降低Aβ聚集導致阿茲海默氏症之新穎甘草查爾酮A與香豆素之衍生物的藥物開發

全文

(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 降低 Aβ 聚集導致阿茲海默氏症之新穎甘草查爾酮 A 與香豆素之衍生物的藥物開發 Development of novel licochalcone A and coumarin derivatives to mitigate the amyloid beta aggregation-induced Alzheimer’s disease. 研究生：李欣穎 Shin-Ying Lee 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen 中華民國 106 年 6 月.

(2) 誌謝. 時光飛逝，轉眼間已到了畢業的時刻，一路走來學習了許多專業知識與實驗技術，許多貴人相助使得這本論文能如期完成。最感謝的是授予我可貴磨練機會的李桂楨教授，以及 D311 實驗室學長姐們不吝提供的學術指導協助及實驗經驗分享。首先要衷心感謝李桂楨教授的栽培提攜，並在研究期間不厭其詳的惠賜專業的指導與建議，讓我在進入實驗室後，獲得許多寶貴的實務經驗，不論是文章討論報告、實驗流程設計，抑或是論文撰寫與修改，均給予我許多技術上的指導及精神上的支持。感謝李教授對於我的勉勵與肯定，未來我也將繼續秉持實事求是的科學態度以及鍥而不捨的實驗精神，在生命科學的研究領域持續追求自我突破與創新。進入實驗室後，感謝雅貞學姊一直悉心指導我，使我從完全不熟悉實驗儀器到逐漸能獨立操作實驗；每當開始設計新的實驗，雅貞學姊總會在一旁協助我規劃流程；實驗遇到瓶頸時，雅貞學姊也會與我一起討論如何降低技術造成的誤差……。在實驗室一路走來，謝謝雅貞學姊的協助與陪伴，讓我的實驗進行得更加順利，也讓我的實驗能力大幅提升。在 D311 實驗室裡學長姐們亦給予我許多協助與鼓勵，非常感謝.

(3) D311 實驗室的所有學長姐，在我進入實驗室後耐心的照顧我、指引我。感謝琦玫老師，時常與我分享實驗室的寶貴經驗與分子生物領域的嶄新研究；感謝志信學長，每當我研讀文章時，總是不厭其煩的解答我的疑問；感謝麗卿學姊、婉玲學姊、怡辰學姊、芷英學姊、德嫻學姊、禎廷學長在我面臨實驗關卡時，熱忱的為我解難排憂，協助我找出實驗不完善的地方；感謝家寧學姊、育軒學姊、阡聿學姊，常常與我共同討論實驗設計及實驗結果，一起切磋琢磨實驗方法與實驗技巧，讓我在實驗室度過充實且美好的時光。由衷感謝實驗室每一位師長和前輩的陪伴與包容，讓我在實驗室中獲得許多紮實的訓練與難忘的回憶。除此之外，感謝國立臺灣師範大學化學系的林文偉教授提供我合成化合物作為實驗的研究藥物，並詳加解釋化合物結構之間的差異與意義，使我的研究在化學部分上能有更多的著墨及討論。也十分感謝林口長庚紀念醫院的張國軒醫師、陳瓊美醫師、吳逸如醫師每次抽空參加實驗室研究討論會議，在會議中提供我實驗的研究方向及未來規劃。透過林文偉教授與醫師們的提點與建議，使我的研究得以更全面，論文內容更臻完整。更感謝國立臺灣師範大學生命科學研究所，提供我完善的實驗儀器設備及研究平台，讓我能有幸嘗試設計實驗、撰寫計畫、完成實驗，.

(4) 並從實驗結果中研擬實驗計畫的後續發展及發現實驗過程中的不足之處，逐步加以改善，以獲得更信而有徵、更具有意義的實驗數據。感謝一直在背後默默支持我的家人，在我實驗不順利時陪伴我，為我加油打氣，讓我能盡快收拾挫敗的心情，再次迎向新的挑戰。很高興自己當初明智選擇進入李桂楨教授的實驗室，這一路走來的堅持與努力，讓我累積了許多珍貴的學術知識與實務經驗。我也相信，這些日子以來的種種磨礱砥礪，都將化為我未來進步的動力，持續鞭策我勇於攀登學術的高峰，期望自己能站得更高、看得更遠！.

(5) 目錄目錄------------------------------------------------------------------------------------- I 中文摘要-----------------------------------------------------------------------------IV Abstract------------------------------------------------------------------------------ VI 圖表次------------------------------------------------------------------------------VIII 壹、緒論 ----------------------------------------------------------------------------1 一、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease) ------------------------------1 二、 Amyloid-β (Aβ)胜肽 -------------------------------------------------2 三、 HSPB1、Aβ 聚集與阿茲海默氏症-------------------------------4 四、乙醯膽鹼、乙醯膽鹼脂酶及乙醯膽鹼脂酶抑制劑 ---------5 五、 NRF2、抗氧化壓力與阿茲海默氏症---------------------------6 六、 CREB、神經生長與阿茲海默氏症------------------------------7 七、甘草查爾酮 A (Licochalcone A)、香豆素(Coumarin)及待測化合物 ---------------------------------------------------------------------10 八、藥物篩檢研究 --------------------------------------------------------12 貳、研究目的 --------------------------------------------------------------------14 參、研究材料與方法-----------------------------------------------------------15 一、. DPPH 自由基清除能力檢測 -----------------------------------15. 二、. Thioflavin T 螢光亮度檢測 ------------------------------------15 I.

(6) 三、. 細胞培養與繼代---------------------------------------------------16. 四、. 化合物毒性測試---------------------------------------------------16. 五、. Aβ-GFP 細胞模式螢光亮度照相 -----------------------------17. 六、. Aβ-GFP 細胞模式篩檢-------------------------------------------17. 七、. Aβ-GFP 細胞模式毒性測試------------------------------------18. 八、. Aβ-GFP 細胞模式 Aβ-GFP RNA 表現量檢測 -----------18. 九、. 活性氧化物檢測 --------------------------------------------------19. 十、. 凋亡蛋白酶-3 活性檢測 ----------------------------------------20. 十一、神經突生長觀測 --------------------------------------------------21 十二、乙醯膽鹼脂酶活性測試-----------------------------------------22 十三、西方轉漬法 ---------------------------------------------------------23 十四、統計分析 ------------------------------------------------------------25 肆、結果---------------------------------------------------------------------------26 一、 DPPH 自由基清除能力分析--------------------------------------26 二、 Thioflavin T 螢光分析---------------------------------------------26 三、待測化合物細胞毒性分析 ----------------------------------------27 四、正控制組薑黃素的 Aβ-GFP 293 細胞分析 ------------------27 五、待測化合物的 Aβ-GFP 293 細胞篩檢分析 ------------------28 六、待測化合物 Aβ-GFP 293 細胞毒性分析----------------------29 II.

(7) 七、化合物處理 Aβ-GFP293 細胞模式的 Aβ-GFP RNA 表現量分析----------------------------------------------------------------------30 八、活性氧化物分析------------------------------------------------------31 九、凋亡蛋白酶-3 活性分析 -------------------------------------------31 十、神經突生長分析 -----------------------------------------------------32 十一、凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量分析 -------------------------------33 十二、乙醯膽鹼脂酶活性分析-----------------------------------------34 十三、 NRF2 與下游抗氧化壓力蛋白表現量分析 ----------------35 十四、 CREB 與下游神經生長相關蛋白表現量分析-------------37 伍、討論 -------------------------------------------------------------------------40 陸、參考文獻 --------------------------------------------------------------------50 柒、附錄圖表-------------------------------------------------------------------72. III.

(8) 中文摘要. 阿茲海默氏症(Alzheimer's disease，簡稱 AD)，是老年癡呆症中最普遍的類型，臨床症狀包括漸進性認知功能下降以及長期記憶損傷。阿茲海默氏症的病理特徵主要可分為細胞外 β- 澱粉樣蛋白 (β-Amyloid，簡稱 Aβ)聚集形成的澱粉樣蛋白斑塊(Amyloid plaque)，以及細胞內過度磷酸化 tau 蛋白形成的神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles，簡稱 NFTs)。Aβ 斑塊造成神經細胞死亡的途徑包括氧化壓力提升、細胞外毒性、能量耗損以及細胞凋亡等，因此新 Aβ 聚集抑制劑的開發對於阿茲海默氏症的治療十分重要。甘草查爾酮 A (Licochalcone A)及香豆素(Coumarin)為來自植物的天然化合物，具增強粒線體新生及/或抗氧化的功能。為了改善甘草查爾酮 A 及香豆素對阿茲海默氏症的可能治療效果，先前的研究透過化學修飾合成五種可抑制第三型小腦萎縮症 polyQ 蛋白聚集及幫助 tau 蛋白摺疊的衍生物。本研究首先以生化實驗檢測甘草查爾酮 A、香豆素及五種合成衍生物捕捉自由基及抑制 Aβ 聚集之能力。接著利用誘導表現 Aβ-GFP 之 293/SH-SY5Y 細胞，檢測待測化合物降低 Aβ 錯誤折疊及神經保護作用。在檢測的化合物中，衍生物 LM-031 細胞毒性最低，且具有自由基捕捉能力及 Aβ 聚集抑制能力，並可降低 Aβ-GFP IV.

(9) 293 細胞中 Aβ 的錯誤折疊及相關的活性氧化物、凋亡蛋白酶-3 活性，及促進 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞神經突生長。LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素可增強熱休克蛋白 HSPB1 表現，來增加 Aβ-GFP 融合蛋白溶解度，並正調控轉錄因子 NRF2，來促進抗氧化反應元件依存的 NQO1 及 GCLC 表現。此外，在 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞中， LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素皆可增加與細胞存活、生長及/或抗凋亡相關因子的表現，如腦源性神經滋養因子 BDNF、cAMP 效應元件結合蛋白 CREB、B 细胞淋巴瘤蛋白-2 BCL2、胞外訊息調節激酶(ERK) 1/2、AKT 絲胺酸/蘇胺酸激酶 1 (AKT)等。本研究結果顯示甘草查爾酮 A、香豆素及新穎查爾酮-香豆素雜合物 LM-031 可降低 Aβ 聚集及神經保護，提供臨床上阿茲海默氏症治療新的參考策略。. 關鍵字：阿茲海默氏症，β-澱粉樣蛋白，查爾酮-香豆素雜合物，抗氧化，抗凋亡。. V.

