蘭菌接種可增加抗軟腐病能力

第一章、蝴蝶蘭菌根之效益

第二節、蘭菌接種可增加抗軟腐病能力

蝴蝶蘭病蟲害種類繁多，其中細菌性軟腐病的發生常常造成蘭園的重大損 失。在台灣引起蝴蝶蘭軟腐病的病原為 Erwinia chrysanthemi (Fu 和 Huang，2011；

Wu 等氏，2010)。此病菌主要的傳播方式為藉由傷口侵入組織，此外也可經澆水、

施肥、修剪葉片而造成二次感染。Erwinia chrysanthemi 感染蝴蝶蘭後會造成植物 組織軟腐，使得整個植株喪失經濟價值。所以軟腐病在蘭花產業是急待解決的嚴重病害。

蘭花菌根真菌(Orchid mycorrhizal fungi , OMF)除了可促進磷和氮的吸收，進而增快植物的生長之外，許多的研究報告也證實菌根真菌也可以幫助植物抵抗乾旱 (Koske 等氏，1997)、鹽害(Rosendahl 和 Rosendahl，1991)、以及可進行生物防治的功效。利用菌根真菌可在許多植物引起系統性的抗性，如番茄(Cordier 等氏，

1998)、蠶豆(Rabie 等氏， 1996)、小麥(Khaosaad 等氏，2007)以及香蕉(Etsen 等氏，2008)。而此抗性主要是引起植物的誘導性系統抗性(induced systemic resistance, ISR) (Heil 和 Bostock，2002)。

此外由於在第一節的研究中，發現接種蘭菌的蝴蝶蘭菌根植株，除生長勢較佳外，亦較不易得到軟腐病等蘭花常見病害。故本研究以主動接種軟腐病病原菌 Erwinia chrysanthemi 的方法，來確認接種蘭菌的蝴蝶蘭菌根植株，其抗軟腐病能 力是否確有增加，並探討其可能機制。

材料與方法 研究材料

本試驗之植物材料為目前業界蝴蝶蘭外銷主力品種，大白花蝴蝶蘭 KC1111 (Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’)及大紅花蝴蝶蘭 V31

(Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31')，來源為牛記花卉農場或金車生物科技所生產 之瓶苗。出瓶時分別接種 Rhizoctonia spp. (R02)及(R04)菌種，以高溫消毒過之智利 水苔栽培，栽種於28/23^oC 日/夜溫、光照強度 80 µmol·m^-2·s^-1，每日12 小時光週期，相對濕度70%的植物生長箱環境。植株每週以 200 mg·L^-1之Peters

(20N-8.6P-16.6K)水溶性肥料(Scotts, Marysville, Ohio)灌溉一次。

軟腐病病原菌培養

本試驗使用之軟腐病原菌 Erwinia chrysanthemi 由成功大學黃浩仁教授研究室 提供，於25℃條件下，培養於酵母抽出物培養基(yeast extract peptone, YEP)，隔夜培養並調整至OD600 = 1.0，(約 9 X 10⁷ CFU)(Tsai et al., 2007)以之做為人工主動接種之原液。

蘭菌製備

選用馬鈴薯抽出物洋菜培養基( Potato Dextrose Agar; PDA)作為菌種繼代用的固體培養基。將菌種繼代至PDA 固體培養基後，置於 25℃黑暗處生長 5-7 天，待已純化之菌絲長滿培養皿，即可作為菌種生產之母源；將此固體培養基切成小塊，

放入2.5%安佳脫脂奶粉培養液中震盪培養，可作為製作固體菌種時的液態菌種來源。另將水苔浸泡於水中三天，每天換水一次，使其脫酸，再將已脫酸之水苔放

入洗衣網內，置於脫水機脫水約2 分鐘取出，待風乾或放入烘箱烘乾後，將乾燥

之水苔以粉碎機研磨1~2 秒，使成粉狀，再將 2.5%安佳脫脂奶粉培養液與水苔粉末以1:8 之比例混合，分裝至太空包內經高溫高壓滅菌，接種蘭菌靜置生長後，即成固體菌種(李，2001)。

