IL-6，IL-8，IL-1β，TGF-β1，HTRA 1，LOC387715 之基因多型性與

polymorphisms are associated with AMD patients and control subjects)

我們分析了IL-6 promoter -572 G/C；IL-8 promoter -251 A/T，IL-1β promoter -511 T/C，TGF-β1 promoter -509 C/T，HTRA1 promoter G/A(rs11200638)，LOC387715 exon 1 T/G (rs10490924) SNP 之基因多型性，其電泳分析圖呈現於圖十四。AMD 患者 與對照組個體間的比較，IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C，TGF-β1 -509 C/T genotype 的機率分佈在兩族群中並無顯著差異，但 HTRA1 G/A (rs11200638)與 LOC387715 T/G (rs10490924)基因型在 AMD 患者與對照組個體間相比較有非常顯著

的差異存在，AMD 患者有非常高的比率具有 HTRA1 AA 基因型(55.9% vs 25.0%，p

<0.001)及 LOC387715 TT 基因型(61.2 % vs 32.1%，p <0.001) (表十九)；同樣地，IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C，TGF-β1 -509 C/T allele 的機率分佈在兩族 群中也無顯著的差異存在，HTRA1 G/A (rs11200638)與 LOC387715 T/G (rs10490924) allele 在 AMD 患者與對照組個體間相比較有非常顯著的差異存在(表二十)，此外，我 們也結合 HTRA1 與 LOC387715 基因型在 AMD 患者與對照組個體間相比較，同樣地，

帶有 HTRA1 AA 基因型 AMD 的患者也帶有非常高比例的 LOC387715 TT 基因型與對 照組個體仍有顯著的差異(55.3% vs 19.2%，OR=0.177，95% CI=0.051~0.612，

p=0.008)，我們也發現 HTRA1 A allele 與 LOC387715 T allele 具有高度的連鎖性 (linkage)(表二十一)。

A. IL-6 -572 G/C B. IL-8 -251 A/T

C. IL-1β -511 T/C D. TGF-β1 -509 C/T TT TG GG TG TT GG

E. HTRA1 G/A (rs1120638) F. LOC387715 T/G (rs10490924) 圖十四.(A) IL-6 -572 G/C SNP：CC genotype 產生一個 296 bp 片段，GG genotype 產

生201 bp 及 95 bp 兩個片段，CG genotype 產生 296 bp，201 bp 及 95 bp 三 個片段。(B) IL-8 -251 A/T SNP：TT genotype 產生一個 542 bp 片段，AA genotype 產生 449 bp 及 92 bp 兩個片段，TA genotype 產生 542 bp，449 bp 及92 bp 三個片段。(C) IL-1β -511 T/C SNP：TT genotype 產生一個 304 bp 片段，CC genotype 產生 190 bp 及 114 bp 兩個片段，TC genotype 產生 304 bp，190 bp 及 114 bp 三個片段。(D) TGF-β1 -509 C/T SNP：CC genotype 產 生一個 400 bp 片段，TT genotype 產生 202 bp 及 198 bp 兩個片段，CT genotype 產生 400 bp，202 bp 及 198 bp 三個片段(E) HTRA1 G/A (rs11200638) SNP：AA genotype 產生一個 383 bp 片段，GG genotype 產生 203 bp 及 180 bp 兩個片段；AG genotype 產生 383 bp，203 bp 及 180 bp 三個片段。LOC387715 T/G (rs10490924) SNP：TT genotype 產生 261 bp 及 37 bp 兩個片段，GG genotype 產生 190 bp，71 bp 及 37 bp 三個片段；TG genotype 產生 261 bp，

190 bp，71 bp 及 37 bp 四個片段。

CC CG CC CG CG CC GG

AA TA TA TT TA TA TA TA

TT TT CC CC TT TC TC

CT TT CC CT CT CT CC

AG GG AG AG AG AA AA

表十九.AMD 患者與對照組個體間 IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C，

TGF-β1 -509 C/T， HTRA 1 A/G，LOC387715 T/G SNP genotype 的機率分佈

IL-6 -572 AMD(n=93) Control(n=90) p value OR (95% CI) CC 52(55.9%) 47(52.2%) CC vs GG：0.656 1.328(0.380-4.637) CG 36(38.7%) 37(41.1%) CG vs GG：0.811 1.168(0.327-4.168) GG 5( 5.4%) 6 (6.7%) GG vs CC,CG：0.857

