圖表…

第二章、植物生長物質在蝴蝶蘭的生長與開花上之應用

第二節圖表…

圖1-4、蝴蝶蘭大紅花栽培種 Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'接種軟腐病菌 (Erwinia chrysanthemi) 24 小時候後病徵的發展情況(1 x 10^-2~1 x 10^-7)。(A)經序列稀釋後取10ul 的菌液利用微球管接種在葉片的傷口上、(B)沒有蘭菌感染的對照組、

(C)R02 感染的植株、(D) R04 感染的植株。

Figure 1-4. Soft rot development on leaves of Phalaenopsis Tai Lin ‘Redangel ‘V31’

(V31) inoculated with Erwinia chrysanthemi after 24 h of inoculation (1 x 10^-2~1 x 10^-7).

(A) 10 µl each of series diluted Erwinia chrysanthemi inoculum was applied directly onto the wounding site with a micropipette; (B) non-micorrhizal fungi infected control;

(C) Rizoctonia isolates R02 infected; (D) Rizoctonia isolates R04 infected.

10

^-2

X

10

^-3

X 10

^-4

X

10

^-6

X

10

^-5

X 10

^-7

X

A

C

圖1-5、Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111) 接種軟腐病菌 (Erwinia chrysanthemi) 24 小時候後病徵的發展情況(1 x 10^-2~1 x 10^-7)。(A)經序列稀釋後取10ul 的菌液利用微球管接種在葉片的傷口上、(B)沒有蘭菌感染的對照組、

(C)R02 感染的植株、(D) R04 感染的植株。

Figure 1-5. Soft rot development on leaves of Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111) inoculated with Erwinia chrysanthemi after 24 h of inoculation (1 x 10^-2~1 x 10^-7). (A) 10 µl each of series diluted Erwinia chrysanthemi inoculum was applied directly onto the wounding site with a micropipette; (B) non-micorrhizal fungi infected control; (C) Rizoctonia isolates R02 infected; (D) Rizoctonia isolates R04

infected.

10

^-2

X

10

^-3

X 10

^-4

X

10

^-6

X

10

^-5

X 10

^-7

X

A

C

圖1-6、Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'接種軟腐病菌(Erwinia chrysanthemi) 24 小時候後病徵的發展情況(1 x 10^-1及1 x 10^-3)。(A)經序列稀釋後取 10ul 的菌液利用微球管接種在葉片的傷口上、(B)沒有蘭菌感染的對照組、(C)R02 感染的植株、(D) R04 感染的植株。

Figure 1-6. Soft rot development on leaves of Phalaenopsis Tai Lin ‘Redangel ‘V31’

(V31) inoculated with Erwinia chrysanthemi after 24 h of inoculation (1 x 10^-1and 1 x 10^-3). (A) 10 µl each of series diluted Erwinia chrysanthemi inoculum was applied directly onto the wounding site with a micropipette; (B) non-micorrhizal fungi infected control; (C) Rizoctonia isolates R02 infected; (D) Rizoctonia isolates R04 infected.

10

^-1

C

表1-1、蝴蝶蘭栽培種 Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'、Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111)軟腐病徵的發展。軟腐病徵的發展為測量其水浸狀組織的直徑。

Table 1-2. Soft rot development in orchid mycorrhizal fungi (OMF) inoculated Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31' and Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111). Soft rot development was characterized by forming clear circle zone.

Erwinia chrysanthemi conc. (OD600)

10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 Orchid

cultivar Treatment^x

Clear circle zone (mm)^y

NM 6.0a 5.4a 3.8a 3.0a 2.0a 0 R02 5.0a 3.2a 2.6a 2.2a 1.0a 0 V31

R04 4.6a 4.0a 1.8a 1.0a 0.4a 0 NM 8.6a 8.0a 5.6a 3.8a 1.4a 0.7a R02 9.0a 7.0a 5.8a 4.6a 2.4a 0.6a KC1111

R04 8.3a 7.3a 5.5a 4.3a 1.5a 1.1a

zFive replicates were tested for each treatment

yMeans are signified in each column followed by different letter at 5 % significant level as determined by Duncan’s multiple range test.

xNM:non- mycorrhiza. R02 and R04: inoculated with Rizoctonia isolates R02 and R04.