(10) Abstract. Alzheimer's disease (AD), the most common type of dementia in humans, is characterized as a progressive decline in cognitive function and loss of the long-term memory. The prominent pathological features of AD are aggregation of β-amyloid (Aβ) peptide in plaques and hyperphosphorylated tau protein in neurofibrillary tangles (NFTs). The Aβ deposition causes neuronal death via mechanisms including oxidative stress, excitotoxicity, energy depletion and apoptosis. Therefore, identifying novel Aβ aggregate inhibitor is essential to the disease treatment. Licochalcone A and coumarin are two natural compounds from plants with enhancing mitochondrial biogenesis and/or antioxidant activity. To improve therapeutic effects of licochalcone A and coumarin, chemical modification was applied and five licochalcone A and/or coumarin derivatives inhibiting SCA3 polyQ aggregation and reducing tau misfolding were obtained. In this study, biochemical tests were firstly used to examine the free radical scavenging and Aβ aggregation inhibition activities of licochalcone A, coumarin and the five synthetic derivatives. Tet-On Aβ-GFP 293/SH-SY5Y cells were then used to examine the ability of the tested compounds to reduce Aβ misfolding and neuroprotection. Among the tested compounds, derivative LM-031 had the lowest cytotoxicity and displayed the potentials of radical-scavenging and Aβ aggregation inhibition in biochemical tests, in addition to reducing Aβ misfolding and associated reactive oxygen species and caspase-3 activity in Aβ-GFP 293 cells and VI.

(11) promoting neurite outgrowth in Aβ-GFP SH-SY5Y cells. LM-031, licochalcone A and coumarin enhanced heat-shock 27 kDa protein 1 (HSPB1) expression to increase the solubility of Aβ-GFP fusion protein and upregulated nuclear factor erythroid 2-like factor 2 (NRF2) to promote antioxidant-responsive element-dependent NAD(P)H quinone dehydrogenase 1 (NQO1) and glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) expression. The expression of factors involved in cell survival, growth and anti-apoptosis, such as brain-derived neurotrophic factor (BDNF), cyclic adenosine monophosphate response element binding protein (CREB), B-cell leukemia protein 2 (BCL2), extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2, and AKT serine/threonine kinase 1 (AKT) were also increased in Aβ-GFP SH-SY5Y cells by LM-031, licochalcone A and coumarin. The study results demonstrated that licochalcone A, coumarin and novel chalcone-coumarin hybrid LM-031 are likely to work in Aβ aggregation reduction and neuroprotection, providing insight into the possible application in AD treatment.. Keywords: Alzheimer’s disease, amyloid β, chalcone-coumarin hybrid, anti-oxidation, anti-apoptosis.. VII.

(12) 圖表次表一、各化合物優劣比較表。--------------------------------------------------72 圖一、各化合物化學結構、分子式及分子量。 ---------------------------74 圖二、待測化合物體外測試自由基清除能力及 Aβ 聚集抑制性。---76 圖三、待測化合物的細胞毒性分析。-----------------------------------------78 圖四、薑黃素對 Aβ-GFP 融合蛋白螢光亮度的影響。-------------------79 圖五、待測化合物對 Aβ-GFP 融合蛋白螢光亮度及細胞存活的影響。 -------------------------------------------------------------------------------------------81 圖六、待測化合物對 Aβ-GFP 細胞活性氧化物及凋亡蛋白酶-3 活性的影響。----------------------------------------------------------------------------------83 圖七、待測化合物對 Aβ-GFP 細胞神經突生長之影響。 ---------------85 圖八、待測化合物對 Aβ-GFP 細胞凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量及乙醯膽鹼脂酶活性之影響。---------------------------------------------------------------87 圖九、待測化合物對 Aβ-GFP 細胞內抗氧化相關蛋白、HSPB1 及 Aβ-GFP 表現量之影響。----------------------------------------------------------89 圖十、待測化合物對 Aβ-GFP 細胞內神經生長相關蛋白表現量之影響。--------------------------------------------------------------------------------------92 圖十一、各化合物與清除自由基能力討論圖。------------------------------93 圖十二、實驗總結論圖。-----------------------------------------------------------94 VIII.

(13) 壹、緒論. 一、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease) 阿茲海默氏症(Alzheimer's disease，簡稱 AD)，又稱老人癡呆症，最早由德國精神科醫師及神經病理學家愛羅斯‧阿茲海默於 1906 年描述記錄，並以他的名字命名，1907 年被正式發表。阿茲海默氏症的臨床症狀包括：混亂、易怒、具攻擊性、情緒不穩、語言障礙及長時間記憶遺失等，後期逐漸喪失身體機能，如癲癇、吞嚥困難、無法控制排便泌尿等，最終導致死亡(Rossor et al., 1996)。阿茲海默氏症發病機制十分複雜，研究顯示阿茲海默氏症的病因主要有兩種假說：第一種是在嗅皮層、海馬和大腦皮層的神經細胞外出現澱粉樣蛋白斑 (Amyloid plaque)，另一種則是在神經細胞內發現神經元纖維糾結 (Neurofibrillary tangles，簡稱 NFTs) (Querfurth and LaFerla, 2010)。阿茲海默氏症依照發病時間可分為早期發病(家族性、遺傳性)和晚期發病(偶發性)。早期發病年齡約為 40 歲到 60 歲，此種發病較為少見，僅占阿茲海默氏症發病中的 5%到 10%。導致早期發病的原因主要為體染色體顯性遺傳基因突變，如：澱粉樣前驅蛋白(Amyloid precursor protein，簡稱 APP)、早老素 1 (Presenilin 1，簡稱 PSEN1)、早老素 2 (Presenilin 2，簡稱 PSEN2)等(Goate et al., 1991; Sherrington et 1.

(14) al., 1995; Rogaev et al., 1995; Lemere et al., 1996)，這些基因變異都與 Aβ 堆積的增加有關，並導致早發性的阿茲海默氏症。另外，大部份的阿茲海默氏症患者則多為晚發性疾病，發病年齡通常在 60 歲之後，主要的遺傳危險因子為 Apolipoprotein (簡稱 APOE) ε4 等位基因，此遺傳危險因子與 Aβ 的清除有關，會增加罹病的風險(Corder et al., 1993)。在阿茲海默氏症患者腦中 Aβ 濃度顯著高於正常人(Funato et al., 1998) 。根據澱粉樣蛋白連鎖反應假說 (amyloid cascade hypothesis)，這些不正常 Aβ 堆積在臨床上會造成緩慢漸進的認知能力下降，以及阿茲海默氏症的行為症狀和功能損傷(Hardy and Selkoe, 2002; Hardy, 2009)。. 二、 Amyloid-β (Aβ)胜肽 Amyloid-β (Aβ)胜肽生成自澱粉樣前驅蛋白(APP)。APP 由人類第 21 號染色體的 APP 基因轉錄、轉譯而成，全長的 APP 是第一型跨膜蛋白，產物 APP 會被三種酶複合物切割：α-、β-、γ-分泌酶(α-、β-、 γ-secretase) (Nunan and Small, 2000)。當 APP 被 α-、γ-分泌酶依序切割時，會形成無毒性和可溶性的小分子胜肽：α-分泌酶作用途徑發生在細胞膜外，水解 APP 的 687 和 688 胺基酸殘基間的肽鍵，即在 Aβ 胜肽第 16 個和第 17 個胺基酸之間進行裂解，釋放出一個可溶性的 N 2.

(15) 端產物 sAPPα 和 C83 片段多肽，C83 再經 γ-分泌酶作用，可生成 P3 (Aβ17-40 和 Aβ17-42)，由於分解部位在 Aβ 分子內，故產生的兩個片斷都不含完整的 Aβ，不具備形成澱粉樣沉澱的能力 (Zhang et al., 2011)；而當 APP 被 β-、γ-分泌酶依序切割，形成不可溶的 Aβ，Aβ 會進而堆積形成斑塊：β-secretase 作用於 APP 的 671 和 672 殘基間的胜肽鍵，產生 sAPPβ 和 C99 片段，C99 片段再經 γ-分泌酶的作用水解成不同長度的 Aβ，如在 711-712 殘基間，產生短的 Aβ 肽 Aβ1-40，如在 713-714 殘基間，則產生長的 Aβ 肽 Aβ1-42。Aβ1-40 及 Aβ1-42 是 Aβ 最常見的兩種型態，這兩種型態的差別為 Aβ1-42 比 Aβ1-40 在 C 端多增加了 Ile41 及 Ala42 兩個胺基酸殘基，其中 Aβ1-40 約佔 80%～90%， Aβ1-42 約 10%～20%。雖然 Aβ1-42 胜肽產量較 Aβ1-40 低，但 Aβ1-42 更容易形成澱粉樣蛋白斑塊，也是澱粉樣蛋白斑塊中的主要成分，對神經元的毒性也較大(Roher et al., 1993; Storey and Cappai, 1999)。 Aβ 單體藉由 cross-β 結構互相堆疊，形成澱粉樣蛋白纖維，最後再聚集形成澱粉樣蛋白斑塊(Sunde et al., 1997)，進一步造成對神經的傷害。因此，Aβ 聚集的過程對於治療阿茲海默氏症而言，不可否認是一件相當重要的議題，若能了解其機制，並進一步找出減緩甚至抑制 Aβ 聚集的策略，將是阿茲海默氏症治療上的重大突破。. 3.

