancilha, 2007）。
（三） 益生質的種類
許多學者發現益生質對益生菌的生長及生理都有很多助益，常見
的 益 生 質 包 括 fructo-oligosaccharides 、 gluco-oligosaccharides 、 galacto-oligosaccharides 、 transgalacto-oligosaccharides 、 isomalto- oligosaccharides、xylo- oligosaccharides（Moura et al., 2007）、soybean- oligosaccharides （陳，1992；譚，1999；Matteuzzi et al., 2004；
Tomomatsu, 1994；Huebner et al., 2007；Kukkonen et al., 2007）、
Raffinose (Gopal et al., 2001 ； Gulewicz et al., 2002 ； Martinez- Villaluenga and Gomez, 2007；Crittenden and Playne, 2002；Jaskari et al., 1998)、Alginate oligosaccharides（Wang et al., 2006）
表四、寡醣類益生質之結構
Table 4. Non-dugestible oligosaccharides with bifidogenic functions commercially available.
（Mussatto and Mancilha, 2007）
（四） 益生質的生理機能 1. 促進益生菌生長
文獻中比較常見乳酸菌與腸道病原菌對於各種醣類之利用，結果 顯示乳酸菌對於醣類的利用率明顯比腸內病原菌來的好，尤其以 Coistidium jejuni 對各種醣類的利用率極低，幾乎不能利用 (Fooks et al., 2002；Mikkelsen and Jensen, 2004；Vulevic et al., 2004；Mountzouris
et al., 2006) 。為了探討益生質對益生菌抑制病原菌的功效是否有幫 助，將益生菌B. bifidium Bb12 與腸道病原菌在不同碳源下混合培養，
發現不同的益生質皆能促進益生菌的生長提高菌量，對於三株腸道病 原菌都能抑制其生長，其中以 Clostidium jejuni 的抑制最為顯著 (Fooks et al., 2002；Montesi et al., 2005) 。
由於益生質對益生菌選擇性發酵的特性。研究中以各種不同醣類 取代培養基中的醣類物質，觀察益生質對乳酸菌生長之影響。以乳醣 作為控制組，實驗組中個別加入果寡醣（FOS）與 oligo-fructose（OF）
作為碳源，其兩者主要為聚合度與純度上的差異，發現，FOS、OF 對B. longum
、
B. animalis、B. catenulatum 有明顯幫助生長的現象，可提高1.1-5.2 倍的菌量 (Bielecka. et al., 2002)。
2. 延長益生菌存活率
近年來體內環保的觀念被大眾重視，市售發酵乳品中常添加對人 體有益的益生菌，但是由於乳酸桿菌與 Bifidobacterium 是厭氣菌，所 以隨著儲存時間的增加，發酵乳品中的益生菌量會逐漸降低的現象 (Shan et al., 1995)。因此學者就利用益生質的觀念，將益生質添加在 乳品中，希望能改善益生菌菌量的問題（Alander et al., 2001；Capela et al., 2006）。Martínez-Villaluenga 等人選用常添加在乳品中的益生
菌L. acid- ophilus 與 B. lactis Bb-12，在乳品中添加 raffinose 寡糖類 後，每週觀察一次菌數，共觀察3 週，由表 5 發現添加寡醣，在 4℃
儲存3 週後可以延緩乳酸菌降低一個 log (Martínez-Villaluenga et al., 2006)。
（Kim et al., 1995；Yazid et al., 2000；Moubareck et al., 2005）。但是
因為每種菌株對於抗生素的耐受性皆不相同，且容易引起抗藥性的問 題，因此利用抗生素作為選擇性培養基的風險較大。學者發現添加 raffinose 寡糖類於培養基時，因為其他菌無法利用這種碳源，因此無
法生長，對於Bifidobacterium 則是良好的碳源，對其生長無礙，可以 有效將菌區分開而有較佳的選擇性(Hartemink et al., 1996)。
4. Synbiotics
Synbiotics 為益生菌與益生質相加乘後之名稱，益生菌與益生質 對人體皆有益處，當兩者共用時具有加乘的功效，許多研究發現益生 質在體內或體外試驗中皆有促進益生菌生長的效果，更可提高益生菌 的生理功能（Brown et al., 1998；Collins et al., 1999； Asahara et al., 2001；Crittenden et al., 2002；Bielecka et al., 2002；Charalampopoulos et al., 2002；Tuohy et al., 2003；Rastall et al., 2005；Bruzzese et al.,
2006；Geier et al., 2007）。
一、 幾丁質、幾丁聚醣與幾丁寡糖之關係
（一） 幾丁質（Chitin）
Chitin （圖十）在自然界中的含量相當豐富，存在於許多甲殼動 物的外殼與真菌類的細胞壁中，為β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine 的直 鏈聚合物，在自然界中的含量僅次於纖維素，也是地球上除蛋白質外 類的外殼皆為α-chitin（Wood and Kellogg, 1988）。
2. β-chitin
β-chitin 為單斜晶系（monoclinic），分子鏈的排列為平行排列
（parallel packing），這樣的排列導致分子間的氫鍵較少，因此結構
較為鬆散，烏賊及尖鎖管的軟骨和鬚腕動物的軟管則為 β-chitin
（Wood and Kellogg, 1988）。
3. γ-chitin
γ-chitin 的分子鏈排列則為 α-chitin 及 β-chitin 的混合，主要存在於 藻類和真菌類中（Wood and Kellogg, 1988）。
圖十、chitin 結構式及單體 Fig 10. Structure of chitin.