表1-2、蝴蝶蘭栽培種 Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'、Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111)軟腐病徵的發展。軟腐病徵的發展為測量其水浸狀組織的直徑。

Erwinia chrysanthemi conc. (OD600)

10^-1 10^-3

Orchid

cultivar Treatment^x

Clear circle zone (mm)^y

NM 7.0a 4.1a

R02 4.3b 2.2b

V31

R04 6.0a 3.2a

NM 6.9a 3.9a

R02 6.4ab 4.2a

KC1111

R04 5.7b 3.2a

zTen replicates were tested for each treatment

yMeans are signified in each column followed by different letter at 5 % significant level as determined by Duncan’s multiple range test.

xNM:non- mycorrhiza. R02 and R04: inoculated with Rizoctonia isolates R02 and R04.

第三節接種蘭菌之蝴蝶蘭其抗病機制探討

前言

由以上章節可見，蘭菌對蘭科植物之生長確有其影響，但是在機制方面還有很大的空間去探討；為了要讓蘭菌在蝴蝶蘭產業化過程中能發揮功能，其促進蝴蝶蘭生長、抗逆境甚或開花的生理及基因分子層次的相關資料，成為其推廣不可或缺的條件。由於蝴蝶蘭並無完整的基因庫可供應用，若要瞭解接種蘭菌究竟誘發了那些基因，抑制性扣減雜合技術(suppression subtractive hybridization, SSH) (Lukyanov等氏，2007；Diatchenko等氏，1996; von Stein等氏，1997)將是一種好的方法；它將標準化(normalization)及扣減(subtraction)合併於一步驟完成，避免數量少的訊息在過程中遺失，如果再加上抑制性PCR法(suppression polymerase chain reaction)，則可加強微量表現的cDNA，此類序列可被加強1000倍以上(Diatchenko 等氏，1996) ，能夠減低因不同基因之間RNA量的不同所造成的干擾，並且大幅度提高了偵測差異表現的RNA之靈敏度，因此實為相當有效之利器。SSH之做法為，取實驗組RNA製成Tester cDNA，取對照組RNA製成Driver cDNA後，將Tester cDNA分成兩組，分別接上不同的adpator，再分別以大量的同一組Driver進行第一次的hybridization。經過此步驟可將不同的RNA的量標準化(normalization)，之後再將兩組接上不同adaptor的Tester cDNA混合後，加入新鮮的Driver cDNA 進行第二次的hybridization。在此步驟中，帶有不同adaptor的同一個基因之ssDNA將會黏合，

形成帶有兩種adaptor的dsDNA。最後再利用根據adaptor設計的Primer進行PCR，此時帶有同一種adaptor的cDNA會因為兩端的adaptor互相黏合而無法被PCR放大

（Suppression PCR），因此能夠被放大的皆是具有差異表現情形且帶有不同adaptor 的cDNA，選殖這些cDNA進行定序後，則可得到具有差異表現情形的基因。

不同蘭菌分別接種蝴蝶蘭大白花栽培種 Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111)、大紅花栽培種 P h a l a e n o p s i s Tai Lin Redangel 'V31'後，

其根系或全株材料與未接種者經 SSH 分離出基因定序並透過 BLAST 比對，先期將目標著重在營養吸收( Paszkowski 等氏，2002; Wang 等氏，2002; Nazoa 等氏，

2003)、抵抗逆境(Hause 等氏，2002; Bonfante 等氏，1996; Harrison，1996; Journet 等氏，2001; Wulf 等氏，2003)等相關基因，以做為蘭菌推廣時的依據。SSH 技術被引用後，曾成功地鑑定出人類中與癌症相關的基因(von Stein 等氏，1997; Kuang 等氏，1998)，植物則最先在 ice plant (Mesembryanthemum crystallinum)中分離出三個受鹽類誘導之少量cDNA(Yen 等氏，2000)；目前 SSH 已成為研究相關議題最強而有力的方法，本試驗以抑制型PCR 法加上 SSH 探討蘭菌在蝴蝶蘭中的分子差異表現，是未來推廣蘭菌、拓展蝴蝶蘭產業過程不可或缺的基礎。

材料與方法 研究材料

本試驗之植物材料為目前業界蝴蝶蘭外銷主力品種，大白花蝴蝶蘭 KC1111 (Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’)及大紅花蝴蝶蘭 V31

(Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31')，來源為牛記花卉農場或金車生物科技所生產 之瓶苗。出瓶時分別接種 Rhizoctonia spp. (R02)及(R04)菌種，以高溫消毒過之智利 水苔栽培，栽種於28/23^oC 日/夜溫、光照強度 80 µmol·m^-2·s^-1，每日12 小時光週期，相對濕度70%的植物生長箱環境。植株每週以 200 mg·L^-1之Peters