(16) 三、 HSPB1、Aβ 聚集與阿茲海默氏症熱休克蛋白(Heat shock protein)，是一種從細菌到哺乳動物中廣泛存在的熱應急蛋白質，許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白質分子量大小，熱休克蛋白共分為五類，分別為 HSP100、HSP90、 HSP70、HSP60 以及小分子熱休克蛋白(Small heat shock proteins)。小熱休克蛋白分子量大小介於 12 和 43 kDa 之間(Ganea, 2001)，屬於細胞內分子伴侶(Van Montfort et al., 2001)。由於小熱休克蛋白缺乏 ATP 酶活性，它們本身不能主動地重新折疊蛋白質，而是透過隔離細胞內錯誤折疊的蛋白質來防止聚集，直到大熱休克蛋白幫助蛋白重新折疊 (Jakob et al., 1993)。熱休克蛋白 B1 (Heat shock protein B1，簡稱 HSPB1)，又稱 HSP27，是在諸多小熱休克蛋白中，被研究甚廣的一種。其除了做為伴護分子外，亦可透過與細胞骨架元件交互作用達到穩定細胞骨架的作用(Landry and Huot, 1995)。此外 HSPB1 還具有多種保護細胞的功能，可與原凋亡蛋白作用以降低細胞凋亡發生(Garrido et al., 1999; Bruey et al., 2000)，並藉由抗凋亡途徑活化 AKT/PKB 途徑，來增加細胞存活率(Rane et al., 2003)。在阿茲海默氏症發病過程中，APP 透過水解切割形成的 Aβ 胜肽可進一步分泌至細胞外並堆積形成斑塊。HSPB1 等多種小熱休克蛋 4.

(17) 白可以抑制 Aβ 纖維的形成(Kudva et al., 1997; Wilhelmus et al., 2006a)，過度表現 HSPB1 亦可保護皮質神經元免於遭受 Aβ 造成的毒性(King et al., 2009)。此外，HSPB1 同樣可結合過度磷酸化的 tau 蛋白並促進其降解(Shimura et al., 2004)，在阿茲海默氏症患者腦中則發現了 HSPB1 與神經纖維纏結交聯(Cross-linking)的現象(Nemes et al., 2004)。由於研究指出 HSPB1 可藉由螯合有毒低聚物如 Aβ 來保護細胞(Ojha et al., 2011)，因此若可活化 HSPB1 表現或可降低 Aβ 聚集，保護神經細胞，達到預防及/或治療阿茲海默氏症的功效。. 四、乙醯膽鹼、乙醯膽鹼脂酶及乙醯膽鹼脂酶抑制劑乙醯膽鹼 (Acetylcholine ，簡稱 ACh) 為一種神經傳遞物質 (Neurotransmitter)，透過膽鹼能神經元(Cholinergic neuron)將乙醯膽鹼釋放到突觸間隙中，並透過特異性途徑結合突觸後或突觸前的毒蕈鹼型受體(Muscarinic receptor)或菸鹼型受體(Nicotinic receptor)，參與調節突觸興奮性和可塑性，並在學習和記憶等各種生理功能中起作用 (Yakel, 2013) 。乙醯膽鹼可保持活性直至乙醯膽鹼脂酶 (Acetylcholinesterase，簡稱 AChE)將其水解成不活化的代謝物：膽鹼 (Choline)及乙酸根(Acetate)。乙醯膽鹼酯酶含有兩個與乙醯膽鹼結合的位點：離子亞位點 5.

(18) (Ionic subsite)及酯化亞位點(Esteratic subsite)。離子亞位點與乙醯膽鹼上的胺基團結合後，起催化作用的酯化亞位點藉醯基化作用，將乙醯膽鹼的酯基裂解。乙醯膽鹼酯酶抑制劑(Acetylcholinesterase inhibitors) 可透過與這兩個位點結合，進一步達到抑制乙醯膽鹼酯酶水解乙醯膽鹼的作用(Enz and Floersheim, 1997)。依據老年病學記憶官能障礙的膽鹼能假說(cholinergic hypothesis)，膽鹼能功能障礙導致認知功能障礙及記憶喪失(Bartus et al., 1982)；此外，亦有研究指出乙醯膽鹼酯酶與阿茲海默氏症病患大腦中 Aβ 聚集有關，乙醯膽鹼酯酶可加速的 Aβ 錯誤摺疊(Inestrosa et al., 1996)。因此，透過乙醯膽鹼酯酶抑制劑降低乙醯膽鹼脂酶活性，或可改善阿茲海默患者的臨床症狀(Schneider, 2000; Muñoz-Torrero, 2008; Inestrosa et al., 2008)。. 五、 NRF2、抗氧化壓力與阿茲海默氏症核因子紅系 2 相關因子 2 (Nuclear factor erythroid 2–related factor 2，簡稱 NRF2)，為一個與氧化還原反應敏感的轉錄因子。正常情況下，凱氏樣 ECH 相關蛋白 1 (Kelch-like ECH-associated protein 1，簡稱 KEAP1)抑制 NRF2 活性，使其保留在細胞質中(Itoh et al., 1999)；當細胞受到氧化應激(Oxidative stress)的攻擊時，NRF2 從 KEAP1 中釋放，並轉移到細胞核。NRF2 進入細胞核後，透過與位於啟動子 6.

(19) (Promoter)上的抗氧化反應元件(Antioxidant response element，簡稱 ARE)結合，進一步促進下游基因轉錄與表現，如：血紅素加氧酶-1 (Heme oxygenase-1，簡稱 HMOX1) (Alam et al., 1999)、NAD(P)H：醌氧化還原酶 1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 ，簡稱 NQO1) (Dhakshinamoorthy and Jaiswal, 2001)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，簡稱 GCLC) (Yang et al., 2005)等，來調節抗氧化相關反應，以對抗氧化壓力，達到抗氧化的功效(Joshi and Johnson, 2012)。由於神經退化疾病與氧化損傷具有密切關連，因此 NRF2 在神經退化疾病如阿茲海默氏症中，亦扮演重要角色(Van Muiswinkel and Kuiperij, 2005)。研究發現，阿茲海默氏症病患神經細胞核內 NRF2 顯著降低(Ramsey et al., 2007)，且 NRF2 缺乏加速了 Aβ 導致的神經元分化能力下降(Kärkkäinen et al., 2014)；而處理可激活 NRF2/ARE 途徑的芍藥甙(Peoniflorin)，則可減輕 Aβ 誘導造成的神經受損(Zhong et al., 2013)。以上研究結果顯示，NRF2 或可作為預防或治療阿茲海默氏症的標靶策略(Yang et al., 2015)。. 六、 CREB、神經生長與阿茲海默氏症環磷腺苷效應元件結合蛋白 (cAMP-response element binding 7.

(20) protein，簡稱CREB)，為一個轉錄因子，可透過磷酸化調節其活性：當細胞激酶A ( protein kinase A，簡稱PKA)磷酸化其絲氨酸133位點 (Serine-133)時，CREB活化(Gonzalez and Montminy 1989; Chrivia et al. 1993)；絲氨酸133位點磷酸化的CREB進一步被肝醣合成酶激酶-3β (Glycogen synthase kinase-3β)磷酸化絲氨酸129位點(Serine-129)時， CREB失去活性(Bullock and Habener, 1998; Grimes and Jope, 2001)。磷酸化活化的CREB，可進入細胞核，並以二聚體(Dimer)的方式與DNA 序列上的環磷腺苷效應元件(cAMP response element)結合，促進下游基因轉錄與表現。腦源性神經滋養因子 (Brain-derived neurotrophic factor ，簡稱 BDNF)為神經滋養因子家族的一員，是 CREB 所調控的一個下游基因 (Tao et al., 1998; Shieh et al., 1998; Tabuchi et al., 2002)，廣泛分佈於中樞神經系統內，與促進神經元的生長存活、神經可塑性及記憶固化有密切關聯(Gorski et al., 2003; Lu, 2003)。轉譯出的 BDNF 前軀蛋白透過細胞內或細胞外加工移除 N-端區域，形成成熟的 BDNF (Seidah et al., 1996; Pang et al., 2004)。成熟的 BDNF 與細胞膜上旋轉肌凝蛋白相關蛋白質激酶 B (Tropomyosin-related kinase B，簡稱 TRKB)結合後，可進一步調控磷酯酶 Cγ1 (phospholipase C gamma 1，簡稱 PLCG1)、AKT 絲胺酸/蘇胺酸激酶(AKT serine/threonine kinase，簡稱 8.

(21) AKT) 、胞外訊息調節激酶 1/2 (Extracellular signal regulated kinase1/2，簡稱 ERK1/2)等活性，來促進神經元的存活、新生、神經突的生長及突觸可塑性(Islam et al., 2009; Murray and Holmes, 2011; Li et al., 2012)。其中 ERK 為神經新生所必須(Barnabé-Heider and Miller, 2003)。磷酸化活化的 ERK 以及 AKT 皆可磷酸化活化 CREB，促進 CREB 進入細胞進行轉錄調節，達到抑制細胞凋亡及促進神經元存活的效果(Bonni et al., 1999; Zanassi et al., 2001; Ying et al., 2002, Pugazhenthi et al., 2000)。 B 細胞淋巴瘤蛋白-2 (B-cell lymphoma 2，簡稱 BCL2)亦為 CREB 蛋白所調節的下游蛋白(Wilson et al., 1996; Pugazhenthi et al., 1999; Riccio et al., 1999; Saini et al., 2004; Meller et al., 2005)。BCL2 是細胞內常見的抗凋亡蛋白(Anti-apoptotic protein)，可以抑制 BCL2 相關 X 蛋白 (Bcl-2 Associated X protein ，簡稱 BAX) 等原凋亡蛋白 (Pro-apoptotic protein)引發粒線體釋放細胞色素 c (Cytochrome c)，來活化細胞凋亡蛋白酶(Caspase)，導致細胞凋亡(Brunelle and Letai, 2009; Portt et al., 2011)。此外，BCL2 對中樞神經系統軸突的發育及再生能力具關鍵作用(Merry et al., 1994; Chen et al., 1997)，且 BCL2 基因的缺失降低了胚胎神經元在培養物中延伸神經突的能力(Hilton et al., 1997)。 9.