蘭菌接種

植株購入後，在組培苗出瓶，分別進行接種蘭菌之工作，接種後將進行菌根顯微鏡檢測，以確認接種菌根之成長。先將植株自原有的容器中取出，清除根部附著的培養基或水苔介質，將0.2 克菌種水苔包埋根部或塞入靠近根部附近，將其介質包附於植株根部周圍後，完成裝盆的動作。本試驗分別接種由張喜寧教授實驗室自行分離並經純化、鑑定、致病性分析等步驟之R02 及 R04 菌種，此二種菌 種皆為絲核菌屬 Rhizoctonia spp.，其中 R02 為雙核絲核菌，R04 為多核絲核菌(蔡，

1997)，其等已經過該研究室試驗，證實確實有利於蘭株生長，另以無接種蘭菌植株作為對照組。

菌根植株檢測

本試驗所有菌根樣本皆以張喜寧教授研究室所發展出之螢光顯微鏡快速檢驗法(李，私人聯繫) 。將蝴蝶蘭根部，徒手切片後，直接放置於波長 260 nm 之螢光顯微鏡下作觀察，檢驗確認確實為菌根植株後方進行採樣。

軟腐病病原菌 Erwinia chrysanthemi 接種

1、 Erwinia chrysanthemi 的最佳接種濃度測定，取 OD600 = 1.0 之菌液做為原液(約 9 X 10⁷ CFU)，以無菌水進行連續稀釋 (從 1 x 10^-2~1 x 10^-7)，於有蘭菌共生的 Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111) 和 Phalaenopsis Tai Lin Redangel ‘V31’ (V31)蝴蝶蘭葉片上，以針頭穿刺形成孔洞，每個孔洞間間距必須大於2 cm。取稀釋後之菌液，以 Tip 吸取 10 µl，分別注射入不同孔洞中，

每個接種濃度重複5 次，並將蘭花植株，以塑膠袋密封，置於 28/23 ℃ 日/夜溫，

相對溼度70％，光度 80 µmol·m^-2·s^-1之生長箱中，培養24 小時後，比較其所形成之水漬狀組織直徑，並記錄結果。

2、利用 1 x 10^-1以及1 x 10^-3這兩種濃度進行接種，每個接種濃度皆重複10 次。

接種後24 小時觀察其病徵的發展情況，比較其所形成之水漬狀組織直徑。

結果與討論

Erwinia chrysanthemi 菌液經連續稀釋後(從 1 x 10^-2~1 x 10^-7)之試驗結果 (圖 1-4, 1-5)。在部分植株上可觀察到接種蘭菌的植株，感染軟腐病菌後所形成的水漬狀組織直徑比對照組來的小，但經統計後皆無顯著差異(表 1-1)，可能是樣本數不夠所造成之誤差。但從此次實驗得知，較高的接種濃度可觀察到較明顯的抗性。

所以接著利用1 x 10^-1以及1 x 10^-3這兩種濃度進行接種，每種濃度皆重複10 次。

接種後24 小時觀察其病徵的發展情況，以及測量所形成之水漬狀組織直徑(圖 1-6, 1-7)。結果顯示 V31 接種 R02 之後可增加對於軟腐病菌的抗性，接種 R04 則沒有抗性產生(表 1-2)。另一面接種 R04 之 K C1111 菌根植株接種高濃度的軟腐病菌(1 x 10^-1)後有明顯的抗性產生，但接種 R02 之 K C1111 菌根植株並沒有抗性產生。顯示出抗性的產生，必須要有特定的蘭菌與其共生蘭花的組合。

由於接種蘭菌後會加速植物的生長，所以菌根植株對於軟腐病菌所產生的抗性，是由於蘭菌的共生使得植株的抗病性狀態提升，所以有比較好的抗性，或是蘭菌感染後植物會產生抗細菌的物質，目前還未有進一步的了解。不過根據Wulf (2003)的報導，菌根菌感染苜蓿植株後確實會誘導抗生物性以及非生物性逆境的相關基因，而在蘭花上目前還未有任何的報導。

