第四章 結果與討論
4.1 ABTS ● + 與 benzenediol、benzenediamine、amionphenol 同分異構物
4.1.2 Aminophenol 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS ● + 反應
途徑有何影響。相對於 1,2-benzenediol 與 ABTS●+反應形成
1,2-benzoquinone [M-H2]，1,2-aminophenol 的 VESI-MS 質譜圖中除了 ABTS，另外有 m/z 110 [M+H]+、m/z 211、m/z 213 的訊號，但是並沒有 [M-H2+H]+離子(m/z 108)，顯示 1,2-aminophenol 較無法進行第二個氫原子 轉移生成[M-H2]，至於 m/z 211 和 m/z 213 化合物結構則尚待進一步分析。
不同於 1,2-aminophenol，1,4-aminophenol 反應液的 VESI-MS 質譜圖中可 以觀察到[M-H2+H+] (m/z 108)的訊號(圖 4-15)，有趣的是這個化合物於數 分鐘後即消失(圖 4-16)。1,3-aminophenol 反應液的 VESI-MS 質譜圖中則 有 m/z 110、310、379 和微弱的 m/z 620、m/z 622 (圖 4-15)，仔細觀察 圖 4-15 比較三種異構物的 VESI-MS 質譜圖，可以發現 1,3-aminophenol 具有最強的[M+H]+ (m/z 110)和最低的[ABTS+H]+ (m/z 515)訊號，顯示三 種異構物中，1,3-aminophenol 最不易還原 ABTS●+而有較多未反應物(M)，
造成反應液氣化游離時有較強的[M+H]+訊號。
圖 4-152.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M Aminophenol 三種異構物反應之 質譜圖：(A)反應前(ABTS●+)；(B) ABTS●+加入 1,2-aminophenol；(C) ABTS●+加入 1,3-aminophenol；(D) ABTS●+加 1,4-aminophenol
圖 4-16 m/z 108 之 EIC 圖
以 HPLC-UV 分析 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應液，顯示在滯留時 間 2.08、3.02、3.77、7.23、16.48 分時分別有化合物流出(圖 4-17)。
圖 4-17ABTS●+與 1,3-aminophenol 隨時間反應之層析圖
收集各個析出液進行 VESI-MS 分析，顯示滯留時間 2.08 分的析出液 出現 m/z 110 和 m/z 622 訊號(圖 4-18 )，分別來自[M+H]+及反應加成物 [(M+ABTS-H2)+H]+的訊號。滯留時間 3.02 分生成 m/z 379，強度隨反應 時間增加而增加；滯留時間 3.77 分生成 m/z 515([ABTS+H]+)；滯留時間 7.23 分生成 m/z 351，此訊號反應一開始時還未生成，但隨反應時間增加，
波峰訊號也越來越明顯；滯留時間 16.48 分為 m/z 620 [(M+ABTS-2H2)+H]+。
圖 4-18 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖：
RT= (A) 2.08、(B) 3.02、(C) 3.77、(D) 7.23、(E) 16.48 min。
再利用 UV-Vis 測定 ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應液，顯示一加入 1,3-aminophenol 後 ABTS●+馬上轉換成 ABTS(圖 4-19)，然後在 600 nm 附 近有新的波峰生成，隨著反應時間越長，這個波峰會藍位移到 500 nm 附 近。
圖 4-19ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應隨時間之 UV 變化圖
以 HPLC-DAD 分析 1,3-aminophenol 反應液(圖 4-20)，所得與 1,3-benzenediol 相似(圖 4-11)。
圖 4-20ABTS●+與 1,3-aminophenol 反應混合液之 HPLC-DAD 圖
ABTS●+與 1,2-aminophenol 反應液的 HPLC 層析圖顯示，在滯留時間 3.51 及 26.68 分時有兩根較明顯的訊號產生，另外滯留時間 2.6 分時也有 一根較小的訊號產生(圖 4-21)。
圖 4-21ABTS●+與 1,2-aminophenol 隨時間反應之層析圖
由 VESI-MS 質譜圖得知滯留時間 3.51 分的化合物為 ABTS，滯留時 間 2.60 及 26.68 分皆為 m/z 213(圖 4-22)，兩者的結構尚未探討。
圖 4-22ABTS●+與 1,2-aminophenol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖：