(22) 由於阿茲海默氏症與神經損傷及凋亡有密切關聯，阿茲海默病人腦中出現 CREB、AKT、BCL2、BDNF 等蛋白表現量下降的情形(Meng et al., 2002)，而活化 CREB 相關途徑則可以增強記憶功能(Tully et al., 2003)。且有研究指出 Aβ 寡聚體會造成小鼠腦內 ERK-CREB 信號傳遞途徑的下調，加入 Aβ 抗體則可促進 ERK-CREB 信號的活化(Ma et al., 2007)。此外亦有文獻陸續發表銀杏萃取物、人蔘皂苷、丹參等中草藥及植物成份可藉由活化 CREB 途徑來改善造成的 Aβ 認知損傷及細胞凋亡(Tchantchou et al., 2007; Shi et al., 2010; Khodagholi and Ashabi, 2013)。因此，若能透過藥物活化 CREB 途徑，或許可藉由神經保護的方式，降低阿茲海默症對患者帶來的認知障礙及記憶損傷 (Du et al., 2014)。. 七、甘草查爾酮 A (Licochalcone A)、香豆素(Coumarin)及待測化合物甘草查爾酮 A (Licochalcone A)為脹果甘草(Glycyrrhiza inflata)的活性成分，在小腦脊髓萎縮症(Spinocerebellar ataxia)細胞模式研究中，具增強粒線體新生及抗氧化功能，可降低突變的 PolyQ 蛋白引發之粒線體功能障礙及氧化壓力傷害，達到神經保護作用(Chen et al., 2014)。在此研究中，甘草查爾酮 A IC50 細胞毒性在人類野生型的胚 10.

(23) 胎腎 HEK-293 及神經母細胞瘤 SH-SY5Y 細胞分別為 0.30 mM 及 0.06 mM (Chen et al., 2014)。香豆素(Coumarin)最早在香豆(Tonka bean)中被發現，是一種廣泛存在於植物中的香味物質。香豆素可用來治療淋巴水腫(Lymphedema) (Farinola and Piller, 2005)，並具有抗氧化(Kostova et al., 2011)、抗腫瘤(Nolte et al., 1987; Serra et al., 2012)、抗微生物(Matos et al., 2012)等多種功用。此外，香豆素衍生物具有減輕細胞中由 Aβ 所產生的活性氧化物(Reactive oxygen species，簡稱 ROS)的功效(Kontogiorgis et al., 2007)，並可做為乙醯膽鹼酯酶抑制劑，來對抗阿茲海默氏症(Anand et al., 2012)。由於甘草查爾酮A對於人類細胞的毒性稍高，藉著改變苯環上的基團，或可改善查爾酮化合物的細胞毒性。另外，亦有研究報導香豆素-查爾酮混合化合物(coumarin−chalcone hybrid compounds)，呈現好的自由基捕捉能力、低細胞毒性及高細胞保護活性(Pérez-Cruz et al., 2013)。因此本實驗室與本校化學系林文偉老師實驗室合作，藉由置換或改變甘草查爾酮A苯環上的官能基結構，或利用甘草查爾酮A及香豆素兩化合物結構為基底(Base)，合成一系列查爾酮及香豆素的衍生物。經第三型小腦脊髓萎縮症細胞及阿茲海默氏症tau蛋白聚集細胞模式測試後，由25種衍生物中檢測出與甘草查爾酮A/香豆素效果相 11.

(24) 近或更好的，降低polyQ蛋白聚集並幫助tau蛋白的摺疊的5種新穎衍生物：LM-004、LM-006、LM-016、LM-026、LM-031 (圖一)。. 八、藥物篩檢研究目前許多證據指出阿茲海默氏症與氧化壓力及粒線體功能失調導致的細胞凋亡相關(Picone et al., 2014)。而 Aβ 胜肽引發自由基及氧化壓力傷害，會加速神經脂質過氧化、蛋白質氧化、DNA 氧化等，進一步誘發阿茲海默氏症(Butterfield, 1997; Butterfield et al., 2001, 2007)。甘草查爾酮 A 能促進粒線體新生及降低氧化壓力(Chen et al., 2014)，而香豆素亦具抗氧化功能及抑制乙醯膽鹼脂酶活性能力 (Kontogiorgis et al., 2007; Anand et al., 2012)。因此，透過甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物來降低 Aβ 聚集對神經細胞的毒性，將或許是預防及治療阿茲海默氏症的新策略。在細胞實驗部分，利用 Aβ 蛋白連接一段 Linker 後再連接 GFP，其 Aβ 蛋白摺疊會藉由 Linker 影響 GFP 之構形(Waldo et al., 1999)，使 Aβ-GFP 螢光亮度受到 Aβ 胜肽的折疊與溶解度影響，因此當 Aβ 蛋白錯誤摺疊或聚集時，將導致 Linker 後的 GFP 蛋白也錯誤折疊而降低螢光亮度。Aβ-GFP 在細菌細胞誘導表現後，藉分析細胞螢光亮度是否增加，來檢測此化合物是否有助於 Aβ 蛋白正常折疊(Kim et al., 12.

(25) 2006)。先前本實驗室已建構 Aβ-GFP 重組質體以及可添加多西環素 (Doxycycline)誘導表現 Aβ-GFP 的 Tet-On 293/SH-SY5Y 細胞平台(黃鉦翔, 2012)。本研究先以 DPPH 測試了解化合物捕捉自由基(Free radical)之能力，並利用 Thioflavin T 螢光分析探討化合物降低 Aβ 聚集的功效。其次利用誘導表現 Aβ-GFP 的 293 細胞，透過化合物前處理後分析細胞螢光亮度，檢測化合物是否能達到降低胞內活性氧化物含量、細胞內凋亡蛋白酶-3 (Caspase-3)活性等功效，並進一步使用表現 Aβ-GFP 的 SH-SY5Y 細胞分析神經軸突生長(Neurite outgrowth)情形、細胞內凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量及細胞內乙醯膽鹼脂酶活性，確認化合物是否具有神經保護作用。最後使用西方轉漬法(Western blotting)揭示化合物作用之訊息傳遞途徑。由於薑黃素(Curcumin) (圖一 D)為已知有潛能的 Aβ 聚集抑制物(Zhao et al., 2012)，本研究以薑黃素處理作為實驗正控制組。. 13.

(26) 貳、研究目的. 先前實驗室已建構可誘導表現 Aβ-GFP 的 Tet-On 293/SH-SY5Y 細胞平台，進一步檢測順天堂中草藥水萃物時，發現脹果甘草及活性成分甘草查爾酮 A 前處理可增強 Aβ-GFP 的螢光通量。由於甘草查爾酮 A 的 IC50 細胞毒性較高，尚有改善的空間，因此本實驗室與本校化學系林文偉老師實驗室合作，合成甘草查爾酮 A 衍生物：LM-004、 LM-006、LM-026，及以查爾酮及香豆素為基底之衍生物：LM-016、 LM-031。本研究將透過 DPPH 自由基檢測及 Thioflavin T 螢光分析等體外實驗，分析甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物等化合物捕捉自由基及降低 Aβ 聚集的功效，並透過 Tet-On 293/SH-SY5Y Aβ 聚集細胞平台，藉由測試上述化合物前處理後，Aβ-GFP 螢光通量、細胞內活性氧化物含量、細胞內凋亡蛋白酶-3 活性/蛋白表現量、神經突生長、乙醯膽鹼脂酶活性等，來評估上述化合物，是否能幫助 Aβ 摺疊、降低 Aβ 聚集引發的活性氧化物及細胞凋亡、抑制乙醯膽鹼脂酶活性及促進神經突生長等。除此之外，本研究亦利用蛋白表現分析以揭示上述化合物所調控之訊息傳遞途徑。本研究預期甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物能減緩 Aβ 聚集，提供臨床上治療阿茲海默氏症的新的參考策略。 14.

(27) 參、研究材料與方法. 一、 DPPH 自由基清除能力檢測配製山柰酚(Kaempferol)作為標準品，並配置欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(LM-004、LM-006、LM-026、LM-016、 LM-031)以及正控制組薑黃素(10~160 μM)，加入 DPPH (100 μM)及純酒精(200 μl)，於室溫避光反應 30 分鐘後，取各樣品至 96 孔盤中，以全波長吸收光譜(Multiskan GO)分析儀測量 517 nm 吸光值。自由基清除能力計算公式為：DPPH 清除能力 = (1－樣品吸光值/樣品溶劑吸光值) × 100%。. 二、 Thioflavin T 螢光亮度檢測將 Aβ 胜肽(AnaSpec)加入 Reaction buffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH8.0) (Rangachari et al., 2007)中作用，使最後 Aβ 胜肽濃度為 10 μM。加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物以及正控制組薑黃素(5~20 μM)，於 37℃培養箱搖晃(200 rpm)反應 48 小時後，加入 Thioflavin T (10 μM)反應 5 分鐘，最後使用微量螢光盤測定儀(Microplate Fluorescence Reader)選取激發(Excitation) 420 nm 與散發(Emission) 485 nm 讀取螢光值，測定 Aβ 聚集的情形。 15.

(28) 三、細胞培養與繼代本研究使用的 Tet-On 293/SH-SY5Y 細胞(黃鉦翔, 2012)，培養在 10% FBS、0.11 g/l sodium pyruvate、1.5 g/l sodium bicarbonate、5 μg/ml blasticidin、100 μg/ml hygromycin、100 U/ml penicillin、100 U/ml streptomycin 之 DMEM (293 細胞)或 DMEM/F12 (SH-SY5Y 細胞)培養液中。待細胞至 8 分滿，以稀釋 5 倍(SH-SY5Y 細胞)或 10 倍(293 細胞)進行繼代培養。. 四、化合物毒性測試接種 Tet-On Aβ-GFP 293/SH-SY5Y 細胞(5 × 104/well)至 48 孔盤，培養 24 小時讓細胞貼附後，於實驗組加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(0.1~100 μM)，於正控制組加入薑黃素(1~10 μM)。處理一天後，加入 20 μl 的 MTT (5 mg/ml)至細胞中，放置於 37℃、5% CO2 的培養箱中，反應三小時。再加入與細胞液等體積的 MTT 裂解緩衝液 (10% Triton X-100, 0.1 N HCl, 18% isopropanol)，使紫色結晶溶解，並避光靜置一夜。隔天將細胞孔盤放至震盪器上，以 150 rpm 搖 5 分鐘，確認呈色均勻，最後利用光電比色劑(Microplate Spectrophotometers)讀取 OD 值(570 nm)，並分析細胞存活率。 16.

