血管新生因子及發炎基因與老年黃斑退化性疾病之關連性; Angiogenic growth factor and inflammatory genes polymorphisms are associated with age-related macular degeneration (AMD or ARMD)

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(1)中國醫藥大學醫學研究所碩士學位論文血管新生因子及發炎基因與老年黃斑退化性疾病之關連性 Angiogenic growth factor and inflammatory genes polymorphisms are associated with age-related macular degeneration (AMD or ARMD). 指導教授：萬磊. 博士. Adviser ： Lei Wan, Ph.D. 研究生：黃嵩裕 Graduate student： Sung–Yu Huang. 中華民國九十六年一月 January 2007 I.

(2) 中國醫藥大學. 醫學研究所. 碩士候選人學位考試論文題目中文：血管新生因子及發炎基因與老年黃斑退化性疾病之關連性英文：Angiogenic growth factor and inflammatory genes polymorphisms are associated with age-related macular degeneration (AMD or ARMD) 本論文係黃嵩裕於中國醫藥大學醫學研究所完成之碩士論文，經考試委員審查及口試合格，特此證明。考試委員. 所長:. 中華民國. 九十六年. II. 月. 日.

(3) 中文摘要. 目的.老年黃斑退化性疾病(AMD)是一種眼底黃斑部退化性疾病，為導致老年人失明的原因之一，此研究為探討其致病機轉中，血管新生與發炎之相關基因以及最近報告的 AMD 敏感性基因與老年黃斑退化性疾病之關連性，總共分析了九個相關之基因多型性，基因型及對偶基因是否為罹患老年黃斑退化性疾病之危險因子或保護因子。方法.95 位 AMD 病患和對照組 90 位個體參與此項研究，我們使用了 PCR-RFLP 的方法分析了 VEGF (-2578；-634；+936)，TNF-α (-1031；-863；-857；-308；-238；+489)， IL-6 (-572)，IL-8 (-251)，IL-1β(-511)，TGF-β1(-509)，IL-10 (-1082；-819；-592)及 HTRA1 rs11200638、LOC387715 之基因多型性。使用 real-time PCR 來分析 VEGF-1498 之基因多型性。結果. VEGF 與 TNF-α 基因多型性在 AMD 患者與對照組個體間具有顯著的差異， AMD 患者比較於對照組個體，有較多的比例帶有 VEGF 936 T allele(22.3% vs 14.0%， OR=1.761，95% CI=1.02~3.04，p=0.038)，進行 haplotype 的分析，我們發現對照組個體有較高比率帶有 CTCC/CTGC genotype (33.3% vs 20% ， OR=2.0 ， 95% CI=1.027~3.897，p=0.040)。對照組個體中具有 TNF-α -1031 CC 基因型的存在，而在 AMD 患者中沒有發現此基因型(6.7% vs 0%，p=0.026)，但進行 haplotype 的分析，對照組個體帶有較高比率的 TACGG haplotype (6.7% vs 1.1% ， OR=6.714 ， 95 ％ CI=1.481~30.435，p=0.011)。AMD 患者缺乏 TCCGG/TACGG genotype 與對照組個體具有顯著的差異(0.0% vs 8.9％，p=0.003)，VEGF 基因多型性與 TNF-α 基因多型性的結合，發現對照組族群具有較高的比例同時攜帶 VEGF CTCC/CTGC genotype 與 TNF-α TCCGG/TACGG genotype (5.6% vs 0.0%，p=0.026)。另一方面，我們也證實了 HTRA1 及 LOC387715 genotype 在 AMD 患者與對照組個體間有非常顯著的差異存在，AMD 患者有非常高的比率具有 HTRA1 AA genotype(55.9% vs 25.0%，p=6.65×10-6) 及 LOC387715 TT genotype(61.2% vs 32.1%，p=3.57×10-4)。其他基因之多型性在 AMD III.

(4) 患者與對照組個體之間並沒有相關連性。結論. VEGF 936 CC SNP 及 CTCC/CTGC genotype 可能具有保護性的效果，降低罹患 AMD 的機會，同樣地，TNF-α TACGG haplotype，TCCGG/TACGG genotype 也具有保護性的效果，VEGF 基因多型性與 TNF-α 基因多型性結合起來比對，也確實發現 TNF-α TCCGG/TACGG genotype 與 VEGF CTCC/CTGC genotype 具有保護性的效果，由此我們推測 VEGF 與 TNF-α 基因間相互反應及調節可能是罹患 AMD 與否的重要因素之一。另一方面我們也證實了 HTRA1 AA genotype 及 LOC387715 TT genotype 為罹患 AMD 的危險因子。. IV.