結論

利用二種蘭菌 R02 以及 R04 感染 KC1111 和 V31 蝴蝶蘭，形成蘭菌根植株後再接種不同濃度的軟腐病菌菌液，觀察其水漬狀組織直徑。發現R02 可增加 V31 對於軟腐病菌的抗性，而R04 可增加 KC1111 對於軟腐病菌的抗性。且此抗性的產生有蘭菌與其共生蘭花組合的專一性。

第二節圖表

圖1-4、蝴蝶蘭大紅花栽培種 Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'接種軟腐病菌 (Erwinia chrysanthemi) 24 小時候後病徵的發展情況(1 x 10^-2~1 x 10^-7)。(A)經序列稀釋後取10ul 的菌液利用微球管接種在葉片的傷口上、(B)沒有蘭菌感染的對照組、

(C)R02 感染的植株、(D) R04 感染的植株。

Figure 1-4. Soft rot development on leaves of Phalaenopsis Tai Lin ‘Redangel ‘V31’

(V31) inoculated with Erwinia chrysanthemi after 24 h of inoculation (1 x 10^-2~1 x 10^-7).

(A) 10 µl each of series diluted Erwinia chrysanthemi inoculum was applied directly onto the wounding site with a micropipette; (B) non-micorrhizal fungi infected control;

(C) Rizoctonia isolates R02 infected; (D) Rizoctonia isolates R04 infected.

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圖1-5、Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111) 接種軟腐病菌 (Erwinia chrysanthemi) 24 小時候後病徵的發展情況(1 x 10^-2~1 x 10^-7)。(A)經序列稀釋後取10ul 的菌液利用微球管接種在葉片的傷口上、(B)沒有蘭菌感染的對照組、

(C)R02 感染的植株、(D) R04 感染的植株。

Figure 1-5. Soft rot development on leaves of Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111) inoculated with Erwinia chrysanthemi after 24 h of inoculation (1 x 10^-2~1 x 10^-7). (A) 10 µl each of series diluted Erwinia chrysanthemi inoculum was applied directly onto the wounding site with a micropipette; (B) non-micorrhizal fungi infected control; (C) Rizoctonia isolates R02 infected; (D) Rizoctonia isolates R04

infected.

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圖1-6、Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'接種軟腐病菌(Erwinia chrysanthemi) 24 小時候後病徵的發展情況(1 x 10^-1及1 x 10^-3)。(A)經序列稀釋後取 10ul 的菌液利用微球管接種在葉片的傷口上、(B)沒有蘭菌感染的對照組、(C)R02 感染的植株、(D) R04 感染的植株。

Figure 1-6. Soft rot development on leaves of Phalaenopsis Tai Lin ‘Redangel ‘V31’

(V31) inoculated with Erwinia chrysanthemi after 24 h of inoculation (1 x 10^-1and 1 x 10^-3). (A) 10 µl each of series diluted Erwinia chrysanthemi inoculum was applied directly onto the wounding site with a micropipette; (B) non-micorrhizal fungi infected control; (C) Rizoctonia isolates R02 infected; (D) Rizoctonia isolates R04 infected.

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C

表1-1、蝴蝶蘭栽培種 Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'、Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111)軟腐病徵的發展。軟腐病徵的發展為測量其水浸狀組織的直徑。

Table 1-2. Soft rot development in orchid mycorrhizal fungi (OMF) inoculated Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31' and Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111). Soft rot development was characterized by forming clear circle zone.