(29) 五、 Aβ-GFP 細胞模式螢光亮度照相將滅菌後儲存於酒精中的玻片以火烤烘乾後放入 12 孔盤中，加入 85 μl 的 poly-L-Lysine (0.1mg/ml) 1 小時進行覆蓋(Coating)。再將玻片上溶液吸掉，並以二次水清洗後靜置於操作台中，打開風扇並照射紫外光 15 分鐘進行殺菌。隨後接種 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞(6 × 104/well)至已覆蓋 poly-L-Lysine 的 12 孔盤中，培養 24 小時讓細胞貼附後，加入正控制組薑黃素(5 μM)前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素(Doxycycline)誘導 Aβ-GFP 表現。三天後，加入 100 ng/ml 的 Hoechst 33342 至培養液，放置於 37℃、5% CO2 的培養箱反應 10 分鐘後，將孔盤中的玻片取出，進行封片並風乾。待風乾後，即可利用共軛焦顯微照相系統(Confocal laser scanning microscopy)進行照相。. 六、 Aβ-GFP 細胞模式篩檢接種 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞(8 × 103/well)至 96 孔盤，培養 24 小時讓細胞貼附後，於實驗組加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(0.001~100 μM)，於正控制組加入薑黃素(1~10 μM)，前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後，於觀測前 30 分鐘加入 100 ng/ml 的螢光染劑 Hoechst 33342，放 17.

(30) 置於 37℃、5% CO2 的培養箱中，反應 30 分鐘使細胞核染色，再利用高通量活細胞影像儀(High content image system，簡稱 HCS)分析 Aβ-GFP 蛋白的螢光通量。. 七、 Aβ-GFP 細胞模式毒性測試接種 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞(8 × 103/well)至 96 孔盤，培養 24 小時讓細胞貼附後，於實驗組加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(0.1~100 μM)，於正控制組加入薑黃素(1~10 μM)，前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後，於負控制組加入 0.1%的 Triton X-100，作為細胞死亡的控制組，並於觀測細胞前 10 分鐘加入 5 μg/ml 的碘化丙啶(Propidium iodide，簡稱 PI)染死細胞，再利用流式細胞儀(Fluorescence activated cell sorter，簡稱 FACS)分析細胞存活率(激發：488 nm；散發：585 nm)。. 八、 Aβ-GFP 細胞模式 Aβ-GFP RNA 表現量檢測接種 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞(3 × 105/well)至 6 孔盤，培養 24 小時讓細胞貼附後，加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素(1 μM) 及 LM-031 衍生物(1~10 μM)、薑黃素(5 μM)，前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後，將舊的培養液吸除， 18.

(31) 並以 PBS 清洗兩次，用 500 μl TRIzol 將細胞收集至微量離心管，並置於冰上反應 5 分鐘後，加入 100 μl 氯仿(Chloroform)上下翻轉並均勻混合後至於冰上 3 分鐘，再利用 4℃、13000 rpm 離心 15 分鐘，分離蛋白質、DNA 及 RNA，離心完後取上層含 RNA 水層至新的微量離心管中，並加入等體積異丙醇於-20℃反應隔夜。次日，以 4℃、13000 rpm 離心 15 分鐘後在去除上清液，並加入 70%酒精清洗去除鹽類， 13000 rpm 離心後去除上清液於室溫風乾後，加入 DEPC ddH2O 15 μl，於 37℃水浴槽回溶 10 分鐘，放置 4℃冰箱。隔日，以超微量分光光度計(NanoDrop ND-100)測定 RNA 濃度，並取 6.25 μg 的 RNA，加入 DNase 於 37℃反應 30 分鐘去除樣品中基因體 DNA (Genomic DNA)，再利用 65℃反應 15 分鐘去除 DNase 酵素活性，並使用 High capacity cDNA reverse tanscription kit 進行反轉錄。利用反應完成的 cDNA，以 HuHPRT 螢光探針 4326321E (控制組)、EGFP 螢光探針 PN4331348 ( 實驗組 ) (Applied Biosystems) 及核酸同步定量系統 (StepOnePlus™ Real-time PCR system)進行同步定量 PCR，偵測誘導的 Aβ-GFP 基因的表現量。. 九、活性氧化物檢測接種 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞(6 × 104/well)至 12 孔盤，培養 24 19.

(32) 小時讓細胞貼附後，於實驗組加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(1~10 μM)，於正控制組加入薑黃素(5 μM)，前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後，將舊的培養液吸除並添加含 5 μΜ CellROX® Deep Red Reagent 的新培養液，放置於 37℃、5% CO2 的培養箱反應 30 分鐘，使試劑與活性氧化物反應產生螢光訊號。之後移除培養液，加入 PBS 洗除試劑後，將細胞收集至試管中，利用流式細胞儀分析細胞內的活性氧化物含量 (激發：635 nm；散發：661 nm)。. 十、凋亡蛋白酶-3 活性檢測接種 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞(3 × 105/well)至 6 孔盤，培養 24 小時讓細胞貼附後，於實驗組加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(1~10 μM)，於正控制組加入薑黃素(5 μM)，前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後，將舊的培養液吸除，並以 PBS 清洗兩次，以 800 g 離心 5 分鐘後，倒掉上清液，再以 800 g 離心 1 分鐘，並收集細胞。隨後加入 100 μl 的裂解緩衝液(50 mM HEPES pH7.4, 50 mM CHAPS, 50 mM DTT)於細胞內反應 30 分鐘，再以液態氮(N2)反覆凍/解凍細胞 8~10 次，使細胞膜破裂後，以 14000 rpm 離心 10~20 分鐘取其上清液，得到細胞內蛋白。 20.

(33) 隨後以全波長吸收光譜分析儀定量蛋白質(25 μg)，再使用 SIGMA® Fluorometric caspase 3 assay kit，使用試劑及方法依照其說明書，加完反應試劑後於培養箱中靜置 1~2 小時。最後利用微量螢光盤測定儀讀其 OD 值(激發：360 nm；散發：460 nm)，並藉由實驗測得之標準曲線(Standard curve)，進一步換算出不同藥物處理下相對應的細胞內凋亡蛋白酶-3 活性。. 十一、神經突生長觀測利用 TUBB3 抗體結合細胞微管蛋白 III (Class III β-tubulin)，再利用高通量活細胞影像儀進行拍照，分析經由維生素 A 酸(Retinoic acid)誘導神經分化的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞神經突的生長變化。接種 Tet-On Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞(3 ×104/well)至 24 孔盤，加入維生素 A 酸(10 μM)誘導神經分化。培養 24 小時讓細胞貼附後，於實驗組加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(1~10 μM)，於正控制組加入薑黃素(5 μM)，前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現，加藥後每兩天後更換培養液、維生素 A 酸、多西環素及欲檢測化合物。6 天後吸除培養液，以 PBS 清洗細胞兩次，再加入 4%的多聚甲醛(Paraformaldehyde)，於 4℃反應 15 分鐘使細胞固定。隨後換掉多聚甲醛，以 PBST (0.05% Tween 20 in PBS) 21.

(34) 清洗細胞 2 次，每次反應 10 分鐘以通透細胞膜，再加入含有 1%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)的 PBST 反應 1~2 小時。之後清洗細胞，再加入 TUBB3 抗體(1:1000，BioLegend)，於 4℃反應 24 小時。隔天以 PBST 清洗細胞 2 次後，加入 Anti-rabbit Alexa Fluor® 555(1:1000，Molecular probes)，與 4’-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:1000)一起在室溫下避光反應 3 小時，以 PBS 清洗之。最後利用高通量活細胞影像儀進行拍照，分析神經突總生長 (Total outgrowth)。. 十二、乙醯膽鹼脂酶活性測試接種 Tet-On Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞(4 ×105/well)至 6 孔盤，加入維生素 A 酸(10 μM)誘導神經分化。培養 24 小時讓細胞貼附後，加入欲檢測的甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(1 μM)，於正控制組加入薑黃素(5 μM)，前處理 8 小時後，加入 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現，之後每兩天後更換培養液、維生素 A 酸、多西環素及欲檢測化合物。6 天後吸除培養液，以冰 PBS 收集細胞，以 2000 rpm 離心 5 分鐘後，將 PBS 吸掉；再以 1 ml 冰的 PBS 懸浮細胞，以 2000 rpm 離心 10 分鐘後，將 PBS 吸掉，隨後加入 60 μl 冰的 PBS，進行超音波震盪破碎細胞。將細胞破碎後，以 13000 rpm 離心 5 分鐘，取 22.

(35) 上清液放至新管，利用全波長吸收光譜讀盤並定量蛋白質(20 μg)。接著使用 SIGMA® Acetylcholinesterase Activity Assay Kit 的試劑及方法，以全波長吸收光譜分別讀其兩分鐘及十分鐘時的 OD412 值，進一步換算出不同化合物處理下相對應的細胞內乙醯膽鹼脂酶活性。. 十三、西方轉漬法接種Tet-On Aβ-GFP SH-SY5Y細胞(4 ×105/well)至6孔盤，加入維生素A酸(10 μM)誘導神經分化。培養24小時讓細胞貼附後，加入欲檢測的甘草查爾酮A、香豆素及衍生物LM-031 (1 μM)，前處理8小時後，加入2 μg/ml的多西環素誘導Aβ-GFP表現，加藥後每兩天後更換培養液、維生素A酸、多西環素及欲檢測化合物。6天後吸除培養液，以 PBS清洗細胞兩次，以800 g離心5分鐘後，倒掉上清液，再以800 g離心1分鐘來收集細胞。隨後加入RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH8.0, 1 mM EGTA pH8.0, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Triton X-100) 及 Protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)，並備於冰浴中利用超音波細胞粉碎儀，將細胞破碎後，使用14000 g離心20分鐘，取上清液放至新管，利用全波長吸收光譜讀盤並定量蛋白質。定量後，將樣品(30 μg)加入適量6X SDS樣品緩衝液(0.35 M Tris-Cl pH6.8, 10% SDS, 30% Glycerol, 9.3% DTT)，離心後加上防爆蓋，在沸水中煮5分鐘。隨後進行SDS-聚丙烯 23.