(5) Abstract Objective. Age-related macular degeneration (AMD) is a degenerative macular disorder and leading cause of blindness in the elderly. This study investigated possible association of angiogenic growth factor, inflammatory genes and recently AMD-susceptibility gene polymorphisms with the pathogenesis of AMD. We examined genetic polymorphisms in nine candidate genes to evaluate their relevance as risk or protective factors for AMD. Method. Ninety-five patients with AMD and 90 healthy unrelated controls in Taiwan were recruited. We genotyped the following polymorphisms: VEGF (-2578；-634；+936), TNF-α (-1031；-863；-857；-308；-238；+489), IL-6 (-572), IL-8 (-251), IL-1β(-511), TGF-β1(-509), IL-10 (-1082；-819；-592) and HTRA1 rs11200638, LOC387715 genes by PCR-RFLP method. Real-time PCR was used to determine VEGF-1498 polymorphism. Results. The distribution of VEGF and TNF-α gene polymorphisms were significantly different from the patients with AMD and control subjects. High frequency of the VEGF 936 T allele was observed in the AMD group compared with control subjects (22.3 % vs 14.0%, OR=1.761, 95% CI=1.02~3.04, p=0.038). Furthermore, haplotype analysis revealed that there was high frequency of the CTCC/CTGC genotype in the control subjects compared with AMD group (33.3% vs 20%, OR=2.0, 95% CI=1.027~3.897, p=0.040). The absence of the TNF-α-1031 CC genotype among AMD group was significantly different from control subjects (6.7% vs 0%, p=0.026). However, haplotype analysis revealed that there was high frequency of the TACGG haplotype in the control subjects compared with AMD group (6.7% vs 1.1%, OR=6.714, 95% CI=1.481~30.435, p=0.011). The absence of the TCCGG/TACGG genotype among AMD group was significantly different from control subjects (0.0% vs 8.9%, p=0.003). Combining the data V.

(6) on the VEGF polymorphisms with the TNF-α polymorphisms, there was high frequency of the VEGF CTCC/CTGC and TNF-α TCCGG/TACGG carriers in the control subjects compared with AMD group (5.6% vs 0.0%, p=0.026). In addition, we also verified the distribution of HTRA1 and LOC387715 gene polymorphisms were significantly different between the patients with AMD and control subjects. The high frequency of the HTRA1 AA and LOC387715 TT genotype were observed in the AMD group compared with control subjects. ( 55.9% vs 25.0%, p=6.65×10-6 and 61.2% vs 32.1%, p=3.57×10-4, respectively). All other genes polymorphisms weren’t significantly different between the patients with AMD and control subjects. Conclusion. The VEGF 936 CC SNP and CTCC/CTGC genotype may be a protective factor of AMD. Similar, TNF-α promoter TACGG haplotype and TCCGG/TACGG genotype also had protective effect. Combining the VEGF and TNF-α polymorphisms, we also found TNF-α TCCGG/TACGG and VEGF CTCC/CTGC had protective effect. Thus, we speculate that the interaction and regulation between the VEGF and TNF-α genes may be one of the important factors for the development of AMD. In addition, we also verified that HTRA1 AA and LOC387715 TT genotypes are risk factors for AMD.. VI.

(7) 誌謝畢業了，對於我這位在職生而言，能夠拿到碩士學位，這兩年半的辛苦與努力終於有所成果，當然這必須是許多人對我的包容與配合，才能使我順利去學校就讀以及實驗能夠順利的進行，得以能夠完成此篇論文，真是不勝感激。 93 年，我自己很驚訝的考上了醫學研究所臨床組，也很感謝獲得此時漢銘醫院檢驗科陳俊川主任的首肯，讓我能夠順利就學，也感謝檢驗科同仁：家銘、素芬、珮君、麗敏、孟莉、俊吉、淑滿、亞琪的幫忙與配合，以及新上任吳秀鴻主任的鼓勵，讓我能夠順利完成學業，但這期間也感受到一般在職生所會遇到的困境，在工作及學業的雙重壓力下，我也有數度想要放棄學業或離職的想法。在二年級上學期末時，因研究進度無法配合指導教授的期望，於是我決定更換指導教授，改變一下環境，但我也很感激她在我課業上的安排與指導，然而，我也很擔心是否能找得到願意收在職生的指導教授，我也很幸運地找上了賴建成博士，他幫我引薦蔡輔仁院長，很感謝蔡院長的幫忙，幫我介紹給萬磊博士，所幸萬博士能願意收我這位在職生，讓我能夠順利繼續就讀。我很感謝萬磊博士，能夠相當地體諒在職生的困難，也盡可能地能讓我儘早的畢業，自進入到附設醫院人類遺傳研究室進行實驗，受到實驗室同仁：包大氰博士、林應如博士、林維勇博士及素卿學姊、瑋德學長、政力、書羽、柔分、威成、妤安、羽慧，秋菊、欽木、維儀、宣憶、佳慧、志玫、亭旭、佳宏、趙寬、雅雯，靜宜等人的幫忙與指導，實驗漸入佳境，也因此能順利地進行研究。最後感謝中國醫藥大學附設醫院眼科林正明醫師不辭辛苦地收集檢體及提供相當寶貴的臨床資料，得以能夠順利地完成此篇論文。在這兩年半研究所的訓練，讓我了解做研究的方法及態度，也期望畢業後，除了繼續奉獻自己醫學檢驗的專才之外，能夠參與相關的臨床醫學的研究，以擴展及提升自己專業的領域，讓所學有所發揮。最後，由衷感謝我的家人及所有幫助過我的人，將此篇論文獻給所有關心我的家人、師長、同學、學弟妹及工作夥伴，感謝大家。. 黃嵩裕謹至於中國醫藥大學醫學研究所中華民國九十六年一月. VII.

