第二型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus) 為主要的糖尿病類型，約佔所有糖尿 病患的 90 %，其主要導因於胰臟中的 β 細胞分泌胰島素量減少及胰島素阻抗性 增加，然而罹病率隨著年齡的增加而增加，意謂著第二型糖尿病和老化在細胞生 理學上有些關聯性及相似性，老化常伴隨著葡萄糖代謝異常，造成體內葡萄醣濃 度升高及初期代償反應高胰島素現象，研究顯示血糖及胰島素濃度增加時，會直 接刺激體內自由基的生成及降低抗氧化的能力，而這些自由基經由不同的途徑產 生成不同的自由基，包括經由 nicotine adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase 生成的超氧化物 (superoxide, O2
－)、葡萄糖氧化反應產生的氫氧自由基 (hydroxy radical, OH) 及經由一氧化氮合成酶 (nitric oxide synthase, NOSs) 所產 生的一氧化氮 (NO) 和過氧亞硝基陰離子 (ONOO－)。胰臟中的 β 細胞抗氧化能 力較弱，對自由基相當敏感而容易被破壞進而減少胰島素的分泌，更加重糖尿病
的病情，高血糖誘發自由基的生成及降低抗氧化的能力，而自由基破壞β 細胞分
泌胰島素的功能及增加糖尿病併發症發生的機率，因此氧化壓力 (oxidative stress) 及糖尿病之間是互為因果也是惡性循環。
由於人體周邊組織之胰島素是第二型糖尿病的主要成因，本實驗利用細胞激 素 (TNF-α) 誘發小鼠肝臟細胞株產生胰島素阻抗之模式，配合葡萄糖攝入技術以 評估甘薯葉乙醇萃取物改善胰島素阻抗之效果、測定胰島素訊息傳遞相關蛋白質 表現量，並提出甘薯葉乙醇萃取物改善肝臟細胞胰島素阻抗之可能機制。
二、實驗材料 (一)原料
同第四章二、之 (一) 。 (二)實驗細胞
小鼠肝臟上皮細胞 FL83B 購自 American Type Culture Collection (ATCC，
Rockville, MD, USA)。
解凍之後 FL83B 細胞每二至三天固定進行一次繼代培養。去除舊的培養基 後，利用 PBS (Phosphate-buffered Saline) 溶液清洗細胞表面，再以胰蛋白酶 (Trypsin) 作用從培養皿底面切下細胞，加入培養液 (F-12K+ 10 % FBS) 打散並懸
1. Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Bovine serum albumin (BSA)、Insulin、NaOH、3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- iphenyltetrazolium bromide (MTT reagent)、dimethyl sulfoxide (DMSO)、sodium bicarbonate (NaHCO3)、phenol red、potassium chloride (KCl)、potassium
dihydrogen phosphate (KH2PO4)、sodium chloride (NaCl)、sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)、nutrient mixture F12 Ham Kaighn’s modification (F12K) medium、HEPES、Ammonium persulfate (APS)
2. Gibco BRL (NY, USA) Fetal bovine serum (FBS) 3. JRS (Lenexa, KS, USA)
Trypsin
4. Invitrogen (Eugene, Oregon, USA)
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG) 5. Merck KgaA (Darmstadt, Germany)
Tween-20
6. J.T. Baker (New Jersey, USA) Sodium dodecyl sulfate (SDS) 7. Millipore (Billerica, MA, USA)
Anti-GLUT-2 antibody、ECL 8. Gene Tex (Irvine, CA, USA)
Anti-actin
9. Bio-Rad Laboratories (Richmond, VA, USA) Bio-Rad protein assay dye reagent
10. Cell signaling Technology (Danvers, MA, USA) Anti-IR、anti-IRS-1
11. Riedel-de Haën (Seelze, Germany) Sodium fluoride (NaF)
(四)實驗樣品配製
1. Phosphate Buffered Saline (PBS)
8 g NaCl/ 1.15 g Na2HPO4 2 H2O/ 0.2 g KH2PO4/ 0.2 g KCl / 1 L 去離子水 2. KRB buffer (Krebs-Ringer Biocarbonate buffer)