IL-8 -251 AMD(n=95) Control(n=90) p value OR (95% CI) TT 27(28.4%) 35(38.9%) TT vs AA：0.579 0.771(0.308-1.932) TA 55(57.9%) 42(46.7%) TA vs AA：0.542 1.310(0.550-3.117) AA 13(13.7%) 13(14.4%) TT vs TA,AA：0.267

TGF-β1 -509 AMD(n=95) Control(n=90) p value OR (95% CI) CC 32(33.7%) 40(44.4%) CC vs TT：0.101 0.471(0.190-1.168) CT 46(48.4%) 40(44.4%) CT vs TT：0.387 0.676(0.278-1.645) TT 17(17.9%) 10 ( 11.1%) TT vs CC,CT：0.224

IL-1β -511 AMD(n=95) Control(n=90) p value OR (95% CI) TT 22(23.2%) 14(15.6%) TT vs CC：0.062 2.316(0.953-5.627) TC 54(56.8%) 48(53.3%) TC vs CC：0.156 1.658(0.823-3.340) CC 19(20.0%) 28(31.1%) CC vs TT,TC：0.267

HTRA1 (rs11200638)

AMD(n=93) Control(n=81) p value OR (95% CI)

AA 52(55.9%) 17(25.0%) AA vs GG：0.036 3.059(1.045-8.953) AG 32(34.4%) 42(61.8%) AG vs GG：0.605 0.762(0.271-2.139) GG 9(9.7%) 9(13.2%) GG vs AA,AG：<0.001

LOC387715 (rs10490924)

AMD(n=85) Control(n=84) p value OR (95% CI)

TT 52(61.2%) 27(32.1%) TT vs GG：<0.001 4.727(2.038-10.963) TG 22(25.9%) 30(35.7%) TG vs GG：0.194 1.800(0.738-4.388) GG 11(12.9%) 27(32.1%) GG vs TT,TC：<0.001

表二十.AMD 患者與對照組個體間 IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C，

TGF-β1 -509 C/T，HTRA 1 A/G，LOC387715 T/G SNP allele 的機率分佈

IL-6 -572 G/C AMD(n=93) Control(n=90) p value OR (95% CI)

AMD(n=93) Control(n=81) p value OR (95% CI)

A 136(73.1%) 76(46.9%)

G 50(26.9%) 86(53.1%) <0.001 3.078(1.967-4.815)

LOC387715 (rs10490924)

AMD(n=85) Control(n=84) p value OR (95% CI)

T 126(74.1%) 84(50.0%)

G 44(25.9%) 84(50.0%) <0.001 2.864(1.812-4.525)

表二十一.HTRA1-LOC387715 genotype 在 78 位對照組個體與 85 位 AMD 患者的分佈

HTRA1 (rs11200683)

LOC387715 (rs10490924)

Controls(％) AMD(％) p value; Odds ratio(95% CI)

TT TG GG TT TG GG TT TG GG

AA 15(19.2) 1(1.3) 0 47(55.3) 2(2.4) 0 0.008 0.571 0.343

AG 9(11.5) 28(35.9) 3(3.8) 5(5.9) 20(23.5) 3(3.5) 0.177(0.051-0.612) 0.357(0.030-4.214) 0.364(0.061-2.185)

GG 0 0 22(28.2) 0 0 8(9.4)

第四章 討論

AMD 是一個多因素的疾病，它的危險因子則涵蓋了年齡；性別；種族；環境因 子，如：抽煙，飲食，高血壓，高血脂等等，另外一個就是基因層面，在我們所研究 的實驗組與對照組族群中，已盡可能地排除年齡、性別、種族與環境因子上的差異，