(Kumar, 2000)
圖十一、Chitin 的三種排列方式
Fig 11. Arrangement of the chain in chitin.
(Wood and Kellogg, 1988)
（二）幾丁聚醣（chitosan）
chitin 經高溫及強鹼的作用進行去乙醯化（deacetylation）作用，
將部分或全部的乙醯基轉變成胺基，即為幾丁聚醣，其去乙醯基程度 由 65% 至 99% 不 等 ， 一 般 以 70~90% 最 常 見 。 幾 丁 聚 醣 為 β-1,4-D-glucosamine 的直鏈聚合物（圖 12），其鏈上的胺基（-NH2），
在酸中會呈現（-NH3+），使其成為帶有正電荷，因此 chitosan 具有
溶於酸性或弱酸性的有機酸及無機酸的特點，故 chitosan 的溶解度較 chitin 為佳，大部分以 5%的醋酸（acetic acid）當溶劑。經酸性溶劑 溶解後具有弱鹼性的陽離子電解質（cationic polyelectrolyte）特性，
且具有胺基（amino group）與氫氧基（hydroxyl group），利於化學 製備各種衍生化合物。通常可將其製成膠狀、纖維狀、珠狀、薄膜狀 及海綿狀等，以提供各種應用，常應用在污泥處理、食品加工與螯合 金屬離子等，但近年來正逐漸趨向於高價值的商品，例如化妝品、殺 菌劑、攜帶藥物者、食品添加物及健康食品….等等。例如利用低分
子量的 chitosan 做成 nanoparticles，攜帶破傷風類毒素（Tetanus toxoid），注入小鼠中，對於提高並維持較長時間的免疫反應有顯著 的效果（Vila et al., 2004）。
圖十二、Chitosan 結構式及單體 Fig 12. Structure of chitosan.
(Kumar, 2000)
（三）幾丁質水解物（Chitooligosaccharides；COS）
1. 結構
由於 chitin 及 chitosan 水溶性差，也因此人們就試著製造出能夠 溶於水中，並且具備其生理活性的 chitooligosaccharides。幾丁質水解 物一般可分為N-乙醯幾丁寡醣（N-acetyl-chitooligosaccharides）與幾 丁寡醣(chito-oligosaccharides)，N-乙醯幾丁寡醣由 2-10 個的 N-乙醯 葡萄糖胺形成的；而幾丁寡醣是以葡萄糖胺為單體形成的醣類。幾丁 質水解物可溶於水，在食品方面仍具有多醣的特性，如保水、吸濕及 抗菌等，在農業、醫學、食品領域上擁有高度價值。如用酵素粗萃取 液（crude enzyme：cellulase from Trichoderma viride 和 Acremonium cellulolyticus 、 lipase 、 hemicellulase 、 pectinase ） 所 製 造 的
N-acetyl-D-glucosamine，其可提高關節滑液的黏性、改善軟骨的代謝
與 增 強 肌 關 節 的 活 動 功 能 ， 故 有 利 於 受 損 關 節 軟 骨 的 修 復 治 療
（Sashiwa et al., 2003）。
2. 製備方式
使用酵素法雖然成本高（Qin et al., 2004），但是毒性低（Ilyina et al., 2000），能以少量的酵素就可以得到較高的產率，目前較常被使
用的酵素為chitinase、chitosanase、celluase、lyzozyme 及 glycosidase 等。
3. 生理功能
幾丁質、幾丁聚醣、幾丁質水解物被廣泛應用在農業、生醫及食 品領域（Shahidi et al., 1999），以下介紹其幾個重要生理活性：
（1）降低脂肪代謝
幾丁聚醣本身的正電荷會與帶負電的脂肪結合，形成膠狀物質，因此 阻斷脂肪被小腸吸收代謝（Deuchi et al., 1994；Ormrod et al., 1998）。