6.9 g NaCl/ 2.1 g NaHCO3/ 0.163 g KH2PO4/ 0.35 g KCl/ 0.28 g CaCl2 2 H2O/
0.29 g MgSO4 7H2O/ 3.574 g HEPES/ 1 % Albumin/ 1 L 去離子水調 pH 至 7.3 3. Nutrient mixture F12 Ham Kaighn’s modification (F12K) medium
F-12K medium/ 10 % FBS/ 2.5 g NaHCO3/ 1 L 去離子水調整 pH 至 7.3 4. MTT reagent
2 mg MTT/ 1 ml 去離子水 5. Insulin reagent
1000 nM insulin
6. 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG reagent)
200 μM 2-NBDG reagent 7. Lysis buffer
1.2114 g Tris/ 0.37224 g EDTA/ Triton X-100 5 ml/ 0.5 g SDS/ 0.20995 g NaF/ 11. Ammonium persulfate, APS, 10 %
取 0.1 g APS 溶於 1 ml 去離子水中，需新鮮配製 14. PBS (phosphate buffer saline) 5×
38 g NaCl/ 7.8 g NaH2PO4，pH 調整至 8.3 加去離子水定量至 1 L 15. PBST (phosphate buffer saline and Tween 20)
PBS 5× 稀釋至 1×，加入 0.05 % (v/v) Tween 20，即成為 PBST (五)儀器設備
1. 天平 (Balances) (HR-200,A&D,USA)
2. 高速離心機 (Centrifugator) (Sorvall RC 5C,DuPONT,CT,USA) 3. 培養箱 (CO2 incubator) (Model TC2323,SHEL LAB, Tokyo, Japan) 4. 無菌操作台 (Larminar flow) (造鑫，臺北，台灣)
5. 倒立式顯微鏡 (Inverted microscope) (Eclipse TE300, Nikon, Tokyo, Japan) 6. 吸管輔助器 (pipette-aid) (Matrix, Themo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA,
USA)
7. 流式細胞儀 (Flow cytometry) (FACScan, Becton Dickinson, USA) 8. 光譜分析儀 (ELISA) (EPOCH, Bioteck, USA)
9. 純水製造機 (Milli-Q ultrapure water system) (Millipore, Bedford, MA, USA) 10. 高壓滅菌釜 (Autoclave) (HL-341, 雙鷹，臺北，台灣)
11. 迴轉震盪器 (Orbital Shaker) (TS-500，祥泰，臺北，Taiwan) 12. 桌上型離心機 (Centrifugator) (Sorvall RC 5C, DuPONT, CT, USA) 13. 電源供應器 Power Supply (Hercules 200, EZlan, Taipei, Taiwan) 14. 電源供應器 Power Supply (Bio-Rad, USA)
15. PVDF 轉印膜 (Millipore, Billerica, MA, USA) 16. UVP 冷光照膠系統 (Level, Cambridge, UK)
17. 迷你電泳槽 Mini-PROTEIN Tetra Cell, 1.5 mm, 4 Gel (Bio-Rad, USA) 18. 膠片鑄膠架 Casting Frame (Bio-Rad, USA)
19. 免疫轉印槽 Transfer Tank (Mini Compact Electro-blotting Unit V10-EB10, Scie-Plas, UK)
三、實驗方法
ml PBS，利用流式細胞儀進行分析，依螢光強度大小來判別細胞攝入葡萄糖多寡，
泳槽) ，將多孔性海綿、3M 濾紙、PVDF membrane、SDS-PAGE 膠片、3M 濾 紙、多孔性海綿依序鋪上，並小心避免任何氣泡之產生，即完成轉印三明治之組 合。隨後，將卡匣組合放入轉印槽中，使 SDS-PAGE 膠片面朝向負極，PVDF 膜 朝向正極，並除去卡匣外之氣泡，以避免轉印效率降低。於 4 ℃ 下以 400 mA 之 條件進行轉印 75 分鐘。此外，進行蛋白質轉印時，於電泳過程中加入 5 μl prestained protein marker 作為轉印效率之參考。
3. 酵素免疫染色