抽煙狀況、BMI、血壓、高血壓、醣尿病、心血管疾病、高血脂在實驗組與對照組族 群中並無差異，將基因層面成為唯一的變因，以避免其他的因素造成實驗結果的誤 差。我們的研究發現 VEGF 與 TNF-α 基因多型性在實驗組與對照組族群中具有顯著 的差異存在，對照組族群具有較高的比例攜帶VEGF 936 C allele，在 haplotypes 分析 中發現VEGF CTCC/CTGC 基因型(-2578，-1498，-634，936)及 TNF-α TCCGG/TACGG 基因型(-1031，-863，-857，-308，-238)同樣地在對照組族群具有較高的比例，我們 將 VEGF 和 TNF-α 的實驗結果結合起來比對，也確實發現對照組族群具有較高的比 例同時攜帶VEGF CTCC/CTGC 基因型與 TNF-α TCCGG/TACGG 基因型。另外，我 們的研究也證實了 HTRA1 AA 基因型及 LOC387715 TT 基因型為羅患 AMD 的危險因 子，並且兩基因間幾乎具有完全的連鎖性(linkage)。

人類的 VEGF 基因是位在第六對染色體 6p21.3 上 ⁵³，含有九個 exons 並經由 alternative splicing 以產生不同胺基酸長度 189，165，121 的 isoforms，VEGF 165 是在 眼睛中最主要的isoform，並且更進一步地 splicing 產生‘a’或‘b’ isoform，VEGF 165 a 具有強的血管生成的性質(angioenic properties)，而 VEGF 165 b 具有抗血管生成的性 質(anti-angioenic properties)，Perrin 等人，從醣尿病併發 proliferative eye disaese 患者 眼球的玻璃體檢體中證實VEGF 165 a 比 VEGF 165 b 有相對增加的情形⁵⁴。Kliffen 等人，也報告在AMD 患者，total VEGF 165 會升高，但並沒有測定個別 VEGF isoform 的濃度⁵⁵。

VEGF 基因中，我們所選擇四個單核酸多型性(single nucleotide plymorphisms, SNPs )已經報告和 VEGF 的合成有關，promoter 區域 -2578 C/A 基因多型性為與周邊 血受刺激的單核球(PBMC)生成 VEGF 有關，-2578 CC 基因型與產生較高濃度的 VEGF

有關⁵⁶，但Howell 等人的研究指出-2578 CC 基因型對於 atherosclerosis 具有保護的作 用⁵⁷，而atherosclerosis 則為 AMD 的危險因子之一，在我們的 hapolytypes 分析中，

則顯現出-2578 CC 基因型與正常個體有密切的關係。-634 CC 基因型(亦名+405 CC，

transcription start=+1)⁵⁸在 LPS 刺激周邊血單核球(LPS-stimulated PBMC)生成 VEGF 中，具有最少量的VEGF 蛋白的生成，最高的 VEGF 蛋白的生成則為-634 GG ⁵⁹，但 在Awata 等人的研究，測定空腹血清檢體 VEGF 的濃度(fasting serum VEGF)，-634 CC 基因型個體具有最高的VEGF 濃度，最低的 VEGF 的濃度則為-634 CG 基因型個體⁶⁰，

這些研究的差異，有可能所使用的方法不同或合成VEGF 的細胞來源有所不同所致，

而在我們VEGF 基因多型性的研究，經由 hapolytypes 的組合，預測 VEGF 基因型，

則-634 CG 基因型與正常個體有密切的關係。此外，Stevens 等人報告具有-460C/+450G hapolytype (-460 亦名-1498，-460 其 transcription start=+1)會增加 basal promoter activity