Erwinia chrysanthemi conc. (OD600)

10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 Orchid

cultivar Treatment^x

Clear circle zone (mm)^y

NM 6.0a 5.4a 3.8a 3.0a 2.0a 0 R02 5.0a 3.2a 2.6a 2.2a 1.0a 0 V31

R04 4.6a 4.0a 1.8a 1.0a 0.4a 0 NM 8.6a 8.0a 5.6a 3.8a 1.4a 0.7a R02 9.0a 7.0a 5.8a 4.6a 2.4a 0.6a KC1111

R04 8.3a 7.3a 5.5a 4.3a 1.5a 1.1a

zFive replicates were tested for each treatment

yMeans are signified in each column followed by different letter at 5 % significant level as determined by Duncan’s multiple range test.

xNM:non- mycorrhiza. R02 and R04: inoculated with Rizoctonia isolates R02 and R04.

表1-2、蝴蝶蘭栽培種 Phalaenopsis Tai Lin Redangel 'V31'、Doritaenopsis Taisuco Wonder ‘King Car Butterfly’ (KC1111)軟腐病徵的發展。軟腐病徵的發展為測量其水浸狀組織的直徑。

Erwinia chrysanthemi conc. (OD600)

10^-1 10^-3

Orchid

cultivar Treatment^x

Clear circle zone (mm)^y

NM 7.0a 4.1a

R02 4.3b 2.2b

V31

R04 6.0a 3.2a

NM 6.9a 3.9a

R02 6.4ab 4.2a

KC1111

R04 5.7b 3.2a

zTen replicates were tested for each treatment

yMeans are signified in each column followed by different letter at 5 % significant level as determined by Duncan’s multiple range test.

xNM:non- mycorrhiza. R02 and R04: inoculated with Rizoctonia isolates R02 and R04.

第三節接種蘭菌之蝴蝶蘭其抗病機制探討

前言

由以上章節可見，蘭菌對蘭科植物之生長確有其影響，但是在機制方面還有很大的空間去探討；為了要讓蘭菌在蝴蝶蘭產業化過程中能發揮功能，其促進蝴蝶蘭生長、抗逆境甚或開花的生理及基因分子層次的相關資料，成為其推廣不可或缺的條件。由於蝴蝶蘭並無完整的基因庫可供應用，若要瞭解接種蘭菌究竟誘發了那些基因，抑制性扣減雜合技術(suppression subtractive hybridization, SSH) (Lukyanov等氏，2007；Diatchenko等氏，1996; von Stein等氏，1997)將是一種好的方法；它將標準化(normalization)及扣減(subtraction)合併於一步驟完成，避免數量少的訊息在過程中遺失，如果再加上抑制性PCR法(suppression polymerase chain reaction)，則可加強微量表現的cDNA，此類序列可被加強1000倍以上(Diatchenko 等氏，1996) ，能夠減低因不同基因之間RNA量的不同所造成的干擾，並且大幅度提高了偵測差異表現的RNA之靈敏度，因此實為相當有效之利器。SSH之做法為，取實驗組RNA製成Tester cDNA，取對照組RNA製成Driver cDNA後，將Tester cDNA分成兩組，分別接上不同的adpator，再分別以大量的同一組Driver進行第一次的hybridization。經過此步驟可將不同的RNA的量標準化(normalization)，之後再將兩組接上不同adaptor的Tester cDNA混合後，加入新鮮的Driver cDNA 進行第二次的hybridization。在此步驟中，帶有不同adaptor的同一個基因之ssDNA將會黏合，

形成帶有兩種adaptor的dsDNA。最後再利用根據adaptor設計的Primer進行PCR，此時帶有同一種adaptor的cDNA會因為兩端的adaptor互相黏合而無法被PCR放大

（Suppression PCR），因此能夠被放大的皆是具有差異表現情形且帶有不同adaptor 的cDNA，選殖這些cDNA進行定序後，則可得到具有差異表現情形的基因。

在文檔中蝴蝶蘭栽培技術之改良及菌根之應用 (頁 48-0)

第一章、 蝴蝶蘭菌根之效益

第二節、 蘭菌接種可增加抗軟腐病能力

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第一章、蝴蝶蘭菌根之效益

第二節、蘭菌接種可增加抗軟腐病能力