利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物前處理 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞，並使用 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三 天後利用高通量活細胞影像儀分析Aβ-GFP 蛋白的螢光通量、細胞數 及 IC50細胞毒性，並以核酸同步定量系統分析Aβ-GFP RNA 表現(圖
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五 A)。當所測得的相對細胞數低於 80%時，將不探討該濃度對 Aβ-GFP 蛋白螢光亮度之影響。實驗結果發現，在 Aβ-GFP 表現的 293 細胞 中，LM-004 的細胞毒性較大，在處理濃度 1 μM 時，相對細胞數已 降至 74%，而 LM-016 及 LM-031 對細胞毒性較低，10 μM 濃度時相 對細胞數仍有 80%以上。相較於未處理化合物組別，隨著各化合物處 理濃度上升，Aβ-GFP 蛋白的螢光亮度亦顯著上升，各化合物有效濃 度/螢光亮度上升情形分別是甘草查爾酮 A：1 nM ~ 1 μM/105~115%
(P = 0.008 ~ <0.001)、LM-004：1 nM ~ 0.1 μM/103~111% (P = 0.019 ~
<0.001)、LM-006：1 nM ~ 1 μM/105~112% (P = 0.002 ~ 0.001)、
LM-026：10 nM ~ 1 μM/102~105% (P = 0.042 ~ 0.005)、香豆素：10 nM
~ 1 μM/103~109% (P = 0.017 ~ 0.005) 、 LM-016 ： 1 nM ~ 10 μM/103~117% (P = 0.033 ~ 0.006)、LM-026：1 nM ~ 10 μM/107~125%
(P = 0.007 ~ <0.001) (圖五 B)。綜合上述結果，甘草查爾酮 A、香豆 素及 LM 衍生物可降低 Aβ 的錯誤摺疊，但其中以 LM-031 的效果為 最佳。
六、 待測化合物的Aβ-GFP 293 細胞毒性分析
如圖五 A 所示，利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物 (0.1~100 μM)與正控制組薑黃素(1~10 μM)前處理 Tet-On Aβ-GFP 293
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細胞，並以2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現，三天後以碘化丙 啶染死細胞，再以流式細胞儀分析細胞存活率。經實驗結果得知，隨 著化合物處理濃度上升，細胞存活率隨之下降。利用測得之細胞存活 率進一步算出甘草查爾酮 A、香豆素、薑黃素的 IC50分別為：76、70 及 11 μM，LM 衍生物中，LM-004 對細胞造成的毒性最高(IC50 48 μM)，而 LM-031 對於細胞造成的毒性最低(IC50 95 μM) (圖五 C)，此 結果與先前使用 MTT 測試未誘導細胞所推算出的 IC50趨勢相近。
七、 化合物處理Aβ-GFP 293 細胞模式的 Aβ-GFP RNA 表現量分析 利用化合物甘草查爾酮A、香豆素(1 μM) 及衍生物LM-031 (1~10 μM)前處理Tet-On Aβ-GFP 293細胞，並使用2 μg/ml的多西環素誘導 Aβ-GFP表現。三天後利用核酸同步定量系統偵測Aβ-GFP RNA表現
(圖五A)。經實驗結果得知，相較於未誘導(- Dox)組別，誘導組Aβ-GFP RNA表現量提升至25倍(+ Dox)；處理甘草查爾酮A (Lico. A) (1 μM)、
香豆素(Cou.) (1 μM)、LM-031 (1~10 μM)後，並未顯著增加Aβ-GFP RNA表現量(圖五D)，故所測得之Aβ-GFP蛋白螢光亮度提升(圖五 B)，並非透過增加RNA轉錄量。
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八、 活性氧化物分析
利用化合物甘草查爾酮 A、LM-006、LM-026、香豆素(1 μM)及 LM-016、031 (1~10 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)處理 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞，並使用 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後利 用流式細胞儀分析細胞活性氧化物含量的變化(圖六 A)。以未誘導組 別(-Dox)測得的細胞內活性氧化物含量作為 100%，則加入多西環素 誘導的組別(+Dox)細胞內活性氧化物含量顯著上升，達到 122% (P = 0.007)，前處理正控制組薑黃素(5 μM)，可使細胞內活性氧化物含量 回降至 89%左右 (P = 0.002)，前處理待測各化合物後，細胞內活性 氧化物含量亦均可顯著的下降。如以1 μM 的甘草查爾酮 A、LM-006、
LM-026、香豆素前處理後，細胞內 ROS 含量可分別回降至 97% (P = 0.003)、98% (P = 0.002)、100% (P = 0.002)、91% (P = 0.003)；而以 1~10 μM 的 LM-016 及 031 處理後，細胞內活性氧化物含量則可分別 回降至 98~93% (P = 0.002)、89~75% (P = 0.001 ~ <0.001)，且有劑量 依存性的作用。所檢測的 LM 化合物中，LM-031 對於降低細胞內活 性氧化物含量含量有最顯著的效果(圖六 B)。