(20N-8.6P-16.6K)水溶性肥料(Scotts, Marysville, Ohio)灌溉一次。

蘭花根部RNA之萃取

分別選取栽培2個月及4個月之蝴蝶蘭大白花栽培種KC1111及大紅花栽培種 V31之菌根及非菌根植株，採集其根部樣本，菌根植株每處理20 g，非菌根植株每處理40 g，儲存於-80 ℃冰箱。進行RNA萃取時，每次拿取4克根部樣本，分置於二研缽，加入液態氮將其研磨成粉末狀後，每一研缽加入12 mL 之 TRIZOL(GIBCOBRL)試劑，混合均勻後，將其平均置入16管1.5 mL之eppendorf tube 中後，依據TRIZOL(GIBCOBRL)試劑萃取多醣類含量較高之總RNA建議方式進行蝴蝶蘭根部總RNA萃取，依此方法，每4 g之蝴蝶蘭根部樣本，約可獲得總RNA 100-150 µg。

mRNA純化

本試驗之mRNA之純化，以Oligotex mRNA Mini Kit(QIAGEN)進行，每400 µg 之總RNA經純化後約可獲得2 µg之mRNA。

抑制型扣減雜合(Suppresion Subtractive Hybridization, SSH)

本試驗之SSH操作，以PCR-selected cDNA subtraction Kit ( Clontech Lab, Inc., Palo Alto, CA, USA ) 進行差異表現基因片段放大。所獲得之PCR放大片段，以1%

agrose進行電泳後，在紫外光板上，將分子片段大小約0.5-1.5 kb之DNA片段以小刀切割挖出，挖出之含差異表現基因片段之agrose gel ，最後以 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit(Geneaid)進行純化。

SSH次基因庫建立

將純化後之SSH產物PCR放大片段，以pGEM-T Easy Vector(Promega)進行植體構築，形成重組質體。接著把重組質體轉殖入高效率之大腸桿菌(E. Coli)勝任性細胞JM109(≧1x10⁸cfu/µg DNA)。加入SOC培養基，於37℃震盪培養1小時後將菌液均勻塗抹於含ampicillin 0.1 ·L^-1、X-gal及IPTG之LB平板培養基上，以藍白篩選方式來篩選含有正確重組質體的菌落。由本次試驗選取2個蝴蝶蘭栽培種KC1111及 V31，分別接種R02、R04菌種，於生長箱內生長2個月及4個月共8個不同處理組別，

共挑選出白色菌落。使用High-Speed Plasmid Mini Kit(Genedid)自大腸桿菌中抽出 重組質體後，以EcoRI內切酵素，於37℃作用2小時條件下進行重組質體切割，確 認inserts是否正確插入重組質體。挑選768個菌落，經確認後確有插入片段之重組質體送至基龍米克斯公司進行核酸定序。

基因比對

所得到之核酸片段序列，利用BLAST network service ( National Institutes of Health ) 進行BLASTx比對，並由結果中篩選出可能與促進蝴蝶蘭養分吸收及抗病、抗逆境相關之有意義的基因。

RT-PCR之Primer設計

進行RT-PCR所需之Primer，依據表一之結果，以OLIGO 4.0 Primer分析軟體進

行分析設計，表中之紅色部位為Primer序列設計之依據，所有引子依其相似之基因排列如下:

cytochrome P450 monooxygenase Primer A1

序列5’ AGCCAAACTCCCCACC 3’

長度: 16 Td=59.4℃

Primer A2

序列5’CATGAACGGATTAACGAGATT 3’

長度: 20 Td=58.2℃

GDA2 Primer B1

序列5’ AGAATCTCGTTTTCCTGCT 3’

長度: 20 Td=60.4℃

Primer B2

序列5’GAGTCGGAATTTGGGACC 3’

長度: 18 Td=61.5℃

Pectinesterase Primer C1

序列5’ GCTGCCATTACTAACCAAGA 3’

長度: 20 Td=59.8℃

Primer C2

序列5’ TGTTCTGGATGCGGAGGT 3’

長度: 18 Td=63.2℃

PVPR3 Primer D1

序列5’ ATGATTGCAGTTTTGACTACAA 3’

長度: 22 Td=59.6℃

Primer D2

序列5’ ATCTTGACGATCTTGGAAGC 3’

