利用化合物 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素(1 μM)前處理神經 分化的Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，並以多西環素(2 μg/ml)誘導 Aβ-GFP 表現。六天後，利用西方轉漬法，分析 CREB 與下游神經生長相關蛋 白表現量(圖十 A)。以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 CREB、pCERB、BDNF 前驅物及 BDNF 成熟蛋白表現量作為 100%，
則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內 CREB、
pCERB、BDNF 前驅物及 BDNF 成熟蛋白表現量分別顯著下降至 84%
(P = 0.016)、70% (P = 0.007)、88% (P = 0.021)、80% (P = 0.034)。前 處理1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內神經生長 相關蛋白表現量達到顯著的回升：CREB 蛋白表現量分別回升至 96%
(P = 0.017)、96% (P =0.031)、96% (P = 0.013)；pCERB 蛋白表現量分 別回升至 110% (P = 0.011)、122% (P =0.001)、103% (P = 0.002)；BDNF 前驅物蛋白表現量分別回升至 110% (P = 0.012)、104% (P =0.042)、
105% (P = 0.041)；BDNF 成熟蛋白表現量分別回升至 110% (P =
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0.033)、120% (P =0.031)、114% (P = 0.023) (圖十 B、C)。
同為 CREB 蛋白所調節的下游蛋白 BCL2，以未誘導 Aβ-GFP 表 現組別(- Dox)測得細胞內 BCL2 蛋白表現量作為 100%，則加入多西 環素誘導Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)細胞內 BCL2 蛋白表現量顯著下 降(87%，P = 0.005)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆 素後，細胞內 BCL2 蛋白表現量分別顯著的回升至 107% (P = 0.038)、
94% (P = 0.016)、95% (P = 0.013)。與 BCL2 蛋白相互對立的 BAX 蛋 白表現量部分，同樣以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 BAX 蛋白表現量作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組 別(+ Dox)細胞內 BAX 蛋白表現量顯著上升(132%，P = 0.013)。前處 理1 μM 的 LM-031、甘草查爾酮 A 及香豆素後，細胞內 BAX 蛋白表 現量則分別顯著的回降至 86% (P = 0.004)、83% (P = 0.004)、91% (P = 0.002) (圖十 B、C)。
此外，以未誘導 Aβ-GFP 表現組別(- Dox)測得細胞內 CREB 途徑 下游 AKT、pAKT(T308)、pAKT(S473)、ERK 及 pERK 蛋白表現量 作為 100%，則加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的組別(+ Dox)，細胞 內 AKT、pAKT(T308) 、pAKT(S473)、ERK 及 pERK 蛋白表現量分 別顯著下降至 72% (P = 0.012)、79% (P = 0.003)、71% (P = 0.022)、
86% (P = 0.034)、79% (P = 0.002)。前處理 1 μM 的 LM-031、甘草查
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爾酮 A 及香豆素後，細胞內 CREB 途徑下游相關蛋白表現量達到顯 著的回升：AKT 蛋白表現量分別回升至 95% (P = 0.017)、92% (P
=0.009)、92% (P = 0.014)；pAKT(T308)蛋白表現量分別回升至 103%
(P = 0.008)、104% (P =0.007)、97% (P = 0.032)；pAKT(S473)蛋白表 現量分別回升至 113% (P = 0.045)、117% (P = 0.001)、101% (P = 0.012)；ERK 蛋白表現量分別回升至 102% (P = 0.033)、102% (P
=0.018)、96% (P = 0.042)；pERK 蛋白表現量分別回升至 104% (P = 0.037)、102% (P =0.031)、97% (P = 0.018) (圖十 D、E)。
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伍、 討論
先前本實驗室研究發現雖然甘草查爾酮 A 具有神經保護性作 用，但對人類細胞毒性較高(Chen et al., 2014)，尚有改善空間。香豆 素及其衍生物廣泛存在於自然界植物中，具有抗氧化、抗癌、抗微生 物等多種功用(Nolte et al., 1987; Kostova et al., 2011; Matos et al., 2012;