RT= (A) 2.60、(B) 3.51、(C) 26.68 min。
ABTS●+與 1,4-aminophenol 反應液的層析圖與 1,4-benzenediol 相似，
在滯留時間 2.48 及 3.85 分會有波峰生成(圖 4-23)，其中滯留時間 3.85 分 的析出液為 ABTS；滯留時間 2.48 分的波峰強度隨反應時間增加而增加，
但是化合物於 VESI-MS 操作下並沒有訊號生成，依據 1,4-benzenediol 的 研究結果判斷，2.48 分析出液的化合物應該是[1,4-aminophenol-H2]。
圖 4-23ABTS●+與 1,4-aminophenol 隨時間反應之層析圖
4.1.3 Benzenediamine 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS●+反應 若是將 benzenediol 上兩個-OH 都以-NH2取代，結果顯示
1,2-benzenediamine 和 1,3-benzenediamine 都有 ABTS 和[M+H]+ (m/z 109) 生成(圖 4-24)，相反的，1,4-benzenediamine 則生成一個中間產物 m/z108 (M●+)，這個自由基陽離子不穩定很快就消失(圖 4-25)，因為有 VESI-MS 進行線上即時偵測，才得以觀察到這個離子的生成。1,2-benzenediamine 與 1,2-benzenediol 不同，並沒有生成[M-H2]，而是生成 1,2-benzenediamine 的縮和聚合物[2M-2H2+H]+(m/z 213)和[2M-3H2+H]+ (m/z 211)，推斷自由 基聚合反應抑制了 1,2-benzenediamine 生成[M-H2]，也減少 ABTS 的生成。
文獻報導 1,2-benzenediamine 溶液在光照下會生成聚合物[2M-2H2]和 [2M-3H2]，不過我們發現這種變化在反應液中加快許多，這與已知這個 反應是由光照引起的自由基聚合反應一致，也就是 ABTS●+加速了聚合反
應的進行。
1,3-benzenediamine 則與 1,3-benzenediol 一樣會有加成物 [M+ABTS-H2+H]+ (m/z 621)和[M+ABTS-2H2+H]+ (m/z 619)生成。
圖 4-242.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M benzenediamine 三種異構物反應 之質譜圖：(A)反應前 ABTS●+；(B) ABTS●+加入 1,2-benzenediamine；(C) ABTS●+加入 1,3-benzenediamine；(D) ABTS●+加 1,4-benzenediamine
圖 4-25 m/z 108 之 EIC 圖
ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應液的 HPLC 層析圖(圖 4-26)在滯留 時間 2.05、2.56、4.82、7.01、8.19、25.61 分有訊號產生，其中滯留時間 8.19 及 25.61 分訊號隨反應時間增加而增加，而滯留時間 2.56 分訊號是 隨反應時間增加而減少。
圖 4-26ABTS●+與 1,3-benzenediamine 隨時間反應之層析圖
滯留時間 2.05 分析出液的化合物為 1,3-benzenediamine，在滯留時間 2.56 和 8.19 分析出液的 VESI-MS 皆生成 m/z 621；滯留時間 7.01 分為 ABTS；在滯留時間 25.61 分為 m/z 619(圖 4-27)。為了能得到最佳的分離 效果，這個實驗所用的 HPLC 分析方法與分析 aminophenol 反應液並不相 同，因此 ABTS 的滯留時間與圖 4-17 所顯現的不同。
圖 4-27ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖：
RT= (A) 2.05、(B) 2.56、(C) 7.01、(D) 8.19、(E) 25.61 min。
以 VESI-MS 分析 HPLC 層析圖中 25.61 分的析出液，所得為
[M+ABTS-2H2+H]+ (m/z 619)，8.19 分的析出液為[M+ABTS-H2+H]+ (m/z 621)，2.05 及 8.19 分析出液的波峰面積隨著時間增加而減少，相反的 25.61 分析出液的波鋒面積隨著反應時間增加而增加(圖 4- 28)，顯示隨著反應 時間的增加，加成物會進行進一步脫氫反應，這現象並沒在
1,3-benzenediol 和 1,3-aminophenol 反應液中發生。
圖 4- 28m/z 621、m/z 619 趨勢圖
ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應液的 UV-Vis 圖則顯示，當
1,3-benzenediamine 加入後，ABTS●+會快速地轉換成 ABTS(圖 4-29)，在 500 nm 附近產生新的吸收峰，而吸收度隨時間增加增強。