（2）抗腫瘤活性
瘤細胞外圍形成一個膜，導致腫瘤細胞生長受到限制（Saiki et al., 1990；Tsukada et al., 1990）
（3）提高免疫力
幾丁質類物質能夠促進免疫球蛋白的活性，誘發巨噬細胞，有助 於增強免疫系統（Meada et al., 1992；Shibata et al., 1997）
（4）抗氧化性
目前以發現幾丁質類物質及其衍生物具有良好的抗氧化力，以發 現其能夠抑制脂質過氧化、抑制TBARS（thiobarbituric acid reactive substance）生成，且對羥基自由基（hydroxy radical）有良好的清除 能力（Matsugo et al., 1998；Xue et al., 1998；Xie et al., 2001；Huang et al., 2005；Chien et al., 2007；Kim and Thomas, 2007；Yen et al., 2007）
（5）促進傷口癒合、凝血
幾丁質類物質使用在傷口上，除了具有抗菌的功效且其不會引起 發炎反應，在受傷部位會促進受傷區域重新生成，故有促進傷口癒合 之能力（Biagini et al., 1991；Chung et al., 1994）。除此之外幾丁質類
物質被發現具有凝集作用，會促進血小板分泌凝血因子，進而達到止 血的效果（Subar et al., 1992；Hirano, 1999）。
（6）抗菌
利用cellulase 水解 chitosan 所水解出之產物，其聚合度為 1～8，
其中大於hexamer 的重量比為 44.3％，這個 chitooligosaccharides 的混 合 液 具 有 很 強 抗 菌 效 果 ， 對 於 常 見 的 病 原 菌 如 Aeromonas hydrophila、E. coli、Listeria monocytogenes、Pseudomonas aeruginosa、
Salmonella typhimurium、Shigella dysenteriae、Staphylococcus aureus、
Vibrio cholerae 及 V. parahaemolyticus 之 MIC 為 5~29 ppm，若用
chitosan 則 需 要 的 濃 度 則 為 50~1000ppm ， 所 以 相 對 於 chitooligosaccharides 來說，chitosan 所需要的量就大很多，如果添加 0.24％到牛奶中，可有效抑制牛奶中腐敗菌及病原菌生長，藉以延長 其保存期限（Hirano and Nagao, 1989；Jeon and Kim, 2000；Tsai et al., 2000；Choi et al., 2001；Jeon et al., 2001；No et al., 2002；Gerasimenko et al., 2004；Yang et al., 2005） 菌具有良好的抗菌活性 (Tsai et al., 2000)。Lee 等人（2002）認為幾 丁聚醣水解物具有良好抗菌活性，但並未抑制乳酸菌，且可幫助其生
參、材料方法
一、研究方法及策略
近年來 chitin 及 chitosan 因為用途廣泛而引起注意，尤其在醫藥 領域中發現具有抗菌功效，對於許多病原菌皆有不錯的抑制效果，但 因其不溶於水之特性，導致應用時受到限制。
本研究利用溶解性較佳之具有抑菌活性之幾丁聚醣水解物篩選 不受幾丁聚醣水解物影響之乳酸菌，並找出能抑制但不傷害到一般腸 道菌之幾丁聚醣水解物最佳濃度，調配幾丁聚醣水解物與乳酸菌最適 的條件比例。觀察幾丁聚醣水解物對腸道菌抗菌活性之研究及腸道菌 互動之影響，以開發使益生菌成為腸道優勢菌株之幾丁聚醣與益生菌 之複合配方，藉以改善腸道菌相，促進人體腸道健康。
二、研究架構
二、研究架構