(8) 目錄頁次中文摘要. Ⅲ. 英文摘要. Ⅴ. 誌謝. Ⅶ. 目錄. Ⅷ. 圖目錄. Ⅹ. 表目錄. XI. 縮寫表. XIII. 第一章前言. 1. 第一節研究背景. 1. 一. 老年黃斑退化性疾病. 1. 二. 老年黃斑退化性疾病的致病機轉. 5. 三. 血管新生與發炎在老年黃斑退化性疾病的角色. 6. 四. 治療. 9. 第二節. 研究目的. 9. 第二章. 研究方法. 10. 第一節. 研究族群. 10. 第二節. DNA 的萃取及基因型分析. 10. 第三節. 統計分析. 17. 第三章. 研究結果. 18. 第一節. 臨床特徵. 18. 第二節. 血管內皮生長因子基因之多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連性. 19. 第三節. 腫瘤壞死因子基因之多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連性. 24. VIII.

(9) 第四節. 腫瘤壞死因子基因結合血管內皮生長因子基因之多型性與 AMD 患者. 31. 及對照組個體之關連性第五節. 抗發炎基因，IL-10 之基因多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連. 32. 第六節. IL-6，IL-8，IL-1β，TGF-β1，HTRA 1，LOC387715 之基因多型性與. 35. AMD 患者及對照組個體之關連性第四章討論. 40. 第五章結論與建議. 45. 第一節. 結論. 45. 第二節. 建議. 46 46. 參考文獻. IX.

(10) 圖目錄. 頁次. 圖一. 眼球的解剖構造. 1. 圖二. 檢眼鏡(ophthalmoscope)檢視視網膜. 1. 圖三. Drusen 在視網膜的組織解剖位置. 2. 圖四. 檢眼鏡觀察視網膜上 Drusen 的表現. 2. 圖五. 正常視網膜與 AMD 視網膜上的表徵. 3. 圖六. 正常視覺與中央視覺喪失的表現. 3. 圖七. 老年黃斑退化性疾病的致病機轉. 6. 圖八. Vasculogenesis 及 angiogenesis 的機制. 7. 圖九. 脈絡膜血管新生的機轉. 8. 圖十. VEGF -2578 A allele 與 C allele 基因序列的差異. 12. 圖十一 VEGF polymorphisms 基因型電泳分析圖. 20. 圖十二 TNF-α polymorphisms 基因型電泳分析圖. 25. 圖十三 IL-10 promoter polymorphisms 基因型電泳分析圖. 32. 圖十四 IL-6，IL-8，IL-1β，TGF-β1，HTRA 1，LOC387715 SNP 電泳分析圖. 37. X.

(11) 表目錄. 頁次. 表一. PCR-RFLP typing 反應條件及結果. 16. 表二. AMD 患者與對照組間，臨床特徵之比較. 18. 表三. AMD 患者與對照組個體間 VEGF SNP genotype 的機率分佈. 21. 表四. AMD 患者與對照組個體間 VEGF SNP allele 的機率分佈. 21. 表五. VEGF -2578，-1498，-634，936 polymorphisms，所組成可能 haplotypes 22 的結構及在台灣族群的比例. 表六. AMD 患者與對照組個體間，VEGF -2578，-1498，-634，936. 23. polymorphisms，haplotypes 的分佈表七. AMD 患者與對照組個體間 VEGF genotypes (-2578/-1498/-634/936)的分佈 24. 表八. AMD 患者與對照組個體間 TNF-α SNP genotype 的機率分佈. 26. 表九. AMD 患者與對照組個體間 TNF-α SNP allele 的機率分佈. 27. 表十. TNF-α promoter region：-1031，-863，-857，-308，-238 SNP，所可能組成. 28. haplotypes 的結構及在台灣族群的比例表十一 AMD 患者與對照組個體間 TNF-α gene -1031，-863，-857，- 308，-238. 29. polymorphisms，haplotypes 的分佈表十二 AMD 患者與對照組個體間 TNF-α geontypes (-1031/-863/-857/-308/-238). 30. 的分佈表十三 TNF-α haplotypes/genotypes 與 VEGF haplotypes/genotypes 的結合在 AMD 31 患者及對照組個體間的比對表十四 AMD 患者與對照組個體間 IL-10 promoter SNP genotype 的機率分佈. 33. 表十五 AMD 患者與對照組個體間 IL-10 promoter SNP allele 的機率分佈. 33. 表十六 IL-10 promoter region：-1082，-819，-592 SNP，所組成 haplotypes 的結構. 34. 及在台灣族群的比例表十七 AMD 患者與對照組個體間 IL-10 promoter -1082，-819，-592 polymorphisms，haplotypes 的分佈 XI. 34.