Serra et al., 2012)。有研究指出香豆素-查爾酮混合化合物具有不同藥 理學性質，是具有發展潛力的藥劑(Wei et al., 2016)，因此本研究藉由 置換或改變甘草查爾酮 A 苯環上的官能基結構，及利用查爾酮及香 豆素兩化合物結構為基底，合成一系列的衍生物(圖一)。化合物結構 部分，LM-004、LM-006 及 LM-026 結構與甘草查爾酮 A 較相似，主 要共同的改變是苯環上 OH 基數目及 OCH3 基相對位置，以增加水溶 性及活化基供給電子的能力；LM-016 及 LM-031 是以查爾酮及香豆 素為基底所合成的衍生物，以期藉由兩分子化學結構改變增加化合物 對神經保護功能。透過實驗結果發現，不論是使用未誘導的 Aβ-GFP 293 及 SH-SY5Y 細胞(圖三)，或是加入多西環素誘導的 Aβ-GFP 293 細胞(圖五)，LM-006、LM-026 與甘草查爾酮 A 對細胞的毒性相似，
LM-004 則明顯較高。相較於甘草查爾酮 A 及其衍生物，利用查爾酮 及香豆素為基底所製備的 LM-016、LM-031 衍生物以及香豆素本身 對細胞的毒性較低。因此就對細胞毒性而言，LM-016 及 LM-031 將
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或許是較具有潛力的低毒性藥物。
在實驗設計部分，由於細胞外實驗只靠單一化合物反應，通常所 需的化合物濃度較高；而細胞內實驗化合物則可以透過啟動分子機制 等方式進行反應，通常不需使用到高濃度便可觀察到化合物之功效。
因此在化合物濃度選擇的部分，細胞外實驗中均只測試較高的化合物 濃度：DPPH 自由基清除能力檢測使用 10~160 μM、Thioflavin T 螢 光亮度檢測則使用 5~20 μM；細胞內實驗最開始測試時則從低濃度到 高濃度(0.001~100 μM)進行廣泛的檢測。透過實驗結果可以發現，在 細胞外實驗中，化合物對於 DPPH 自由基清除能力的 EC50普遍需要 50~200 μM，Thioflavin T 螢光亮度檢測部分的 EC50則皆在 10 μM 以 上；然而在細胞內實驗中，各化合物最有效濃度均落在 1~10 μM，過 高的化合物濃度則會對細胞造成壓力使細胞死亡。透過對實驗結果的 觀察，可進一步確認化合物在細胞內所需有效濃度確實較細胞外實驗 中低。
Aβ 斑塊在腦中堆積一直被認為是造成阿茲海默氏症發病的主要 原因之一(Selkoe, 1989)，減少 Aβ 斑塊的產生或加速 Aβ 斑塊清除，
將有助於減緩阿茲海默氏症發病。Thioflavin T 透過其與富含 β-sheet 結構結合後會增強訊號及放射光譜位移的特性，被廣泛用於辨識錯誤 摺疊與聚集的Aβ (Saeed and Fine, 1967; Khurana et al., 2005)。本研究
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在體外實驗的部分，透過 Thioflavin T 螢光分析，發現甘草查爾酮 A、
香豆素及其衍生物可抑制 Aβ 蛋白的聚集(圖二)，由於不可溶 Aβ 的 β-sheet 結構可透過氫鍵 (Hydrogen bond)及疏水力(Hydrophobicity
forces)使彼此結合，進一步聚集與堆積(Favrin et al., 2004)，因此化合
物或許可藉由透過與Aβ 結合、形成立體障礙或提供氫鍵等方式阻止
Aβ 聚集與堆積(Lowe et al., 2001; Wu et al., 2007; Scherzer-Attali et al.,
2010) ， 也 意 味 著 這 些 化 合 物 扮 演 著 化 學 性 伴 護 分 子 (Chemical chaperone)的角色。細胞實驗的部分，則利用已建構的 Aβ-GFP 293
細胞平台，檢測化合物改善 Aβ 的錯誤摺疊及細胞毒性(圖五)。各化
合 物 的 半 數 致 死 量 細 胞 毒 性 與 有 效 改 善 Aβ 錯誤摺疊劑量(IC50
cytotoxicity/effective dose)的比值分別為：甘草查爾酮 A/76~76000、
LM-004/480~48000 、 LM-006/58~58000 、 LM-026/61~6100 、香豆素 /70~7000、LM-016/8.1~81000、LM-031/9.5~95000，皆遠較正控制組 薑黃素寬廣(2.2~4.4)，其中 LM-031 在檢測的化合物中，比值範圍最 大且細胞毒性最低。
文獻指出，HSPB1 可調節 Aβ 聚集並作為 Aβ 的拮抗劑(Wilhelmus et al., 2006b)，HSPB1 保護皮質神經元免受 Aβ 誘導造成的損傷(King et al., 2009)，過度表達 HSPB1 可降低了 APP/PS1 小鼠的澱粉樣蛋白 斑塊沉積(Tóth et al., 2013)。另外，通過化學伴護分子活性和增強
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HSPB1 表達，合成的吲哚/吲哚喹啉化合物 NC009-1/NC009-7 已經被 發現能夠減少Aβ 和 tau 蛋白的錯誤折疊和/或聚集(Chang et al., 2016, 2017)。先前許多研究分別發現 HSPB1 等多種熱休克蛋白在阿茲海默 氏症患者腦中有上調的現象(Iwaki et al., 1992; Renkawek et al., 1994)，然而可能由於熱休克蛋白活性的降低，即使熱休克蛋白表現