將轉印完成之 PVDF membrane 浸於 5 % 脫脂奶 (溶於 PBST 中) ，置於室 溫中 blocking 1 小時，以阻斷非專一性抗原反應；之後以 PBST 清洗三次，每 次 15 分鐘，接著再加入一次抗體 (以 PBST 稀釋至適當之倍率，參照下表) 於 4 ℃ 反應隔夜；倒去一級抗體後，以 PBST 清洗三次，每次 15 分鐘，接著再 以 PBST 稀釋鍵結 HRP 之二級抗體 (稀釋倍率參照下表) ，以相同方式作用於 PVDF membrane 1 小時後，以 PBST 清洗三次，每次 15 分鐘。最後以 ECL 方 式呈色，利用 UVP 冷光照膠系統照膠，得知雜合反應結果。
一級及二級抗體使用之濃度
Primary Ab Secondary Ab kDa
Anti-Actin (1:4000) Anti-Rabbit (1:10000) 42 Anti-GLUT2 (1:1000) Anti-Rabbit (1:10000) 57 Anti-IR (1:1000) Anti-Mouse (1:10000) 95 Anti-IRS1 (1:1000) Anti-Rabbit (1:10000) 180
(六)統計分析
每項試驗皆三重複，所得結果以 SAS 9.0 軟體進行統計分析，實驗數值以平均 值 ± 標準偏差 (mean ± SD)表示，利用 ANOVA 變異數分析檢定各處理間之差 異，以鄧肯氏多變域顯著性測試 (Duncan’s multiple range test) 做顯著差異比較，
p ＜ 0.05 表具有顯著差異。
四、結果與討論
(一)不同品種甘薯葉之乙醇萃取物對 FL83B 細胞生長存活率 (cell viability) MTT 溶液 (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide) 為 黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈，在 性。取濃度 100、200、400、800、1000 μg/ml 之不同品種甘薯葉乙醇萃取物，
直接添加於已培養 24 小時之 FL83B 細胞培養液中，於 37 ℃、5 % CO2 環境
島素阻抗細胞模式及葡萄糖攝入實驗，以瞭解甘薯葉乙醇萃取物改善胰島素阻抗 其對胰島素阻抗型 FL83B 細胞葡萄糖攝入之影響。TNF-α、interleukin-1 (IL-1)、
interleukin-6 (IL-6) 及 interferon-γ (IFN-γ) 等促發炎因數已證實與誘導胰島素阻 抗有關 (Iwata eat al., 2001; Senn et al., 2000; Shiba et al., 1998) 。
得到胰島素阻抗細胞之改善率 (amelioration ratio)，結果如表 5-2 表示。凍乾方面 以 CN 1927-16 及 CYY 98-59 對胰島素阻抗細胞其改善效果較好，與 TNF-α 處 理組比較，分別可提高 71.55 及 40.69 % 的葡萄糖攝入能力。
40 ℃ 乾燥部份可由表 5-2 發現，只有 TN 64 具有較好的改善效果，其他兩 個品種之改善能力和 TNF-α 無顯著差異。甘薯葉中富含的功效成份推測和人體
健康有很大的關係，其中像是提供蔬果天然顏色的花青素就被證實具有改善有糖 insulin-like grow factor (IGFs) 受器且其表現量隨著糖尿病相關的並發症而影響，
像是肝癌、胰臟癌 (Dearth et al., 2007)。此外，當 IRS-1 受到胰島素刺激時，會 有多個位置被磷酸化，其中包含 P85、Grb2、Nck、Crk、Fyn、Syp 及 SHP2 (Taniguchi et al., 2006)，或是 IRS-1 多處的 serine/threonine phosphorylation 將抑 制 tyrosine phosphorylation，進而阻斷胰島素訊息的傳遞 (Moeschel et al., 2004)。
研究之出，若將脂肪細胞、肝臟細胞中的 IRS-1 基因剔除，會造成胰島素阻抗，
(Benito, 2011)。本實驗結果顯示，FL83B 細胞經 20 ng/ml TNF-α 誘導後其 IRS-1
化 (tyrosyl phosphorylation)，並活化下游之訊息分子而調節體內葡萄糖之平衡 (White, 2003; Zick, 2001)。
圖 5-3 為不同品種甘薯葉乙醇萃取物對 TNF-α 處理之 FL83B 細胞胰島素
3. 葡萄糖轉運蛋白 (glucose transporter, GLUT)
目前發現至少已有 12 種葡萄糖轉運蛋白 (glucose transporters, GLUTs) 在
因葡萄糖刺激所產生的胰島素分泌過程中，GLUT-2 所扮演的是一種葡萄糖調控 者的角色。本實驗結果顯示，FL83B 細胞經 20 ng/ml TNF-α 誘導後其 GLUT-2 之表現量與正控制組比較之下量並無顯著差異，其明確機轉有待探討。
表 5-1、不同品種甘薯葉乙醇萃取對 FL83B 細胞之細胞存活率
Table 5-1．Effects of 70 % ethanol extracts from leaves of different sweet potato cultivars on the cell viability of FL83B cells
A Values are percentage relative to control value (100 %).
