Benzenediol 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS ● + 反應

過去本實驗室所觀察到的資料一致³。三種 benzenediol 異構物都可以提 供電子將 ABTS^●+還原成 ABTS(圖 4-1)。除此之外，質譜圖中顯示

1,2-benzenediol 會進一步生成[M-H2]⁺ (m/z 109)，顯示 1,2-benzenediol 與 兩當量的 ABTS^●+形成 1,2-benzoquinone (MW 108) (圖 4-2)。

圖 4-1 2.5×10^-4 M ABTS^●+及 1.25×10^-4 M benzenediol 三種異構物反應之質 譜圖：(A)反應前(ABTS^●+)；(B) ABTS^●+加入 1,2-benzenediol；(C) ABTS^●+

加入 1,3-benzenediol；(D) ABTS^●+加 1,4-benzenediol

圖 4-2ABTS^●+與 1,2-benzenediol 反應途徑

在 VESI(+)的電噴灑游離過程下，1,2-benzoquinone 質子化生成 m/z 109 離子，這個離子因具有分子內氫鍵相對穩定而顯現在 VESI-MS 質譜

圖中。至於 1,4-benzoquinone 的生成，推測因為 1,4-benzoquinone 無法以 分子內氫鍵形式形成穩定的 m/z 109，而沒有在 VESI-MS 圖中顯現。有 別於 1,2-和 1,4-benzenediol，1,3-benzenediol 基本上是無法形成

1,3-benzoquinone，但是 VESI-MS 途中卻出現獨有的 m/z 623 與 m/z 380 離子，其中 m/z 623 為 ABTS^●+與 1,3-benzenediol 的加成物 (圖 4-3)，而 m/z 623 可以進一步解離成 m/z 380 (圖 4-4)。

圖 4-3ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應途徑

圖 4-4ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應加成物(m/z 623)解離途徑

不同於傳統以光譜分析法探討 benzenediol 與 ABTS^●+反應，只能以 UV/Vis 光譜圖的變化，說明除了 ABTS 外還有新產物的生成，VESI-MS 進一步提供了新產物的分子量，以及辨別加成物的可能結構。

由於 VESI-MS 是分析未經純化的反應液，溶液中含有合成 ABTS^●+

時所用的各種化合物和分析物，這些化合物在游離過程中可能有競爭壓 抑分析物的效應，或者是進行氣相離子-分子反應生成副產物，造成對實 驗結果的誤判，因此改用 LC-MS 來分離各個化合物進行探討。當觀察 ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應時，發現現有 LC-MS 的系統狀況不佳，所 得的層析圖無法提供可以接受的解析度(圖 4-5)，因此將分析方法改成 HPLC/UV，希望可以提供反應液中各個物質相對含量變化趨勢上，一個 較可靠的結果。

圖 4-5 ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應之 TIC 圖

以 HPLC 分析不同反應時間下 1,3-benzenediol 與 ABTS^●+的反應液，

結果如圖 4-6，在滯留時間 3.77、5.69、6.83、22.81 分時有化合物流出。

圖 4-6ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應液之不同反應時間層析圖

為了確認特定滯留時間的化合物為何，乃將每個分離出來的化合物 收集起來以 VESI-MS 方式分析，確認每個化合物的分子量(如圖 4-7)。

圖 4-7 ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應經 HPLC 分離收集液之 MS 圖： RT=

(A) 3.77、(B) 5.69、(C) 6.83、(D) 22.81 min。

VESI-MS 分析結果顯示，滯留時間 3.77 分化合物為 m/z 623；滯留 時間 5.69 及 22.81 分的化合物質荷比皆為 m/z 380，比較不同反應時間採 樣分析的 HPLC 層析圖，可以觀察反應開始約 1 分鐘內，滯留時間 3.77 分的化合物(m/z 623)強度逐漸上升(圖 4-8)，但隨著反應時間增長強度持 續減弱。滯留時間 5.69 及 22.81 分的化合物(m/z 380)其兩者的變化趨勢 不同，滯留時間 5.69 分的化合物反應一開始就存在，隨著反應的進行其 強度緩慢的增加，至於滯留時間 22.81 分的化合物在一開始是沒有訊號的，

但隨著反應的時間越久，強度越來越明顯。

圖 4-8ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應加成物 m/z 380、623 趨勢圖

為了確認 HPLC 層析圖中所顯現的兩種 m/z 380 化合物是來自反應 液本身，而不是 HPLC 分析管柱所造成的假象，我們另外以 UV-Vis 光譜 儀直接測定不同反應時間的反應液。已知 ABTS^●+及 ABTS 的吸收波長分 別在 415 及 340 nm (圖 4-9)，顯示當 1,3-benzenediol 一加入 ABTS^●+生成 液後，ABTS^●+很快轉換成 ABTS (圖 4-10)，並且在波長約 340 及 520 nm 附近有新的波峰生成，初步結果顯示反應液中除了有 ABTS^●+還原成 ABTS 以外，另外還有其他化合物生成。

圖 4-9ABTS^●+與 ABTS 之 UV 圖

圖 4-10ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應隨時間之 UV 變化圖

確認的確有新產物生成後改用 HPLC-DAD 分析反應液，以便獲得特 定滯留時間化合物的 UV/Vis 光譜圖。結果顯示 m/z 623 的化合物最大吸 收波長約為 300 nm，與 ABTS 相較有藍位移現象，而兩種 m/z 380 的化 合物最大吸收波長皆是約 500 nm(圖 4-11)，相較於 ABTS 有紅位移現象，

兩者在滯留時間上雖然有極大的差異，但是兩個化合物的 UV/Vis 光譜圖 並無顯著的不同。

圖 4-11 ABTS^●+與 1,3-benzenediol 反應混合液之 HPLC-DAD 圖 以分析 1,3-benzenediol 與 ABTS^●+反應液的相同方式探討 1,2-和 1,4-benzenediol，可以發現 HPLC 層析圖大不相同。1,2-benzenediol 反應 液層析圖中只有 ABTS 訊號(圖 4-12)。

圖 4-12ABTS^●+與 1,2-benzenediol 隨時間反應之層析圖

1,4-benzenediol 反應液層析圖中，在滯留時間 2.41、3.92 分有波峰生 成(圖 4-13)，其中滯留時間 3.92 分是 ABTS 的訊號，而滯留時間 2.41 分 在 MS 測定中無法判斷，推測是較難質子化的 1,4-benzoquinone，因此將 1,4-benzoquinone 用相同流動相進行 HPLC 分離，滯留時間是符合的(圖 4-14)，而在 MS 中確實是沒有訊號，因此更加確定 ABTS^●+與

1,4-benzenediol 反應在滯留時間 2.41 分是 1,4-benzoquinone。

圖 4-13ABTS^●+與 1,4-benzenediol 隨時間反應之層析圖

圖 4-14 (A) 1,4-benzoquinone；(B) ABTS^●+與 1,4-benzenediol 反應層析圖

4.1.2 Aminophenol 鄰、間、對位同分異構物與 ABTS^●+反應