(12) 表十八 AMD 患者與對照組個體間，IL-10 geontypes (-1082/-819/-592)的分佈.. 35. 表十九 AMD 患者與對照組個體間 IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C， 38 TGF-β1 -509 C/T，HTRA 1 A/G，LOC387715 T/G SNP genotype 的機率分佈表二十 AMD 患者與對照組個體間 IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C， 39 TGF-β1 -509 C/T，HTRA 1 A/G，LOC387715 T/G SNP allele 的機率分佈表二十一. HTRA1-LOC387715 genotype 在 78 位對照組個體與 85 位 AMD 患者的分佈. XII. 39.

(13) 縮寫表 Age-related macular degeneration. AMD. Rential pigment epithelium. RPE. Kinase insert domain receptor. KDR. Vascular endothelial growth factor. VEGF. Choroidal neovascularization. CNV. Complement factor H. CFH. Extracellular matrix. ECM. Intercellular adhesion molecular-1. ICAM-1. Angiopoietin-1. Ang 1. Angiopoietin-2. Ang 2. Endothelial nitric oxide synthase. eNOS. Matrix metalloproteinase. MMP. Tumor necrosis factor-α. TNF-α. Interleukin-1. IL-1. Interleukin-6. IL-6. Interleukin-8. IL-8. Interleukin-10. IL-10. Transforming growth factor-β. TGF-β. Single nucleotide polymorphism. SNP. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism Body mass index. PCR-RFLP BMI. Myeloid zinc finger 1. MZF1. Adaptor-related protein complex 2α. AP2α. Serum response factor. SRF. XIII.

(14) 第一章前言第一節研究背景一、AMD(Age-related macular degeneration)老年黃斑退化性疾病 Age-related macular degeneration(AMD)是一種眼底黃斑退化性疾病，為導致老年人失明的原因之一 1，臨床上最常發生於 50 歲以後，具有中央眼底部的特徵，同時排除了其他可能造成的眼部疾病，如：眼球外傷(ocular trauma)，視網膜剝離(rential detachment)，高度近視(high myopia)，脈絡膜網膜感染或發炎(chorioretinal infection or inflammation)2, 3。因大部分的視錐細胞(cones)集中於視網膜中央的黃斑區域，特別是在中央小窩(fovea centralis)只含有視錐細胞(cones)(圖一、圖二)。黃斑區域的中央小窩具有最佳的視覺敏銳度及色彩的認知，非黃斑區域的視網膜對弱光的強度較敏銳，與黑白視覺有關。在正常光線下，我們最好的視覺乃直接注視物體，所以其影像是落在黃斑區域的中央小窩，但是，在較差光線下，我們最好的視覺並不是直接注視物體，所以其影像是落在對光線敏感的視桿細胞，位於視網膜非黃斑部的區域。所以 AMD 是老人最常見的後天視覺受損最常見的原因。. 圖一.眼球的解剖構造：近於視網膜後部圖二.檢眼鏡(ophthalmoscope)觀察右中央有一小陷窩，此處的細胞，呈黃色，眼的視網膜表面，視神經盤左邊稱為黃斑。中央的小陷窩稱為中央小窩，卵圓形不含血管的紅色樣斑點為此地乃網膜最敏感的地方，只有視錐細胞。中央小窩，位於黃斑區域的中央 (Figure from www.medicinet.com). (Figure from Neuroscience.2nd ed.2001) 1.