(36) 醯胺電泳(SDS-PAGE)，再將蛋白轉漬至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。轉漬完成後將PVDF膜放入含5%牛奶的PBS 中，於4℃反應隔夜或室溫反應2小時進行Blocking，再使用清洗緩衝液(Tris-HCl pH8.0, 0.05% Tween 20)清洗PVDF膜三次，每次15分鐘。而後加入一級抗體：NRF2抗體(1:500, Santa cruz)、NQO1抗體(1:500, Sigma-aldrich)、GCLC抗體(1:1000, Abcam)、CREB抗體(1:500, Santa cruz)、pCREB (Ser133)抗體(1:500, Millipore)、BDNF抗體(1:500, Santa cruz)、AKT抗體(1:1000, Cell signaling)、pAKT (Thr308、Ser473)抗體 (1:500, Cell signaling)、ERK1/2抗體(1:1000, Cell signaling)、pERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗體(1:1000, Cell signaling)、BCL2抗體(1:500, Santa cruz)、BAX抗體(1:500, Biovision)、HSPB1抗體(1:500, Santa cruz)、 GFP抗體(1:500, Santa cruz)、Caspase-3抗體(1:500, Cell signaling)、 Actin 抗體 (1:5000, Novus biolgicals) 、 β-Tubulin 抗體 (1:5000, Sigma-aldrich)、GAPDH抗體(1:1000, MDBio)，於4℃反應隔夜或室溫反應2小時，再使用Wash buffer清洗PVDF膜三次，每次15分鐘。接著加入山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)共軛的山羊抗鼠、山羊抗兔或驢抗山羊二級抗體(1:5000, Gene-Tex)於室溫反應2小時，再使用清洗緩衝液清洗PVDF膜三次，每次15分鐘。最後加入冷光呈色試劑 (Millipore)，使用冷光螢光影像擷取系統(ImageQuant LAS 4000)照相 24.

(37) 並分析蛋白表現。. 十四、統計分析所有數據均表示為平均值和標準差。兩組之間的統計顯著性用學生 t 檢驗(Student t-test)進行分析，P < 0.05 被認為在統計上達到顯著差異。. 25.

(38) 肆、結果. 一、 DPPH 自由基清除能力分析利用 DPPH assay，計算標準品山奈酚及待測化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物，以及正控制組薑黃素(10~160 μM)自由基清除能力。如圖二 A 所示，各化合物隨著處理濃度的上升，清除 DPPH 自由基能力均隨之上升，具有劑量依存性(Dose-dependent)的作用。利用實驗結果，進一步算出各化合物清除自由基的 EC50 如下：山奈酚 27 μM、甘草查爾酮 A 130 μM、LM-004 104 μM、LM-006 145 μM、 LM-026 56 μM、香豆素 178 μM、LM-016 169 μM、LM-031 105 μM、薑黃素 55 μM。. 二、 Thioflavin T 螢光分析藉由 Thioflavin T 螢光分析，檢測待測化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物以及正控制組薑黃素(5~20 μM)，於體外降低 Aβ 聚集的能力。如圖二 B 所示，各化合物隨著處理濃度的上升，降低 Aβ 聚集能力均隨之上升，且具有劑量依存性的作用。利用實驗結果，進一步算出各化合物抑制 Aβ 聚集的 EC50 如下：甘草查爾酮 A 18 μM、 LM-004 21 μM、LM-006 12 μM、LM-026 30 μM、香豆素 27 μM、 26.

(39) LM-016 15 μM、LM-031 11 μM、薑黃素 27 μM。所檢測化合物中，以 LM-031 降低 Aβ 聚集能力最好。. 三、待測化合物細胞毒性分析將未誘導 Aβ-GFP 表現的 Tet-On 293 及 SH-SY5Y 細胞分別種至 48 孔盤，培養 24 小時讓細胞貼附後，加入欲檢測的化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物(0.1~100 μM)與正控制組薑黃素(1~10 μM) 後，利用 MTT assay 測得細胞存活率(圖三 A)。如圖三 B、C 所示，未誘導 Aβ-GFP 表現時，隨著處理化合物濃度的上升，293 或 SH-SY5Y 細胞存活率均隨之下降。利用實驗結果，進一步算出各化合物對 Aβ-GFP 293/SH-SY5Y 細胞的 IC50 如下：甘草查爾酮 A 51/47 μM、 LM-004 51/8 μM、LM-006 51/10 μM、LM-026 71/45 μM、香豆素 >100/>100 μM、LM-016 >100/55 μM、LM-031 >100/>100 μM、薑黃素 >10/>10 μM。甘草查爾酮 A、香豆素及 LM 衍生物中，以 LM-031 的細胞毒性最低。. 四、正控制組薑黃素的 Aβ-GFP 293 細胞分析利用薑黃素(1~10 μM)前處理 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞，8 小時後使用 2 μg/ml 的多西環素(Dox)誘導 Aβ-GFP 表現。三天後利用高通量 27.

(40) 活細胞影像儀分析 Aβ-GFP 蛋白的螢光通量、細胞數，並以核酸同步定量系統分析 Aβ-GFP RNA 表現(圖四 A)。結果發現隨著薑黃素處理濃度的上升，Aβ-GFP 蛋白螢光亮度亦有顯著提升，在 2.5 及 5 μM 的薑黃素處理下，螢光亮度分別可達到未加藥處理組別的 106% (P = 0.012)及 120% (P = 0.006)，具有劑量依存性的關係。在 10 μM 薑黃素的處理組中，由於相對細胞數目已經低於未加藥處理組的 80%，對細胞毒性較高，故不探討該濃度對 Aβ-GFP 蛋白螢光亮度造成的影響 (圖四 B)。圖四 C 為未處理(Untreat)及處理薑黃素(+ Curcumin, 5 μM) 的共軛焦顯微影像。同步定量 RNA 分析結果顯示，相較於未誘導(Dox)組別，誘導組 Aβ-GFP RNA 表現量提升至 25 倍(+ Dox)；處理薑黃素(+ Curcumin, 5 μM)並未顯著增加 Aβ-GFP RNA 表現量(圖四 D)，故推論所測得之 Aβ-GFP 蛋白螢光亮度提升(圖四 B)，並非透過增加 RNA 轉錄量。. 五、待測化合物的 Aβ-GFP 293 細胞篩檢分析利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物前處理 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞，並使用 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後利用高通量活細胞影像儀分析 Aβ-GFP 蛋白的螢光通量、細胞數及 IC50 細胞毒性，並以核酸同步定量系統分析 Aβ-GFP RNA 表現(圖 28.

(41) 五 A)。當所測得的相對細胞數低於 80%時，將不探討該濃度對 Aβ-GFP 蛋白螢光亮度之影響。實驗結果發現，在 Aβ-GFP 表現的 293 細胞中，LM-004 的細胞毒性較大，在處理濃度 1 μM 時，相對細胞數已降至 74%，而 LM-016 及 LM-031 對細胞毒性較低，10 μM 濃度時相對細胞數仍有 80%以上。相較於未處理化合物組別，隨著各化合物處理濃度上升，Aβ-GFP 蛋白的螢光亮度亦顯著上升，各化合物有效濃度/螢光亮度上升情形分別是甘草查爾酮 A：1 nM ~ 1 μM/105~115% (P = 0.008 ~ <0.001)、LM-004：1 nM ~ 0.1 μM/103~111% (P = 0.019 ~ <0.001)、LM-006：1 nM ~ 1 μM/105~112% (P = 0.002 ~ 0.001)、 LM-026：10 nM ~ 1 μM/102~105% (P = 0.042 ~ 0.005)、香豆素：10 nM ~ 1 μM/103~109% (P = 0.017 ~ 0.005) 、 LM-016 ： 1 nM ~ 10 μM/103~117% (P = 0.033 ~ 0.006)、LM-026：1 nM ~ 10 μM/107~125% (P = 0.007 ~ <0.001) (圖五 B)。綜合上述結果，甘草查爾酮 A、香豆素及 LM 衍生物可降低 Aβ 的錯誤摺疊，但其中以 LM-031 的效果為最佳。. 六、待測化合物的 Aβ-GFP 293 細胞毒性分析如圖五 A 所示，利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM 衍生物 (0.1~100 μM)與正控制組薑黃素(1~10 μM)前處理 Tet-On Aβ-GFP 293 29.

(42) 細胞，並以 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現，三天後以碘化丙啶染死細胞，再以流式細胞儀分析細胞存活率。經實驗結果得知，隨著化合物處理濃度上升，細胞存活率隨之下降。利用測得之細胞存活率進一步算出甘草查爾酮 A、香豆素、薑黃素的 IC50 分別為：76、70 及 11 μM，LM 衍生物中，LM-004 對細胞造成的毒性最高(IC50 48 μM)，而 LM-031 對於細胞造成的毒性最低(IC50 95 μM) (圖五 C)，此結果與先前使用 MTT 測試未誘導細胞所推算出的 IC50 趨勢相近。. 七、化合物處理 Aβ-GFP 293 細胞模式的 Aβ-GFP RNA 表現量分析利用化合物甘草查爾酮A、香豆素(1 μM) 及衍生物LM-031 (1~10 μM)前處理Tet-On Aβ-GFP 293細胞，並使用2 μg/ml的多西環素誘導 Aβ-GFP表現。三天後利用核酸同步定量系統偵測Aβ-GFP RNA表現 (圖五A)。經實驗結果得知，相較於未誘導(- Dox)組別，誘導組Aβ-GFP RNA表現量提升至25倍(+ Dox)；處理甘草查爾酮A (Lico. A) (1 μM)、香豆素(Cou.) (1 μM)、LM-031 (1~10 μM)後，並未顯著增加Aβ-GFP RNA表現量(圖五D)，故所測得之Aβ-GFP蛋白螢光亮度提升(圖五 B)，並非透過增加RNA轉錄量。. 30.