Each value is means ± SD (n=4).
Cell viability (%) = (Sample group- Blank group)/ (Control group- Blank group) × 100
%
100 200 400 800 1000 100 200 400 800 1000
CN 1927-16 108.94 103.35 102.42 103.75 96.28 98.71 103.41 105.46 108.00 104.09 TN 64 101.13 98.82 102.31 93.67 95.01 97.75 99.68 99.86 100.84 106.79 CYY 98-59 94.19 105.93 103.54 96.15 101.13 102.13 107.95 105.02 104.92 101.59
40 ℃ dried (μg/ ml) Lyophilization (μg/ ml)
Cell viability (%)
表 5-2、不同品種甘薯葉乙醇萃取物 (1 mg/ml) 對具胰島素阻抗性 FL83B 細胞葡 萄糖攝入之改善情形
Table 5-2. Amelioration of 70 % ethanol extracts from leaves of different sweet potato cultivars (1 mg/ml) on glucose uptake in insulin resistance mouse liver FL83B cells
Rate of Amelioration (%) Lyophilized (%) 40 ℃ dried (%) CN 1927-16 43.84 ± 12.02AB 10.66 ± 0.70a
TN 64 17.26 ± 4.24C 57.72 ± 2.14b CYY 98-59 46.25 ± 1.41A 7.35 ± 14.14a Each value is expressed as mean ± SD (n = 3).
Mean with different letters significantly different (p < 0.05).
Rate of Amelioration (%) = [(Fluorescence intensity of sample - Fluorescence intensity of T+I)/ Fluorescence intensity of T+I] × 100 %
Insulin (1000 nM) - + + + + + TNF-α (20 ng/ml) - - + + + +
圖 5-1、不同品種冷凍乾燥處理甘薯葉之乙醇萃取物 (1 mg/ml) 對具胰島素阻 抗 FL83B 細胞葡萄糖攝入之影響。
Figure 5-1. Effect of 70 % ethanol extracts from leaves of different sweet potato cultivars (1mg/ml) on glucose uptake in insulin resistant mouse liver FL83B cells.
Each value is expressed as mean ± SD (n = 3).
Mean with different letters significantly different (p < 0.05).
B: cells incubated with F-12K medium.
I: cells incubated with F-12K medium containing 1000 nM insulin.
T+I: TNF-α induced for insulin resistance.
CN-F: lyophilized of 70 % ethanol extract CN 1927-16, dissolved in PBS buffer.
TN-F: lyophilized of 70 % ethanol extract TN 64, dissolved in PBS buffer.
CYY-F: lyophilized of 70 % ethanol extract CYY 98-59, dissolved in PBS buffer.
Insulin (1000 nM) - + + + + + TNF-α (20 ng/ml) - - + + + +
圖 5-2、不同品種 40 ℃ 乾燥處理甘薯葉之乙醇萃取物 (1 mg/ml) 對具胰島 素阻抗 FL83B 細胞葡萄糖攝入之影響。
Figure 5-2. Effect of 70 % ethanol extracts from leaves of different sweet potato cultivars (1mg/ml) on glucose uptake in insulin resistant mouse liver FL83B cells.