(15) AMD 的臨床標的(clinical hallmark)乃是在 retinal pigment epithelium(RPE) 與 Bruch's membrane 之間具有 protein 與 lipid 的黃色沉積物，稱為 drusen4, 5(圖三)。. 圖三. Drusen 為位於 retinal pigment epithelium (RPE) 與 Bruch's membrane 之間的黃色沉積物。. 圖四. Drusen 為在視網膜上所形成的黃色小點的沉積物。. AMD early stages 的特徵為具有 drusen 的形成，在視網膜上為呈現黃點，並且具有 RPE pigmentation 的異常—hyperpigmentation 和 hypopigmentation3(圖四)。AMD later stage 包含了兩種類型： exudative/neovascular(wet) age-related macular degeneration 及 non-exudative/geographic atropy(dry)，比例約 20：80 6。neovascular age-related macular degeneration 的特徵為脈絡膜血管新生(choroidal neovascularization)導致 RPE 的破壞，如果血管破裂，產生的出血將導致黃斑部的纖維化(fibrous scarring)，引起中央視覺 (central vision)快速的喪失。non-exudative/geographic atropy(dry)為 retinal pigment epithelium(RPE)及其上的 photoreceptors 的退化，並且逐漸地會引起中央視覺(central vision)的喪失 3, 6(圖五)。. 2.

(16) 圖五. A.正常的視網膜. B. “dry” form of ARMD(有許多 drusen)，典型地，中央黃斑區域變薄，結疤及萎縮. (Figures from www.eyemdlink.com). C.“wet” form of ARMD. 中央黃斑區域底下具有有異常血管的增生及出血(Figures from www.eyemdlink.com). 中央視覺(central vision)是人們視覺最重要的部分，使用於閱讀，駕駛，看圖或面孔等，乃是由視網膜黃斑部所提供，黃斑部的損傷通常會比視網膜其他部位的損傷(提供 peripheral vision)引起更嚴重的失明(圖六)。. 圖六.. A.正常的視覺. B.中央視覺喪失(central vision loss)：觀看菜單時，只看到模糊的白色區域，而其週邊，雖然稍微地不清楚，但仍可辨認。 (from www.retina-international.org/losscvis.htm) 3.

(17) AMD 是一個多因素的疾病，與環境有關的危險因子，如：抽煙，飲食，膽固醇等，也與基因及家族史有關 7。總括來說，AMD 的危險因子涵蓋了：(1)年齡：年齡是最重要的危險因子，隨著年齡的增加，危險就愈大，大於 70 歲以上，早期及晚期 AMD(early and late AMD)的罹患率急劇的上升 2, 3 (2)性別：女性具有稍微高的危險機率進展成 late AMD8，可能與有較高的 KDR(kinase insert domain receptor)的表現有關， KDR 為強的血管生成細胞激素(angiogenic cytokine)VEGF(vascular endothelial growth factor)的接受器 9(3)種族：白種人比膚色較深的種族有較高罹患 AMD 的機會 10, 11，因此認為黑色素(melanin)可能具有保護作用，避免 CNV(choroidal neovascularization)的形成，黑色素(melanin)似乎可以保護避免 RPE lipofuscin 的形成，REP lipofuscin 為細胞老化的標的及促進氧化損傷 (oxidative damage) 的物質 (cardiovascular factors)：抽煙. 12, 13. (4) 心血管因子. 14. —尼古丁會誘發 endothelial cell proliferation 及加速. fibrovascular growth，導致血管新生 15；高血壓 16—angiotensin II 與高血壓有關，它會誘發 VEGF 及 angiopoietin 2 的表現，這些乃是涉及到 angiogenesis 的 growth factors17；脂肪的攝取—血液中高膽固醇會增加 atherosclerosis 的危險，不利於脈絡膜血液循環 (choroidal circulation)，另外，會增加脂肪在 Bruch's membrane 的沉積，不利於營養物質的供應及來自於 RPE 廢物的排除 18(5)氧化的進行(oxidative processes)：光—過度的暴露於光線下會傷害視網膜，光作用於 photoreceptors 上會產生自由基，這些不穩定的物質具有高度的反應性及毒性，會造成細胞膜的傷害. 19. ；抗氧化微量營養物質. (antioxidant micronutrients)—在視網膜中，兩個最主要的 antioxidant micronutrients 是 carotenoids lutein 和 zeaxanthin，抗氧化物質可以減少因光線誘發所產生自由基對視網膜的傷害，降低罹患 AMD 的風險(6)遺傳因子(genetic factors)：AMD 家族史的個體，罹患 AMD 的風險會增加 20，具有 CFH(complement factor H) Tyr402His polymorphism 基因罹患 AMD 的風險約增加 2.45-5.57 倍 21，具有 ABCA4 D2177N 和 G1961E 基因罹患 AMD 的風險分別增加 3 倍及 5 倍 22，fibulin 5 gene 發生 missense mutations 可發現於 1.7%的 AMD 患者等 23，皆與基因有相關連。. 4.