61，在我們由hapolytypes 預測 VEGF 基因型則發現 TC/TG 基因型與正常個體有密切 的關係，而3'-UTR 936 C/T SNP，則有研究報告指出攜帶 T allele 的個體具有較低的 VEGF 濃度⁶²，Awata 等人測定空腹血清檢體 VEGF 的濃度，936 CC 基因型則有較低 VEGF 濃 度 的 趨 勢 ⁶⁰， 這 些 VEGF 基 因 的 調 節 區 域 含 有 許 多 的 transcription factor-binding sites，如 MZF1 (myeloid zinc finger 1) transcription factor，Papillomavirus regulator E2 ^{59, 63}，進行transcription 的調節，並且 post-transcription 的機制也已經提 出涉及到VEGF 的表現⁶⁴。在我們將四個VEGF SNP 進行 hapolytypes 的分析，發現 VEGF CTCC/CTGC 基因型(-2578，-1498，-634，936)與正常個體有密切的關係，具 有保護的效果，是否這些個體有較低VEGF 濃度或則與 VEGF isoform 的狀態有關，

仍需進一步的研究。

Tumor necrosis factor-α (TNF-α) 是一個 pleiotropic cytokine 會引發許多種細胞(包 括內皮細胞)的發炎，增生，細胞停滯(cytostatic)及細胞毒性(cytotoxic)的影響，此外，

TNF-α 也是一個強的血管新生的誘發者⁶⁵，TNF-α 的表現已經顯示出部分是由基因層

面所決定的，因為許多基因多型性的位點緊密地相連於TNF-α 基因位，此與細胞分必

TNF-α 的差異性有關⁶⁶，並且已有證據指出TNF-α 基因的表現受到轉錄(transcription)

所調節⁶⁷，所以TNF-α 基因在 promoter 區域的基因多型性對於 TNF-α 基因的表現及 蛋白的生成可能是相當的重要，此外，在幾個研究中已指出-1031，-863，-857，-308，

-238 位點的多型性和增加 TNF-α 轉錄的進行(transcriptional activity)及 TNF-α 的生成

有關^68-70。

TNF-α 在幾個眼球發炎疾病的致病機制中扮演一個重要的角色，Spranger 等人 報 告 在 眼 球 血 管 新 生 疾 病(neovascular eye disease) 和 醣 尿 病 視 網 膜 增 生 病 變 (proliferative diabetic retinopathy)，TNF-α 會增加。Yossuck 等人也發現在老鼠模型中，

當在視網膜血管新生最大量的時候，TNF-α 的表現會增加⁷¹，在TNF-α 基因多型性的 研究中，Skoog 等人報告攜帶-863 A allele 的個體，有較低的血清中 TNF-α 的濃度，

transfection 的研究證實-863 A allele 與 basal transcription rate 減少有關⁷²，另一個實驗 也證實-863 CC 基因型有較高的 TNF-α 的生成 ⁷³。Nishimura 等人的研究則報告 -1031C/-863A allele 為 TNF-α 高度的生產者⁷⁴，Higuchi 等人的研究則報告-1031C/-863 A 和-857 T allele 的 transcriptional promoter activity 比 dominant allele 高⁶⁹。而TNF-α -308，觀察到在注射受到 C 型肝炎病毒污染的 Rhoram immunoglobulin 的愛爾蘭婦女，

-308A SNP 的個體會產生較高的細胞激素⁷³，其他的研究報告指出來自於-308 G/A 個 體的細胞比-308 G/G 個體的細胞產生較高的 TNF-α^{75, 76}。至於TNF-α -238，則有研究 指出-238 G allele 與較高的 TNF-α 生成有關⁷⁷，-308 A allele 和-238 A allele 會增加 TNF-α-positive inflammatory cells⁷⁸。在我們的研究發現TNF-α -1031 TC 基因型似乎 與AMD 患者有相關連性(27.8% vs 38.5%)；TNF-α -1031 CC 基因型似乎與對照組有 相關連性(6.7% vs 0.0%)，但在進行 haplotypes 的分析後，發現其實不然，這可能是由 於TNF-α 基因在五端的區域有高度的基因多型性所致，這也說明了並不是單一的 SNP 就足以影響基因的表現與疾病的關係，因此也說明了haplotypes 的重要性，我們進行 了與transcriptional activity 有密切相關的 promoter -1031，-863，-857，-308，-238 分 析 haplotypes，結果發現 TACGG haplotype 與 TCCGG/TACGG 基因型具有保護的效 果，與之前相關的研究探討TNF-α SNP 與 TNF-α 濃度之關係，我們的結果似乎與產