量增多，仍無法達到清除 Aβ 的效果；而隨著受損及錯誤摺疊蛋白的
增加，亦會導致老年細胞中伴護分子活性的下降(Micha et al., 2007;
Csermely, 2001)。本實驗中，加入多西環素誘導 Aβ-GFP 表現的 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞，HSPB1 蛋白量顯著下降，造成此結果可能 是由於 HSPB1 與 Aβ-GFP 作用且結合後溶解度下降導致；而加入甘 草查爾酮 A、香豆素及 LM-031 前處理後，HSPB1 的蛋白表現量則顯 著增加，並伴隨著可溶性 Aβ-GFP 蛋白量的提升(圖九)。類似於先前 發表的吲哚/吲哚喹啉化合物，甘草查爾酮 A、香豆素及 LM-031 亦具 有化學伴護分子活性並能透過增強 HSPB1 表達，來減少 Aβ 錯誤折 疊和聚集。
甘草查爾酮 A 可藉由捕捉不成對電子，進一步達到清除自由基 的功效，並具增強粒線體新生及抗氧化功能，可降低突變的 polyQ 蛋 白引發之粒線體功能障礙及氧化壓力傷害，達到神經保護作用(Chen et al., 2014)。阿茲海默氏症與自由基間存在諸多關聯性，Aβ 斑塊堆
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積 將 造 成 腦 中 氧 化 壓 力 上 升 ， 並 進 一 步 導 致 阿 茲 海 默 氏 症 (Butterfield, 1997; Butterfield et al., 2001;Tabner et al., 2002)。本研究探 討的甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物，具有捕捉自由基的能力。先 前有研究指出酚類化合物的抗氧化活性取決於苯環上活性 OH 基團 的數量和位置(Bendary et al., 2013)，苯環上 OH 基團清除自由基機制 主要透過供氫原子與自由基反應生成酚氧自由基，該酚氧自由基又受 到芳香環大共軛體系的共振穩定，從而終止自由基鏈式反應，通過這 種作用可以清除自由基(孟慶華等，2012；陳永鈞等，2013)。本研究 所測試的化合物中，甘草查爾酮 A、LM-004、LM-006、LM-026 有 類似的查爾酮(Chalcone)結構(圖十一 A)，其清除自由基的 EC50及苯 環上 OH 基團的數目分別為：130 μM/2、103 μM/1、145 μM/1、56 μM/2 (圖十一 B)。對 LM-004、LM-006、LM-026 而言，活性 OH 基團的數 量或許是造成抗氧化活性不同的原因，而甘草查爾酮 A 雖然與 LM-026 般有 2 個活性的 OH 基團，苯環上 OH 基團鄰位的 C5H8基團，
可能由於立體障礙，抑制了 OH 基團的自由旋轉，使得自由基不易與 OH 基團接近，導致甘草查爾酮 A 清除自由基的能力降低(王立娟等，
2008)。另有文獻指出，供電子基團如甲氧基活化基，若在酚的 2,4,6 位置發生取代，可增加抗氧化活性(Scott, 1963)，甘草查爾酮 A、
LM-026 的 OH 基團分別在酚的 3、2 位置上，或許也是造成甘草查爾
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酮 A 清除自由基能力較差的另一個原因。香豆素、LM-016、LM-031 有類似的苯並吡喃(Benzopyran)結構(圖十一 A)，其清除自由基的 EC50
及苯環上 OH 基團的數目分別為：178 μM/0、169 μM/0、105 μM/1 (圖 十一 C)，因此活性 OH 基團的數量在化合物之間的差異，或許是造 成化合物抗氧化活性不同的主要原因。苯並吡喃結構存在於多種天然 抗氧化劑中，如維生素 E、兒茶素等，亦有研究透過合成含有苯並吡 喃結構的化學衍生物達到清除自由基的功效(Kosugi et al., 2000)。
另外，本研究利用多西環素誘導的 Aβ-GFP 293 細胞，其細胞內 活性氧分子的含量顯著高於未加入多西環素誘導的組別，加入甘草查 爾酮 A、香豆素及其衍生物前處理後，細胞內活性氧分子含量則顯著 回降(圖六)，故甘草查爾酮 A、香豆素及其衍生物確實能降低 Aβ 堆 積所帶來的氧化壓力傷害。此實驗結果與前人的 Aβ 造成 PC12 細胞
氧化壓力上升、抗氧化劑可降低活性氧化物及 Aβ 細胞毒性之結果相
符合(Ye et al., 2010)。NRF2 為一與抗氧化相關轉錄因子，已有研究指 出 NRF2 的相關途徑與阿茲海默氏症有密切關連(Zhong et al., 2013;
Yang et al., 2015)；且在 APP/PS1 轉基因小鼠腦內中發現，Aβ 斑塊的 沉降會伴隨著 NRF2 途徑的減弱(Kanninen et al., 2008)。本研究發現 利用多西環素誘導會導致 NRF2 途徑相關蛋白表現量下降，而甘草查 爾酮 A、香豆素及 LM-031 則可作為 NRF2 介導的途徑的增強子(圖
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九)，或許 LM-031 可透過活化 NRF2 途徑，達到抗氧化功效，進一步 能夠作為預防或治療阿茲海默氏症的候選藥物。
Aβ 可透過氧化壓力提升、細胞外毒性、能量耗損、發炎以及細
Aβ 可透過氧化壓力提升、細胞外毒性、能量耗損、發炎以及細