(18) 二、 AMD的致病機轉(Pathogenesis of AMD) AMD 是一個退化性疾病，影響的範圍包括了 outer neural retina，RPE，Bruch's membrane 及 choroid4。生理性的老化乃是與氧化壓力(oxidative stress)的累積有關，視網膜(retina)和 RPE 由於高度的耗氧量及長期暴露於輻射下累積的程度，特別對於氧化壓力(oxidative stress)敏感 24，氧化壓力(oxidative stress)會導致 RPE 及可能脈絡膜微血管(choriocapillary)的傷害，RPE 的損傷會引起 Bruch's membrane 及脈絡膜(choroids) 的發炎反應，接著會促進 RPE cell、視覺接受器細胞(photoreceptor cells)、脈絡膜的細胞、循環係統中異常 ECM(extracellular matrix)的生成，異常的 ECM 則會改變營養物質擴散到視網膜(retina)和 RPE，因此可能引起視網膜(retina)和 RPE 進一步的損害，另外，隨著年齡，lipofuscin(lipid-protein aggregates)會堆積在 RPE 細胞中，使得功能性細胞質的空間減少而可能損害 RPE 的功能(如吞噬作用 25)，因而導致視覺接受器的死亡，lipofuscin 也可能誘發 RPE 及周圍組織的氧化傷害，脈絡膜隨著年齡厚度會減少、脈絡膜微血管(choriocapillary)的密度及管徑會減少，因此導致脈絡膜血流的減少 26. ，Bruch's membrane 隨著年齡也會增厚，乃是由於 extracellular material 生成增加及. 分解減少；在 Bruch's membrane 中 collagen cross-linking 似乎會增加， glycosaminoglycans size 和 heparan sulfate 及 lipid 含量會增加，因此會減少 Brunch's membrane 的滲透性. 27. ，所以影響了分子的運送而引起 RPE 的損害及改變 RPE-. choriocapillary 的生物行為，最後導致視網膜 (retina) ， RPE ，脈絡膜微血管 (choriocapillary)的萎縮(atrophy)或/及脈絡膜新血管的生成 28。在這些事件中，環境的因素(如：抽煙，動脈硬化，低量的抗氧化維生素 29 和抗氧化酵素 30)及多個基因的影響可能改變個體對於 AMD 的感受性(圖七)。. 5.

(19) 圖七.年齡 vs AMD，在基因及環境影響的背景上，除了發炎與血管新生之外，氧化壓力可能是 AMD 病理機轉中最可能的主要事件 28。. 三、血管新生與發炎在 AMD 的角色(Role of angiogenesis and inflammation in AMD) 血管供給的形成為胚胎發生(embryogenesis)期間器官發育和分化及成人期間傷口癒合及生育功能的基本需求，血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor(VEGF)) 是主要的血管生成因子 (angiogenic factor) 並且是內皮細胞增生 (endothelial cell proliferation) 主要的調節者，在生理性的脈管發生(vasculogenesis)及血管滲透性(vascular permeability)扮演一個重要的角色 31, 32(圖八)，並且涉及許多疾病的病理過程，如:視網膜增生病變(proliferative retinopathies)，老年黃斑退化性疾病 (AMD)，腫瘤(tumor)，類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)，牛皮癬(psoriasis)，等等 33. 。. 6.

(20) 圖八.Vasculogenesis 及 angiogenesis。Vasculogenesis 涉及到 hemangioblastic blood island 的形成及微血管網路的建造，angiogenesis 涉及 primary capillary plexus 經由 remodelling 及 pruning 形成另一微血管床(capillary bed)，動脈，靜脈 34。. 血管內皮生長因子(VEGF)重要的特性：(1)高度地選擇於內皮細胞(endothelial cell)(2)低氧狀態會驅使 VEGF 的合成而高氧狀態會抑制 VEGF 的合成(3)VEGF 可以擴散至它的標的細胞(4)血管新生多個組成份子(內皮細胞增生，存活，位移)及血管滲透性會受到 VEGF 所影響 4。在 AMD 中，VEGF 可以誘發 urokinase-type plasminogen activators 和 tissue-type plasminogen activators 及 metalloproteinase interstitial collagenase ，這些會促進 extracellular matrix 的分解並且促進內皮細胞的位移 (endothelia cell migration)，VEGF 也有助於促成血管高滲透性，導致於血漿蛋白的釋出，作為內皮細胞生長所需的物質。VEGF 可誘發 retinal vascular endothelium 表現 intercellular adhesion molecular-1(ICAM-1)及調節白血球附著到內皮細胞. 35. ，引起. leukostasis 及發炎反應，活化的吞噬細胞(activated macrophage)會分泌蛋白水解酶 (proteolytic enzymes)，如 collagenase 和 elastase，會侵蝕 Bruch's membrane 並且促進脈絡膜微血管(choriocapillary)的轉移，此外，白血球也會產生及分泌 VEGF36。Ang 1 (angiopoietin-1)、Ang 2(angiopoietin-2)會調節 VEGF 所誘發的血管新生(VEGF-induced neovascularization)，Ang 1 會促進由 VEGF 所誘發的血管成熟，Ang 2 則會增強由 VEGF. 7.