九、 凋亡蛋白酶-3 活性分析
如圖六 A 所示，利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、
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LM-026 (1 μM)及 LM-016、LM-031(1~10 μM)與正控制組薑黃素(5 μM) 處理 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞，並使用 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表 現 。 三 天 後 收 集 細 胞 及 收 集 蛋 白 ， 利 用 SIGMA®
Fluorometric Caspase 3 assay kit 測得細胞內凋亡蛋白酶-3 活性。以未 誘導組別(-Dox)測得的細胞內凋亡蛋白酶-3 活性作為 100%，則加入 多西環素誘導的組別(+Dox)細胞內凋亡蛋白酶-3 活性顯著上升，達到 116% (P = 0.002)。實驗結果顯示，正控制組 5 μM 薑黃素的部分，可 使細胞內凋亡蛋白酶-3 活性回降至 100%左右(P = 0.008)，處理各化 合物後，細胞內凋亡蛋白酶-3 活性均可達到顯著的回降。以 1 μM 的 甘草查爾酮 A、LM-006、LM-026、香豆素處理，細胞內凋亡蛋白酶 -3 活性可分別回降至 106% (P < 0.001)、107% (P = 0.036)、107% (P = 0.001)、105% (P =0.003)；而以 1~10 μM 的 LM-016 及 LM-031 處理 後，細胞內凋亡蛋白酶-3 活性則可分別回降至 107~103% (P = 0.006 ~ 0.002)、104~100% (P < 0.001)，且有劑量依存性的作用，其中又以 LM-031 對於降低細胞內凋亡蛋白酶-3 活性有最顯著的效果(圖六 C)。
十、 神經突生長分析
利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、LM-026 (1 μM)及 LM-016、LM-031(1~10 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)前處理神經分化
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的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表 現。六天後，利用TUBB3 (Class III β-tubulin)抗體結合微管後，再利 用高通量活細胞影像儀進行神經突生長的拍照分析(圖七 A)。圖七 B 為未誘導(Uninduced)、誘導(Induced)、甘草查爾酮 A (Licochalcone A) 、 LM-016 、 LM-031 (1 μM) 及 薑 黃 素 (Curcumin, 5 μM) 處理 的 Aβ-GFP 細胞神經突生長顯微影像。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox) 測得的神經突生長情形作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表 現的組別(+ Dox)神經突生長顯著下降(87%，P = 0.001)。正控制組 5 μM 薑黃素前處理，可使細胞神經突生長回升至 107% (P < 0.001)。前 處理甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物後，細胞神經突生長亦達到顯 著的回升：以1 μM 的甘草查爾酮 A、LM-006、026、香豆素處理，
神經突生長分別回升至 102% (P < 0.001)、100% (P = 0.002)、99% (P <
0.001)、100% (P < 0.001)，而以 1~10 μM 的 LM-016 及 031 處理後，
神經突生長則可分別回升至 98~103% (P = 0.003 ~ <0.001)、104
~110% (P = 0.003 ~ <0.001)，且呈現劑量依存的效果，其中又以 LM-031 回復神經突生長的能力最佳(圖七 C)。
十一、 凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量分析
利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、LM-026、LM-016、
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LM-031(1 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)前處理神經分化的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，
利用西方轉漬法，分析蛋白表現量(圖八 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現 組別(- Dox)測得的凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量作為 100%，則加入多西 環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量顯著 增加(168%，P = 0.040)。正控制組 5 μM 薑黃素前處理，可使凋亡蛋 白酶-3 蛋白表現量回降至 92% (P = 0.015)。前處理甘草查爾酮 A、香 豆素及其衍生物後，凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量亦達到顯著的回降：以 1 μM 的甘草查爾酮 A、LM-006、026、香豆素、016、031 處理，凋 亡蛋白酶-3 蛋白表現量分別回降至 101% (P = 0.029)、93% (P = 0.020)、96% (P = 0.018)、104% (P = 0.026)、101% (P = 0.023)、94% (P