圖 4-29ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應隨時間之 UV 變化圖
進一步將反應液以 HPLC-DAD 分析，可以發現上述 500 nm 附近產 生的新吸收峰可能是[M+ABTS-2H2]或[M+ABTS-H2]化合物(圖 4-30)，兩 者的 UV 圖沒有顯著差別，因此圖 4-29 中 550 nm 附近波峰的吸收值於
反應 120 分鐘較 90 分鐘弱，可能來自[M+ABTS-2H2]的莫爾吸收度較 [M+ABTS-H2]小所導致。
圖 4-30 ABTS●+與 1,3-benzenediamine 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 ABTS●+與 1,2-benzenediamine 反應液的 HPLC 層析圖(圖 4-31)在滯留 時間 4.03、8.71、11.16 分有訊號產生。
圖 4-31ABTS●+與 1,2-benzenediamine 隨時間反應之層析圖
滯留時間 4.03 分的析出液為 ABTS，8.71 和 11.16 分析出液的
VESI-MS 則依序顯現為 m/z 212 及 211(圖 4-32)，出乎意料之外的，當以
VESI-MS 直接分析反應液，而不是經由 HPLC 收集析出液再以 VESI-MS 分析，質譜圖中顯示的為縮和聚合物 m/z 211 ([2M-3H2+H]+)和 m/z 213 (2M-2H2+H)+)，為何經由 HPLC 管柱分離後使得化合物失去一個 H 原因 不明，不過仔細觀察 HPLC 層析圖滯留時間 11.16 分的波型(圖 4-31)，顯 示分析物與固定相間的作用力並不單純，我們後續研究 ABTS●+與 HPLC 管柱中自動轉換成 ABTS 時，也觀察到類似的波型變化現象。
圖 4-32ABTS●+與 1,2-benzenediamine 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖：
RT= (A) 4.03、(B) 8.71、(C) 11.16 min。
1,4-benzenediamine 反應液 HPLC 層析圖與 1,4-benzenediol 及
1,4-aminophenol 所得相似，顯示兩根明顯的波峰，分別是滯留時間 2.64 及 6.97 分(圖 4-33)，其中在滯留時間 2.64 分的訊號隨反應時間增加而增 加，以 VESI-MS 分析此析出液並無法獲得離子訊號，依據 1,4-benzenediol 實驗結果推斷這個化合物應該是[1,4-benzenediamine-H2]，但以這個結構 來看於游離過程中要質子化形成[M-H2+H]+應是可行，為何無法在
VESI-MS 圖中顯現仍需進一步了解。
圖 4-33ABTS●+與 1,4-benzenediamine 隨時間反應之層析圖
綜合 benzenediol、aminophenol、benzenediamine 的實驗結果，可以 得知無論是哪種同分異構物都可以將 ABTS●+還原成 ABTS，此外對位和 鄰位異構物會伴隨脫氫反應生成[M-H2]化合物，甚至有聚合脫氫現象生 成[2M-2H2]。間位異構物則沒有反應物的脫氫現象，取而代之進行加成 反應生成[M+ABTS-H2]，這個加成物隨時間增長而會解離更多的 H2。
4.2Aniline 間位取代基效應
根據 benzenediol、aminophenol、benzenediamine 三種苯環二取代同 分異構物與 ABTS●+反應的結果，發現三種位置易購物中，只有位於間位 的苯環二取代化合物會與 ABTS●+反應生成加成物，因此進一步探討間位 官能基對反應途徑的影響。
首先觀察在間位沒有取代基的 phenol 及 aniline 與 ABTS●+的反應結 果，以便隨後比較間位取代基的推拉電子對反應途徑的影響。VESI-MS 的結果顯示，phenol 及 aniline 與 ABTS●+反應時，都無發將 ABTS●+還原
成 ABTS (圖 4-34)，ABTS●+與 aniline 反應時生成 m/z 350 及 m/z 606。改 用 HPLC 分析反應液時，無意間觀察到在尚未添加 aniline 前的反應液有 很不尋常的層析圖(圖 4-35)，於滯留時間 4 到 6 分多鐘一直有物質持續流 出。
圖 4-34 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M aniline、phenol 反應之質譜圖：
(A)反應前 ABTS●+；(B) ABTS●+加入 aniline；(C) ABTS●+加入 phenol
圖 4-35 (A) ABTS；(B) ABTS●+之層析圖
進一步的探討發現此種現象，應該是來自 ABTS●+通過管柱時與固定 相作用，通行中沿途持續有 ABTS●+於管柱內轉換成 ABTS，才會形成這 種特殊的拖尾現象，後續的研究我們發現，只要 VESI-MS 的結果顯示反 應液中有 ABTS●+殘留，這瓶反應液的 HPLC 層析圖都將會有這種特殊的 外貌。