(21) 所激發的血管新生(neovascularization)。一氧化氮(NO)涉及調節系統性的血壓，也在 VEGF 誘發血管新生和高滲透性扮演一個重要的角色，VEGF 會誘發增強來自於內皮細胞一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase(eNOS))的作用，隨後釋出一氧化氮 37，一氧化氮也會經由增強內皮細胞上的 αvβ3 integrin38 和減少 extracellular matrix 的附著以促進內皮細胞的位移及分化形成微血管，此外，內生性一氧化氮會增強 VEGF 的合成 39。VEGF 也會誘發 MMP(matrix metalloproteinase)的生成 40，以促使內皮細胞可侵入 extracellular matrix 及位移，另外，也有研究已指出在視網膜內，serine proteases 過度的表現會分解 extracellular matrix proteoglycan，而會促進其他的 degradative matrix enzymes(如 collagenase 和 matrix metalloproteinase)得以進入和他們的受質結合，進而破壞 Bruch's membrane 的完整性，有利於脈絡膜微血管穿過 extracellular matrix 造成血管新生 41，而脈絡膜血管新生的形成(CNV)則是 exduative AMD 的標的(hallmark)，在 CNV 形成的過程中，血管新生生長因子(angiogenic growth factor)的增強，如 VEGF，已經報告過並且認為是相當重要的角色 42, 43(圖九)。. 圖九.脈絡膜血管新生(choroidal neovascularization)形成中，血管新生的調控 4。. 8.

(22) 發炎時常和血管新生增加有關，發炎會誘發血管或其他組織細胞或者是浸潤的白血球產生血管新生因子(agiogenic factors)44，包括了： tumor necrosis factor-α (TNF-α)； interleukin-8 (IL-8)；TGF-β45；IL-646 等等，以調節 VEGF 的表現 47。TNF-α 是一個多功能的 proinflammatory cytokine ，它會活化內皮細胞及增加附著分子 (adhesion molecular) 的表現及會活化發炎性白血球 (inflammatory leukocytes) 並且刺激 macrophages 產生其他的細胞激素(如：interleukin-1 (IL-1)，IL-6，TNF-α48 引發 acute phase response)及 chemokine(IL-8 會吸引白血球的湧入，這些白血球則會釋放出內皮生長因子(endothelial growth factors)引發血管新生)49。因此，TNF-α 所引起的發炎反應會誘發血管新生的形成，將發炎及血管新生直接的鍵結在一起，44 使得發炎及血管新生在 AMD 的致病機轉中扮演相當重要的角色。四、治療(Treatment) 目前，對於 dry AMD 並沒有可靠的治療方法，而對於 wet AMD， laser photocoagulation 則為廣泛接受的治療方法，此治療方法只有利於 juxtafoveal 或 extrafoveal CNV，約只有 10-15% wet AMD 患者適合此治療方式，且在治療的 3 至 5 年內超過 50% 的患者仍具有持續地 CNV 或再發性 CNV 發生. 50. ，但 laser. photocoagulation 仍然是標準的照料方式。最近 verteporfin photodynamic therapy (PDT) 已經被認可為典型的 subfoveal CNV 的治療方式，但也侷限於穩定視覺及疾病的惡化 51. 。. 第二節研究目的因 AMD 的形成及致病機轉是由環境因子和基因因素複雜的相互反應所決定的，除了年齡之外，最重要的危險因子應是在基因層面，因環境因素的影響仍決定於基因的控制之下，故我們研究 AMD 致病機轉中，血管新生及發炎之相關基因與老年黃斑退化性疾病之關連性，總共分析了血管新生因子基因 VEGF(-2578；-1498；-634；+936) 和調節血管新生及發炎相關基因 TNF-α(-1031；-863；-857；-308；-238；+489)， 9.