長度: 20 Td=60.9℃

GRX Primer E1

序列5’ CGAGCACCACGTCTTAG 3’

長度: 19 Td=60.5℃

Primer E2

序列5’ GGCTTGAGGAGACGGTGA 3’

長度: 18

Td=62.8℃

LEA5 Primer F1

序列5’ CATCTTGCGCAGCTCA 3’

長度: 22 Td=59.2℃

Primer F2

序列3’ CTCGTGCTATCTCGAACGGA 5’

長度: 20 Td=65.4℃

RT-PCR比較菌根及非菌根蝴蝶蘭植株根部基因表現量之差異

使用RT-PCR方法確定基因表現之試驗，以出瓶後栽培2個月之蝴蝶蘭大白花栽培種KC1111、大紅花栽培種V31之菌根及非菌根植株根部抽取所得之總RNA作為模版。以One Step RT-PCR Kit(GeneMark)進行基因表現量分析，RNA模板每個反應 (50 µl)加入2 µg總核酸，上游及下游Primer各0.2 µg。第一股cDNA合成條件為50℃30 分鐘後置入94℃2分鐘中止只酵素反應。第二股DNA合成及PCR放大條件為，每循環94℃ 30秒，55℃30秒，72℃30秒，共35個循環。PCR之產物以1﹪之agrose進行電泳分析，以陳虹樺教授研究室所提供之蝴蝶蘭細胞結構蛋白actin9，作為常態性表現之對照，用以比較菌根及非菌根蝴蝶蘭植株根部基因表現之差異。

結果與討論

在蝴蝶蘭大白花栽培種 KC1111 及大紅花栽培種 V31，出瓶時接種蘭菌，經二個月及四個月之栽培後，以抑制性扣減雜合技術(Suppression Subtractive

Hybridization，SSH)，將差異性表現基因放大之試驗中，其 SSH 產物經二次 PCR 放大後，以1％agrose 進行電泳，所得到之蝴蝶蘭菌根及非菌根植株之差異性表現基因長度，呈片狀連續分布(圖 1-8)。選取其中長度約 500-1500 bp 之基因片段進行純化粹取，以之建立SSH 次基因庫。由此次基因庫，挑選出之 768 個菌落，經送至基龍米克斯公司進行定序。定序後所獲得之基因片段序列，經BLASTx 比對分析，得到6 個與其他高等植物 cytochrome P450 monooxygenase、G2 pea dark accumulated gene (GDA2 protein)、pectinesterase、Phaseolus vulgaris

pathogenesis-related protein (PVPR3)、glutaredoxin (GRX)、Late embryogenesis abundant protein 5 (LEA5)等抗病、抗抗逆境相關基因有極高相似度之基因，在菌根及非菌根蝴蝶蘭根部有差異性表現，其相似度見表一。其中Identities 表示二基因間胺基酸序列相同之比例，而Positives 表示胺基酸功能相同之比例。在植物體中，

部份胺基酸之序列可能不同，但這些胺基酸在蛋白質中之功能應為一致。

Cytochrome P450 monooxygenase 為一與植物抗逆境物質之生成有密切關係之基因，其表現量增加可提高植物在逆境中之存活能力(Wellesen 等氏，2001；Emre 等氏，2007)。

GDA2 是一與 G2 豌豆(Pisum sativum L.)短日照條件下不衰老現象緊密相關的 基因之一(Li 等氏，1998)。

Pectinesterase，為催化果膠的甲氧酯水解產生果膠酸和甲醇之酵素，可將植物細胞壁之果膠分解成小分子片段，誘導植物之抗病機制啟動(Machinandiarena 等氏，2005)，在馬鈴薯(potato)栽培的過程中，接種雙核絲核菌(Binucleate

在文檔中蝴蝶蘭栽培技術之改良及菌根之應用 (頁 53-113)

第二章、 植物生長物質在蝴蝶蘭的生長與開花上之應用

第二節 圖表…

10

X

10

X 10

X

10

X

10

X 10

X

A

C

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X

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X 10

X

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X

10

X 10

X

A

C

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X

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X 10

X

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X

A

C

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X

10

X 10

X

10

X

A

C

mRNA純化

SSH次基因庫建立

RT-PCR之Primer設計

RT-PCR比較菌根及非菌根蝴蝶蘭植株根部基因表現量之差異

第二章、植物生長物質在蝴蝶蘭的生長與開花上之應用

第二節圖表…