(43) 八、活性氧化物分析利用化合物甘草查爾酮 A、LM-006、LM-026、香豆素(1 μM)及 LM-016、031 (1~10 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)處理 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞，並使用 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後利用流式細胞儀分析細胞活性氧化物含量的變化(圖六 A)。以未誘導組別(-Dox)測得的細胞內活性氧化物含量作為 100%，則加入多西環素誘導的組別(+Dox)細胞內活性氧化物含量顯著上升，達到 122% (P = 0.007)，前處理正控制組薑黃素(5 μM)，可使細胞內活性氧化物含量回降至 89%左右 (P = 0.002)，前處理待測各化合物後，細胞內活性氧化物含量亦均可顯著的下降。如以 1 μM 的甘草查爾酮 A、LM-006、 LM-026、香豆素前處理後，細胞內 ROS 含量可分別回降至 97% (P = 0.003)、98% (P = 0.002)、100% (P = 0.002)、91% (P = 0.003)；而以 1~10 μM 的 LM-016 及 031 處理後，細胞內活性氧化物含量則可分別回降至 98~93% (P = 0.002)、89~75% (P = 0.001 ~ <0.001)，且有劑量依存性的作用。所檢測的 LM 化合物中，LM-031 對於降低細胞內活性氧化物含量含量有最顯著的效果(圖六 B)。. 九、凋亡蛋白酶-3 活性分析如圖六 A 所示，利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、 31.

(44) LM-026 (1 μM)及 LM-016、LM-031(1~10 μM)與正控制組薑黃素(5 μM) 處理 Tet-On Aβ-GFP 293 細胞，並使用 2 μg/ml 的多西環素誘導 Aβ-GFP 表現。三天後收集細胞及收集蛋白，利用 SIGMA® Fluorometric Caspase 3 assay kit 測得細胞內凋亡蛋白酶-3 活性。以未誘導組別(-Dox)測得的細胞內凋亡蛋白酶-3 活性作為 100%，則加入多西環素誘導的組別(+Dox)細胞內凋亡蛋白酶-3 活性顯著上升，達到 116% (P = 0.002)。實驗結果顯示，正控制組 5 μM 薑黃素的部分，可使細胞內凋亡蛋白酶-3 活性回降至 100%左右(P = 0.008)，處理各化合物後，細胞內凋亡蛋白酶-3 活性均可達到顯著的回降。以 1 μM 的甘草查爾酮 A、LM-006、LM-026、香豆素處理，細胞內凋亡蛋白酶 -3 活性可分別回降至 106% (P < 0.001)、107% (P = 0.036)、107% (P = 0.001)、105% (P =0.003)；而以 1~10 μM 的 LM-016 及 LM-031 處理後，細胞內凋亡蛋白酶-3 活性則可分別回降至 107~103% (P = 0.006 ~ 0.002)、104~100% (P < 0.001)，且有劑量依存性的作用，其中又以 LM-031 對於降低細胞內凋亡蛋白酶-3 活性有最顯著的效果(圖六 C)。. 十、神經突生長分析利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、LM-026 (1 μM)及 LM-016、LM-031(1~10 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)前處理神經分化 32.

(45) 的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用 TUBB3 (Class III β-tubulin)抗體結合微管後，再利用高通量活細胞影像儀進行神經突生長的拍照分析(圖七 A)。圖七 B 為未誘導(Uninduced)、誘導(Induced)、甘草查爾酮 A (Licochalcone A)、LM-016、LM-031 (1 μM)及薑黃素(Curcumin, 5 μM)處理的 Aβ-GFP 細胞神經突生長顯微影像。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox) 測得的神經突生長情形作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)神經突生長顯著下降(87%，P = 0.001)。正控制組 5 μM 薑黃素前處理，可使細胞神經突生長回升至 107% (P < 0.001)。前處理甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物後，細胞神經突生長亦達到顯著的回升：以 1 μM 的甘草查爾酮 A、LM-006、026、香豆素處理，神經突生長分別回升至 102% (P < 0.001)、100% (P = 0.002)、99% (P < 0.001)、100% (P < 0.001)，而以 1~10 μM 的 LM-016 及 031 處理後，神經突生長則可分別回升至 98~103% (P = 0.003 ~ <0.001)、104 ~110% (P = 0.003 ~ <0.001)，且呈現劑量依存的效果，其中又以 LM-031 回復神經突生長的能力最佳(圖七 C)。. 十一、凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量分析利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、LM-026、LM-016、 33.

(46) LM-031(1 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)前處理神經分化的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用西方轉漬法，分析蛋白表現量(圖八 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得的凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量顯著增加(168%，P = 0.040)。正控制組 5 μM 薑黃素前處理，可使凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量回降至 92% (P = 0.015)。前處理甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物後，凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量亦達到顯著的回降：以 1 μM 的甘草查爾酮 A、LM-006、026、香豆素、016、031 處理，凋亡蛋白酶-3 蛋白表現量分別回降至 101% (P = 0.029)、93% (P = 0.020)、96% (P = 0.018)、104% (P = 0.026)、101% (P = 0.023)、94% (P = 0.016) (圖八 B)。. 十二、乙醯膽鹼脂酶活性分析利用化合物甘草查爾酮 A、香豆素、LM-006、LM-026、LM-016、 LM-031 (1 μM)與正控制組薑黃素(5 μM)前處理神經分化的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用 SIGMA® Acetylcholinesterase Activity Assay Kit，測得細胞內乙醯膽鹼脂酶活性(圖八 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得的乙 34.

(47) 醯膽鹼脂酶活性作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)乙醯膽鹼脂酶活性顯著增加(122%，P = 0.041)。正控制組 5 μM 薑黃素前處理，可使乙醯膽鹼脂酶活性回降至 103% (P = 0.041)。前處理甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物後，乙醯膽鹼脂酶活性除 LM-006 外，其他亦達到顯著的回降：以 1 μM 的甘草查爾酮 A、026、香豆素、LM-016、031 處理，乙醯膽鹼脂酶活性分別回降至 98% (P = 0.017)、105% (P = 0.048)、102% (P = 0.033)、103% (P = 0.038)、97% (P = 0.017)，其中又以 LM-031 降低乙醯膽鹼脂酶活性的能力最佳(圖八 C)。依據上述實驗結果，新穎合成衍生物中，LM-031 為最具潛力的甘草查爾酮 A 及香豆素衍生物(表一)，故後續實驗將僅探討甘草查爾酮 A、香豆素及 LM-031 三者處理細胞造成的蛋白質表現量變化。. 十三、 NRF2 與下游抗氧化壓力蛋白表現量分析利用化合物 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素(1 μM)前處理神經分化的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用西方轉漬法，分析蛋白表現量(圖九 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 NRF2、GCLC、NQO1 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細 35.

(48) 胞內 NRF2、GCLC、NQO1 蛋白表現量分別顯著下降至 76% (P = 0.030)、84% (P = 0.014)、75% (P = 0.007)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內抗氧化蛋白表現量達到顯著的回升：NRF2 蛋白表現量分別回升至 112% (P = 0.042)、110% (P =0.044)、108% (P = 0.014)；GCLC 蛋白表現量分別回升至 110% (P = 0.041)、110% (P =0.025)、115% (P = 0.041)；NQO1 蛋白表現量分別回升至 137% (P = 0.015)、124% (P = 0.032)、117% (P = 0.036) (圖九 B、C)。此外，透過西方轉漬法分析熱休克蛋白 (Heat shock protein beta-1，簡稱 HSPB1)及 Aβ-GFP 蛋白表現量，來了解化合物是否可透過增加 HSPB1 表現，改善 Aβ-GFP 蛋白摺疊，而增加 Aβ-GFP 溶解度。HSPB1 蛋白表現量的部分，以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox) 測得細胞內 HSPB1 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)，細胞內 HSPB1 蛋白表現量顯著下降 (77%，P = 0.016)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內 HSPB1 蛋白表現量分別顯著的回升至 90% (P = 0.029)、 90% (P = 0.025)、93% (P = 0.048)。在可溶性 Aβ-GFP 蛋白的部分，未誘導組別(- Dox)並未偵測到 Aβ-GFP 表現，以加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別 (+ Dox) 細胞內可溶性 Aβ-GFP 蛋白量作為 36.

(49) 100%，則前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內可溶性 Aβ-GFP 蛋白量分別顯著的增加至 170% (P = 0.018)、162% (P = 0.021)、165% (P = 0.016) (圖九 D、E)。. 十四、 CREB 與下游神經生長相關蛋白表現量分析利用化合物 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素(1 μM)前處理神經分化的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用西方轉漬法，分析 CREB 與下游神經生長相關蛋白表現量(圖十 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 CREB、pCERB、BDNF 前驅物及 BDNF 成熟蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內 CREB、 pCERB、BDNF 前驅物及 BDNF 成熟蛋白表現量分別顯著下降至 84% (P = 0.016)、70% (P = 0.007)、88% (P = 0.021)、80% (P = 0.034)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內神經生長相關蛋白表現量達到顯著的回升：CREB 蛋白表現量分別回升至 96% (P = 0.017)、96% (P =0.031)、96% (P = 0.013)；pCERB 蛋白表現量分別回升至 110% (P = 0.011)、122% (P =0.001)、103% (P = 0.002)；BDNF 前驅物蛋白表現量分別回升至 110% (P = 0.012)、104% (P =0.042)、 105% (P = 0.041)；BDNF 成熟蛋白表現量分別回升至 110% (P = 37.