因發炎時常和血管新生增加有關，發炎會誘發血管或其他組織細胞或者是浸潤 的白血球產生血管新生因子(agiogenic factors)⁴⁴，包括了：tumor necrosis factor-α (TNF-α)；interleukin-8 (IL-8)；TGF-β⁴⁵；IL-6⁴⁶等等，以調節VEGF 的表現⁴⁷，而TNF-α 又會活化發炎性白血球(inflammatory leukocytes)並且刺激 macrophages 產生其他的細 胞激素，如：interleukin-1 (IL-1)，IL-6，IL-8，TNF-α⁴⁸，同樣地，因VEGF 可誘發 retinal vascular endothelium 表現 intercellular adhesion molecular-1(ICAM-1)及調節白血球附著 到內皮細胞³⁵，引起leukostasis 及發炎反應，因此 TNF-α 與 VEGF 的互相反應及調節 在 AMD 扮演一個相當重要的角色，最近的研究也指出 TNF-α 會增強 VEGF 的生成

79，所以我們將VEGF 及 TNF-α haplotypes 的分析結果結合起來與 AMD 患者及對照 組相比對，也確實發現同時攜帶TNF-α TCCGG/TACGG 基因型與 VEGF CTCC/CTGC 基因型的個體具有保護性的效果。

IL-10 是一個強的抗發炎細胞激素(anti-inflammatory cytokine)，會抑制發炎性細 胞激素(inflammatory cytokine)：IL-1、TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-8、IL-12 的分泌⁸⁰， 並 且 發 炎 性 活 動(inflammatory activity) 會 伴 隨 著 年 齡 而 增 加 ， 已 經 有 報 告 指 出 inflammatory mediator genes：IL-1、TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-10、INF-γ 和 MMP-3(matrix metalloproteinase-3)，其單核酸多型性( single nucleotide polymorphisms, SNPs )與長壽 或 年 齡 有 關 ⁸¹， 我 們 分 析 了 IL-10 promoter -1082 A/G ； -819 T/C ； -592 A/C polymorphisms 與 AMD 的關連性，因此基因在 promoter 區域基因的多樣性與 IL-10 的生成及慢性發炎性疾病(chronic inflammatory disease)有關 ⁸²，但我們並沒有發現 IL-10 -1082 A/G；-819 T/C；-592 A/C 與 AMD 患者或對照組有相關連性，但已有研究 指出IL-10 -819 T/T 及 TNF-α -1031 T/T 與年齡有關，在高年齡族群有較高的比例⁸¹。

這是否可以推測發炎基因與抗發炎基因之間的反應及調節可能與罹患AMD 的風險有

所關連，此外我們也分析了與發炎及血管新生調節有關的基因，IL-6 promoter -572 G/C；IL-8 promoter -251 A/T，IL-1β promoter -511 T/C，TGF-β1 promoter -509 C/T SNP

之基因多型性，但並沒有發現這些基因之多型性與AMD 患者或對照組有相關連性，

由此我們推測VEGF 與 TNF-α 基因間相互反應及調節可能是罹患 AMD 與否的重要因

素之一。

另外，我們又分析了最近的研究報告指出在chromosome 10q26 上對於罹患 AMD 的敏感性基因(susceptibility gene)^{41, 83-85}：HTRA1 promoter (rs11200638)及 LOC387715 exon 1 (rs10490924) SNP，我們的研究也證實了 HTRA1 rs11200638 及 LOC387715 rs10490924 基因型在 AMD 患者與對照組個體間相比較有非常顯著的差異存在，AMD

另外，我們又分析了最近的研究報告指出在chromosome 10q26 上對於罹患 AMD 的敏感性基因(susceptibility gene)^{41, 83-85}：HTRA1 promoter (rs11200638)及 LOC387715 exon 1 (rs10490924) SNP，我們的研究也證實了 HTRA1 rs11200638 及 LOC387715 rs10490924 基因型在 AMD 患者與對照組個體間相比較有非常顯著的差異存在，AMD