= 0.016) (圖八 B)。
十二、 乙醯膽鹼脂酶活性分析
利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、LM-026、LM-016、
LM-031 (1 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)前處理神經分化的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，
利用 SIGMA® Acetylcholinesterase Activity Assay Kit，測得細胞內乙醯 膽鹼脂酶活性(圖八 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得的乙
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醯膽鹼脂酶活性作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組 別(+ Dox)乙醯膽鹼脂酶活性顯著增加(122%，P = 0.041)。正控制組 5 μM 薑黃素前處理，可使乙醯膽鹼脂酶活性回降至 103% (P = 0.041)。
前處理甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物後，乙醯膽鹼脂酶活性除 LM-006 外，其他亦達到顯著的回降：以 1 μM 的甘草查爾酮 A、026、
香豆素、LM-016、031 處理，乙醯膽鹼脂酶活性分別回降至 98% (P = 0.017)、105% (P = 0.048)、102% (P = 0.033)、103% (P = 0.038)、97%
(P = 0.017)，其中又以 LM-031 降低乙醯膽鹼脂酶活性的能力最佳(圖 八 C)。
依據上述實驗結果，新穎合成衍生物中，LM-031 為最具潛力的 甘草查爾酮 A 及香豆素衍生物(表一)，故後續實驗將僅探討甘草查爾 酮 A、香豆素及 LM-031 三者處理細胞造成的蛋白質表現量變化。
十三、 NRF2 與下游抗氧化壓力蛋白表現量分析
利用化合物 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素(1 μM)前處理神經 分化的Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用西方轉漬法，分析蛋白表現量(圖九 A)。以未誘 導Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 NRF2、GCLC、NQO1 蛋白表 現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細
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胞內 NRF2、GCLC、NQO1 蛋白表現量分別顯著下降至 76% (P = 0.030)、84% (P = 0.014)、75% (P = 0.007)。前處理 1 μM 的 LM-031、
甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內抗氧化蛋白表現量達到顯著的回 升：NRF2 蛋白表現量分別回升至 112% (P = 0.042)、110% (P
=0.044)、108% (P = 0.014)；GCLC 蛋白表現量分別回升至 110% (P = 0.041)、110% (P =0.025)、115% (P = 0.041)；NQO1 蛋白表現量分別 回升至 137% (P = 0.015)、124% (P = 0.032)、117% (P = 0.036) (圖九 B、C)。
此 外 ， 透 過 西 方 轉 漬 法 分 析 熱 休 克 蛋 白 (Heat shock protein beta-1，簡稱 HSPB1)及 Aβ-GFP 蛋白表現量，來了解化合物是否可透 過增加 HSPB1 表現，改善 Aβ-GFP 蛋白摺疊，而增加 Aβ-GFP 溶解 度。HSPB1 蛋白表現量的部分，以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox) 測得細胞內 HSPB1 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)，細胞內 HSPB1 蛋白表現量顯著下降
(77%，P = 0.016)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素 後，細胞內 HSPB1 蛋白表現量分別顯著的回升至 90% (P = 0.029)、
90% (P = 0.025)、93% (P = 0.048)。在可溶性 Aβ-GFP 蛋白的部分，
未誘導組別(- Dox)並未偵測到 Aβ-GFP 表現，以加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內可溶性 Aβ-GFP 蛋白量作為
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100%，則前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞 內可溶性Aβ-GFP 蛋白量分別顯著的增加至 170% (P = 0.018)、162%