(50) 0.033)、120% (P =0.031)、114% (P = 0.023) (圖十 B、C)。同為 CREB 蛋白所調節的下游蛋白 BCL2，以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 BCL2 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內 BCL2 蛋白表現量顯著下降(87%，P = 0.005)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內 BCL2 蛋白表現量分別顯著的回升至 107% (P = 0.038)、 94% (P = 0.016)、95% (P = 0.013)。與 BCL2 蛋白相互對立的 BAX 蛋白表現量部分，同樣以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 BAX 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內 BAX 蛋白表現量顯著上升(132%，P = 0.013)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內 BAX 蛋白表現量則分別顯著的回降至 86% (P = 0.004)、83% (P = 0.004)、91% (P = 0.002) (圖十 B、C)。此外，以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 CREB 途徑下游 AKT、pAKT(T308)、pAKT(S473)、ERK 及 pERK 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)，細胞內 AKT、pAKT(T308) 、pAKT(S473)、ERK 及 pERK 蛋白表現量分別顯著下降至 72% (P = 0.012)、79% (P = 0.003)、71% (P = 0.022)、 86% (P = 0.034)、79% (P = 0.002)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查 38.

(51) 爾酮 A 及香豆素後，細胞內 CREB 途徑下游相關蛋白表現量達到顯著的回升：AKT 蛋白表現量分別回升至 95% (P = 0.017)、92% (P =0.009)、92% (P = 0.014)；pAKT(T308)蛋白表現量分別回升至 103% (P = 0.008)、104% (P =0.007)、97% (P = 0.032)；pAKT(S473)蛋白表現量分別回升至 113% (P = 0.045)、117% (P = 0.001)、101% (P = 0.012)；ERK 蛋白表現量分別回升至 102% (P = 0.033)、102% (P =0.018)、96% (P = 0.042)；pERK 蛋白表現量分別回升至 104% (P = 0.037)、102% (P =0.031)、97% (P = 0.018) (圖十 D、E)。. 39.

(52) 伍、討論先前本實驗室研究發現雖然甘草查爾酮 A 具有神經保護性作用，但對人類細胞毒性較高(Chen et al., 2014)，尚有改善空間。香豆素及其衍生物廣泛存在於自然界植物中，具有抗氧化、抗癌、抗微生物等多種功用(Nolte et al., 1987; Kostova et al., 2011; Matos et al., 2012; Serra et al., 2012)。有研究指出香豆素-查爾酮混合化合物具有不同藥理學性質，是具有發展潛力的藥劑(Wei et al., 2016)，因此本研究藉由置換或改變甘草查爾酮 A 苯環上的官能基結構，及利用查爾酮及香豆素兩化合物結構為基底，合成一系列的衍生物(圖一)。化合物結構部分，LM-004、LM-006 及 LM-026 結構與甘草查爾酮 A 較相似，主要共同的改變是苯環上 OH 基數目及 OCH3 基相對位置，以增加水溶性及活化基供給電子的能力；LM-016 及 LM-031 是以查爾酮及香豆素為基底所合成的衍生物，以期藉由兩分子化學結構改變增加化合物對神經保護功能。透過實驗結果發現，不論是使用未誘導的 Aβ-GFP 293 及 SH-SY5Y 細胞(圖三)，或是加入多西環素誘導的 Aβ-GFP 293 細胞(圖五)，LM-006、LM-026 與甘草查爾酮 A 對細胞的毒性相似， LM-004 則明顯較高。相較於甘草查爾酮 A 及其衍生物，利用查爾酮及香豆素為基底所製備的 LM-016、LM-031 衍生物以及香豆素本身對細胞的毒性較低。因此就對細胞毒性而言，LM-016 及 LM-031 將 40.

(53) 或許是較具有潛力的低毒性藥物。在實驗設計部分，由於細胞外實驗只靠單一化合物反應，通常所需的化合物濃度較高；而細胞內實驗化合物則可以透過啟動分子機制等方式進行反應，通常不需使用到高濃度便可觀察到化合物之功效。因此在化合物濃度選擇的部分，細胞外實驗中均只測試較高的化合物濃度：DPPH 自由基清除能力檢測使用 10~160 μM、Thioflavin T 螢光亮度檢測則使用 5~20 μM；細胞內實驗最開始測試時則從低濃度到高濃度(0.001~100 μM)進行廣泛的檢測。透過實驗結果可以發現，在細胞外實驗中，化合物對於 DPPH 自由基清除能力的 EC50 普遍需要 50~200 μM，Thioflavin T 螢光亮度檢測部分的 EC50 則皆在 10 μM 以上；然而在細胞內實驗中，各化合物最有效濃度均落在 1~10 μM，過高的化合物濃度則會對細胞造成壓力使細胞死亡。透過對實驗結果的觀察，可進一步確認化合物在細胞內所需有效濃度確實較細胞外實驗中低。 Aβ 斑塊在腦中堆積一直被認為是造成阿茲海默氏症發病的主要原因之一(Selkoe, 1989)，減少 Aβ 斑塊的產生或加速 Aβ 斑塊清除，將有助於減緩阿茲海默氏症發病。Thioflavin T 透過其與富含 β-sheet 結構結合後會增強訊號及放射光譜位移的特性，被廣泛用於辨識錯誤摺疊與聚集的 Aβ (Saeed and Fine, 1967; Khurana et al., 2005)。本研究 41.

(54) 在體外實驗的部分，透過 Thioflavin T 螢光分析，發現甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物可抑制 Aβ 蛋白的聚集(圖二)，由於不可溶 Aβ 的 β-sheet 結構可透過氫鍵 (Hydrogen bond) 及疏水力 (Hydrophobicity forces)使彼此結合，進一步聚集與堆積(Favrin et al., 2004)，因此化合物或許可藉由透過與 Aβ 結合、形成立體障礙或提供氫鍵等方式阻止 Aβ 聚集與堆積(Lowe et al., 2001; Wu et al., 2007; Scherzer-Attali et al., 2010) ，也意味著這些化合物扮演著化學性伴護分子 (Chemical chaperone)的角色。細胞實驗的部分，則利用已建構的 Aβ-GFP 293 細胞平台，檢測化合物改善 Aβ 的錯誤摺疊及細胞毒性(圖五)。各化合物的半數致死量細胞毒性與有效改善 Aβ 錯誤摺疊劑量 (IC50 cytotoxicity/effective dose)的比值分別為：甘草查爾酮 A/76~76000、 LM-004/480~48000、LM-006/58~58000、LM-026/61~6100、香豆素 /70~7000、LM-016/8.1~81000、LM-031/9.5~95000，皆遠較正控制組薑黃素寬廣(2.2~4.4)，其中 LM-031 在檢測的化合物中，比值範圍最大且細胞毒性最低。文獻指出，HSPB1 可調節 Aβ 聚集並作為 Aβ 的拮抗劑(Wilhelmus et al., 2006b)，HSPB1 保護皮質神經元免受 Aβ 誘導造成的損傷(King et al., 2009)，過度表達 HSPB1 可降低了 APP/PS1 小鼠的澱粉樣蛋白斑塊沉積(Tóth et al., 2013)。另外，通過化學伴護分子活性和增強 42.

(55) HSPB1 表達，合成的吲哚/吲哚喹啉化合物 NC009-1/NC009-7 已經被發現能夠減少 Aβ 和 tau 蛋白的錯誤折疊和/或聚集(Chang et al., 2016, 2017)。先前許多研究分別發現 HSPB1 等多種熱休克蛋白在阿茲海默氏症患者腦中有上調的現象(Iwaki et al., 1992; Renkawek et al., 1994)，然而可能由於熱休克蛋白活性的降低，即使熱休克蛋白表現量增多，仍無法達到清除 Aβ 的效果；而隨著受損及錯誤摺疊蛋白的增加，亦會導致老年細胞中伴護分子活性的下降(Micha et al., 2007; Csermely, 2001)。本實驗中，加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，HSPB1 蛋白量顯著下降，造成此結果可能是由於 HSPB1 與 Aβ-GFP 作用且結合後溶解度下降導致；而加入甘草查爾酮 A、香豆素及 LM-031 前處理後，HSPB1 的蛋白表現量則顯著增加，並伴隨著可溶性 Aβ-GFP 蛋白量的提升(圖九)。類似於先前發表的吲哚/吲哚喹啉化合物，甘草查爾酮 A、香豆素及 LM-031 亦具有化學伴護分子活性並能透過增強 HSPB1 表達，來減少 Aβ 錯誤折疊和聚集。甘草查爾酮 A 可藉由捕捉不成對電子，進一步達到清除自由基的功效，並具增強粒線體新生及抗氧化功能，可降低突變的 polyQ 蛋白引發之粒線體功能障礙及氧化壓力傷害，達到神經保護作用(Chen et al., 2014)。阿茲海默氏症與自由基間存在諸多關聯性，Aβ 斑塊堆 43.

(56) 積將造成腦中氧化壓力上升，並進一步導致阿茲海默氏症 (Butterfield, 1997; Butterfield et al., 2001; Tabner et al., 2002)。本研究探討的甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物，具有捕捉自由基的能力。先前有研究指出酚類化合物的抗氧化活性取決於苯環上活性 OH 基團的數量和位置(Bendary et al., 2013)，苯環上 OH 基團清除自由基機制主要透過供氫原子與自由基反應生成酚氧自由基，該酚氧自由基又受到芳香環大共軛體系的共振穩定，從而終止自由基鏈式反應，通過這種作用可以清除自由基(孟慶華等，2012；陳永鈞等，2013)。本研究所測試的化合物中，甘草查爾酮 A、LM-004、LM-006、LM-026 有類似的查爾酮(Chalcone)結構(圖十一 A)，其清除自由基的 EC50 及苯環上 OH 基團的數目分別為：130 μM/2、103 μM/1、145 μM/1、56 μM/2 (圖十一 B)。對 LM-004、LM-006、LM-026 而言，活性 OH 基團的數量或許是造成抗氧化活性不同的原因，而甘草查爾酮 A 雖然與 LM-026 般有 2 個活性的 OH 基團，苯環上 OH 基團鄰位的 C5H8 基團，可能由於立體障礙，抑制了 OH 基團的自由旋轉，使得自由基不易與 OH 基團接近，導致甘草查爾酮 A 清除自由基的能力降低(王立娟等， 2008)。另有文獻指出，供電子基團如甲氧基活化基，若在酚的 2,4,6 位置發生取代，可增加抗氧化活性(Scott, 1963)，甘草查爾酮 A、 LM-026 的 OH 基團分別在酚的 3、2 位置上，或許也是造成甘草查爾 44.