Each value is expressed as mean ± SD (n = 3).
Mean with different letters significantly different (p < 0.05).
B: cells incubated with F-12K medium.
I: cells incubated with F-12K medium containing 1000 nM insulin.
T+I: TNF-α induced for insulin resistance.
CN-40 ℃: 40 ℃ air-dried of ethanol extract CN 1927-16, dissolved in PBS buffer.
TN-40 ℃: 40 ℃ air-dried of ethanol extract TN 64, dissolved in PBS buffer.
CYY-40 ℃: 40 ℃ air-dried of ethanol extract CYY 98-59, dissolved in PBS buffer.
IR (95 kDa)
β- actin (42 kDa)
Insulin (1000 nM) - + + + + + + + + TNF-α (20 ng/ml) - - + + + + + + + Sample (1 mg/ml) - - - + + + + + +
圖 5-3、不同品種甘薯葉之乙醇萃取物 (1 mg/ml) 對具胰島素阻抗 FL83B 細胞胰 島素受器表現之影響。
Figure 5-3. Effect of 70 % ethanol extracts from leaves of different sweet potato cultivars (1mg/ml) on protein expression of insulin receptor (IR) in TNF-α induced insulin resistant FL83B cells.
Mean with different letters significantly different (p < 0.05).
IRS-1 (95 kDa)
β- actin (42 kDa)
Insulin (1000 nM) - + + + + + + + + TNF-α (20 ng/ml) - - + + + + + + + Sample (1 mg/ml) - - - + + + + + +
圖 5-4、不同品種甘薯葉之乙醇萃取物 (1 mg/ml) 對具胰島素阻抗 FL83B 細胞胰 島素受器受質蛋白質表現量之影響。
Figure 5-4. Effect of 70 % ethanol extracts from leaves of different sweet potato cultivars (1mg/ml) on protein expression of IRS-1 in TNF-α induced insulin resistant FL83B cells.
Mean with different letters significantly different (p < 0.05).
GLUT-2 (55 kDa) β- actin (42 kDa)
Insulin (1000 nM) - + + + + + + + + TNF-α (20 ng/ml) - - + + + + + + + Sample (1 mg/ml) - - - + + + + + +
圖 5-5、不同品種甘薯葉之乙醇萃取物 (1 mg/ml) 對具胰島素阻抗 FL83B 細胞葡 萄糖轉運蛋白質表現量之影響。
Figure 5-5. Effect of 70 % ethanol extracts from leaves of different sweet potato cultivars (1mg/ml) on protein expression of glucose transporter-2 (GLUT-2) in TNF-α induced insulin resistant FL83B cells.
Mean with different letters significantly different (p < 0.05).
五、結論
本試驗首先測定不同品種甘薯葉乙醇萃取物對小鼠肝臟 FL83B 細胞之細胞 毒性，再利用 TNF-α 誘導小鼠肝臟 FL83B 細胞株產生胰島素阻抗，並添加萃 取物共同培養以評估其對 FL83B 細胞葡萄糖攝入能力之影響。歸納結論如下：
三種品種甘薯葉乙醇萃取物，無論於濃度在 1000 μg/ml 以內時對細胞不具毒 性。有上述結果，將使用 1000 μg/ml 萃取物濃度進行胰島素阻抗細胞的葡萄糖 攝入試驗。
胰島素阻抗小鼠肝臟細胞之葡萄糖攝入結果顯示，TN 64 的 40 ℃ 風乾處理 組及 CN 1927-16 和 CYY 98-59 的凍乾處理組與控制組 (TNF-α 處理) 比較，
可明顯提升胰島素阻抗小鼠肝臟 FL83B 細胞葡萄糖攝入能力，改善胰島素敏感 性。而在西方轉印分析的試驗結果發現，三種品種甘薯葉乙醇萃取物對具胰島素 阻抗 FL83B 細胞胰島素受器、胰島素受器受質及葡萄糖轉運蛋白質表現量並無 顯著上的影響。因此，減輕胰島素阻抗促進葡萄糖攝入、對醣類代謝及改善發炎 反應的的詳細機轉，有待進一步試驗作探討。