(P = 0.021)、165% (P = 0.016) (圖九 D、E)。
十四、 CREB 與下游神經生長相關蛋白表現量分析
利用化合物 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素(1 μM)前處理神經 分化的Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用西方轉漬法，分析 CREB 與下游神經生長相關蛋 白表現量(圖十 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 CREB、pCERB、BDNF 前驅物及 BDNF 成熟蛋白表現量作為 100%，
則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內 CREB、
pCERB、BDNF 前驅物及 BDNF 成熟蛋白表現量分別顯著下降至 84%
(P = 0.016)、70% (P = 0.007)、88% (P = 0.021)、80% (P = 0.034)。前 處理1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內神經生長 相關蛋白表現量達到顯著的回升：CREB 蛋白表現量分別回升至 96%
(P = 0.017)、96% (P =0.031)、96% (P = 0.013)；pCERB 蛋白表現量分 別回升至 110% (P = 0.011)、122% (P =0.001)、103% (P = 0.002)；BDNF 前驅物蛋白表現量分別回升至 110% (P = 0.012)、104% (P =0.042)、
105% (P = 0.041)；BDNF 成熟蛋白表現量分別回升至 110% (P =
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0.033)、120% (P =0.031)、114% (P = 0.023) (圖十 B、C)。
同為 CREB 蛋白所調節的下游蛋白 BCL2，以未誘導 Aβ-GFP 表 現組別(- Dox)測得細胞內 BCL2 蛋白表現量作為 100%，則加入多西 環素誘導Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內 BCL2 蛋白表現量顯著下 降(87%，P = 0.005)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆 素後，細胞內 BCL2 蛋白表現量分別顯著的回升至 107% (P = 0.038)、
94% (P = 0.016)、95% (P = 0.013)。與 BCL2 蛋白相互對立的 BAX 蛋 白表現量部分，同樣以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 BAX 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組 別(+ Dox)細胞內 BAX 蛋白表現量顯著上升(132%，P = 0.013)。前處 理1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內 BAX 蛋白表 現量則分別顯著的回降至 86% (P = 0.004)、83% (P = 0.004)、91% (P = 0.002) (圖十 B、C)。
此外，以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 CREB 途徑 下游 AKT、pAKT(T308)、pAKT(S473)、ERK 及 pERK 蛋白表現量 作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)，細胞 內 AKT、pAKT(T308) 、pAKT(S473)、ERK 及 pERK 蛋白表現量分 別顯著下降至 72% (P = 0.012)、79% (P = 0.003)、71% (P = 0.022)、
86% (P = 0.034)、79% (P = 0.002)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查
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爾酮 A 及香豆素後，細胞內 CREB 途徑下游相關蛋白表現量達到顯 著的回升：AKT 蛋白表現量分別回升至 95% (P = 0.017)、92% (P
=0.009)、92% (P = 0.014)；pAKT(T308)蛋白表現量分別回升至 103%
(P = 0.008)、104% (P =0.007)、97% (P = 0.032)；pAKT(S473)蛋白表 現量分別回升至 113% (P = 0.045)、117% (P = 0.001)、101% (P = 0.012)；ERK 蛋白表現量分別回升至 102% (P = 0.033)、102% (P
=0.018)、96% (P = 0.042)；pERK 蛋白表現量分別回升至 104% (P = 0.037)、102% (P =0.031)、97% (P = 0.018) (圖十 D、E)。
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伍、 討論
先前本實驗室研究發現雖然甘草查爾酮 A 具有神經保護性作 用，但對人類細胞毒性較高(Chen et al., 2014)，尚有改善空間。香豆
先前本實驗室研究發現雖然甘草查爾酮 A 具有神經保護性作 用，但對人類細胞毒性較高(Chen et al., 2014)，尚有改善空間。香豆