當添入 aniline 後，原有滯留時間 4 到 6 分多鐘的拖尾現象消失，形 成新的滯留鋒(圖 4-36)。滯留時間 3.11 分有一根新的波峰產生，此波峰 隨反應時間增加訊號越大，將析出液收集以 VESI-MS 分析，可以記錄到 m/z 259、350 及 606 三個訊號(圖 4-37)，其中 m/z 259 是 ABTS 斷片訊號，
m/z 350 及 606 是生成物的訊號，但是無法確認 m/z 350 是在反應液中已 經生成的，還是來自游離過程中人為的 m/z 606 斷片。滯留時間 6.73 分 的析出液以 VESI-MS 分析為 m/z 515，但是先前以 VESI-MS 線上分析反 應液的結果，顯示反應液中存在的是未反應的 m/z 514 (圖 4-34B)，再次 證實了 ABTS●+於管柱中被轉換成 ABTS，也彰顯了以 VESI-MS 進行線 上即時分析的優點。
圖 4-36ABTS●+與 aniline 隨時間反應之層析圖
圖 4-37 ABTS●+與 aniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖： RT= (A) 3.11、(B) 6.73 min。
ABTS●+與 aniline 反應液的 UV/Vis 圖可以更加確認，在我們 HPLC 實驗的採樣時間內 ABTS●+還原成 ABTS 的量應該很少，雖然反應液在 340 nm (ABTS)的吸收強度有隨時間增加而增加(圖 4-38)，但與
benzenediol(圖 4-10)的變化速度相較明顯慢了許多。
圖 4-38ABTS●+與 aniline 反應液不同時間之 UV 圖
4.2.1Aniline 間位取代基推電子基效應
1,3-benzenediol、1,3-aminophenol 及 1,3-benzenediamine 都具有將 ABTS●+還原成 ABTS，以及生成加成物的能力，這三種化合物的間位取 代基皆是屬於強推電子基的官能基，我們接下來削弱取代基的推電子能 力，研究強、中、弱推電子取代基對反應途徑的影響。
比較具有強推電子取代基的 3-methoxyaniline，中推電子取代基的 3-aminoacetanilide 以及弱推電子取代基的 3-methylaniline，發現只有 3-methoxyaniline 才能將 ABTS●+轉換成 ABTS，其餘兩者還原力不足，但 是三者都有加成物的產生(圖 4-39)，從此項結果推測要將 ABTS●+數分鐘 內轉換成 ABTS 的話，取代基必須要是強推電子基才行。
圖 4-39 2.5×10-4 M ABTS●+及 1.25×10-4 M aniline 間位取代基推電子基化 合物反應之質譜圖：(A)反應前 ABTS●+；(B) ABTS●+加入 3-methoxyaniline；
(C) ABTS●+加入 3-aminoacetanilide；(D) ABTS●+加入 3-methylaniline
從 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應發現有 m/z 380 生成，這與 ABTS●+
與 1,3-benzenediol 反應結果相同，但是比較 HPLC 的滯留時間(圖 4-40)，
可以發現兩者並不相同。收集 HPLC 析出液再以 VESI-MS 分析，其中滯 留時間 6.66 分析出液是 ABTS，滯留時間 3.08 分是 ABTS 斷裂訊號(m/z 259)及兩個生成物(m/z 380 和 m/z 636)的訊號(圖 4-41)，而滯留時間 4.05 分是質子化的 3-methoxyaniline(m/z 124)。
圖 4-40ABTS●+與 3-methoxyaniline 隨時間反應之層析圖
圖 4-41 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖：
RT= (A)3.08、(B) 4.50、(C) 6.66 min。
當以 UV-Vis 分析反應液時，一加入 3-methoxyaniline 後 ABTS●+立即 還原成 ABTS，並且在 305 nm 有吸收峰出現(圖 4-42)，推測這是 m/z 380 的吸收波長，比對 HPLC-DAD 與 UV-Vis(圖 4-43)，確認 305 nm 的吸收 峰為 m/z 380 及 636 的訊號，此外 ABTS●+與 3-methoxyaniline 生成的 m/z
380 以及 ABTS●+與 1,3-benzenediol 生成的 m/z 380 吸收圖譜不相同，可 以更確定兩者是不同的化合物。
圖 4-42 ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應隨時間之 UV 變化圖
圖 4-43ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應混合液之 HPLC-DAD 圖
圖 4-43ABTS●+與 3-methoxyaniline 反應混合液之 HPLC-DAD 圖