(23) IL-6(-572)，IL-8(-251)，IL-1 β(-511)，TGF-β1(-509)，抗發炎基因 IL-10(-1082；-819； -592)及最近報告的 AMD 敏感性基因 HTRA1 rs11200638、LOC387715 之基因型 (genotypes),對偶基因(allele)及基因多型性(polymorphisms)與對照族群相比較，以評估這些相關基因是否為罹患老年黃斑退化性疾病之危險因子或保護因子，期能促進早期預防及延緩疾病的發生及惡化，提升老年人的生活品質及減輕家人照護及醫療支付的負擔。. 第二章. 研究方法. 第一節研究族群(Study population) 總共 185 位台灣地區民眾參與此項研究，從 2003 年 10 月至 2006 年 5 月由私立中國醫藥大學院附設醫院眼科林正明醫師所募集而來，進行回溯性病例對照研究 (retrospective case-control study)。此研究計畫獲得私立中國醫藥大學附設醫院醫學倫理委員會核准，並取得接受試驗者之書面同意。這些參與者之中，實驗組為 95 位經理學檢查 (clinical examination) ，眼底攝影 (fundus photograph) 和螢光血管攝影 (fluorescein angiography)診斷患有老年黃斑退化性疾病(AMD)的患者，平均年齡為 71.2±7.1 歲，54 位男性，41 位女性。對照組為 90 位年齡及性別相當的健康個體，且不具有 AMD 疾病的家族史，平均年齡為 71.5±6.9 歲，49 位男性，41 位女性。. 第二節 DNA 的萃取及基因型分析(DNA extraction and Genotyping) 抽取病患及對照組個體靜脈血置於含抗凝固劑 EDTA 試管中，使用 MagNA Pure LC DNA isolation Kit(Roche Applied Science,Germany)經自動化儀器(MagNA Pure LC Instrument, Roche Applied Science,Germany)萃取白血球中的 DNA ，然後保存於 -20℃ ，直到進行分析。本研究大部分使用 PCR-RFLP 的方法進行基因型分析 (genotyping)，PCR 每管的總體積為 25µl，內含 50-100 ng genomic DNA，1× Super-Therm. 10.

(24) reaction buffer (1.5 mM MgCl2)，0.25 U Super-Therm DNA polymerase(JMR Holdings, U.S.A.) ， 0.4 μmol/L forward primer 及 reverse primer(MDBio,Inc.) ， 0.2 mmol/L dNTP(Promega,U.S.A)，然後使用 PCR 儀器 Gene Amp@ PCR System 9700(PE Applied Biosystem)進行 PCR 反應。只有分析 VEGF -1498 C/T SNP 則使用 real-time PCR 的方法進行基因型分析(genotyping)。 VEGF.四個 VEGF 單核酸多型性( single nucleotide polymorphisms, SNPs )，promoter -2578 C/A、-1498 T/C；5'-UTR -634 C/G；3'-UTR 936 C/T 進行基因型分析，-2578 C/A， -634 C/G 及 936 C/T 的核苷酸序列進行 PCR 反應(936 C/T PCR 內容物額外添加 1 mmo l/L MgCl2)，PCR primer：-2578 C/A 為 5'-GGCCTTAGGACACCATACC-3' (forward)和 5'-CACAGCTTCTCCCCTATCC-3' (reverse)，-634 C/G 為 5'-ATTTATTTTTGCTTGC CATT-3' (forward)和 5'-GTCTGTCTGTCTGTCCGTCA-3' (reverse)，936 C/T 為 5'-AAG GAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGC-3'(forward) 和 5'-TAAATGTATGTATGTGGGTG GGTGTG TCTACAGG-3' (reverse)。PCR 反應的溫度條件：initial denaturation step 95 ℃ 5 min，35 cycles 的反應溫度條件：denaturation 95 ℃ 30 sec，annealing 65 ℃(-2578 C/A；936 C/T)或 55 ℃(-634 C/G) 30sec，extension 72 ℃ 40sec，final extension step 72 ℃ 7min。PCR 產物使用 restriction enzyme digestion，-2578 C/A 所使用的 restriction enzyme 為 BstYⅠ，60 ℃ overnight；-634 C/G 為 BsmFⅠ，60 ℃ overnight；936 C/T 為 Nla Ⅲ， 37 ℃ overnight(New England Biolabs ,Beverly,MA)，然後使用 3%～3.5% agarose gel 進行電泳分析基因型，使用 ethidium bromid 染色及進行影像攝影， -2578 C/A polymorphism：homozygous C genotype (CC)產生一個 439 bp 片段；homozygous A genotype (AA)產生 231 bp 及 208 bp 兩個片段；heterozygous genotype (CA)則產生三個片段，此外， A allele 比 C allele 多 18 個核苷酸嵌入，核苷酸序列為 5'-TCCCACTCTTCCCACAGG-3'. 52. ( 圖十 ) 。 -634 C/G polymorphism ： homozygous C. genotype (CC)產生一個 304 bp 片段；homozygous G genotype (GG) 產生 193 bp 及 111 bp 兩個片段；heterozygous genotype (CG)則產生三個片段。936 C/T polymorphism： homozygous C genotype (CC)產生一個 208 bp 片段；homozygous T genotype (TT) 產生 122 bp 及 86 bp 兩個片段；heterozygous genotype (CT)則產生三個片段(如表一)。. 11.

(25) 圖十.-2578 A allele 比 C allele 多 18 個核苷酸嵌入(粗體字)52。 VEGF -1498 T/C(rs833061)單核酸多型性(SNP)則使用 LightCycler®480 儀器 (Roche Applied Science,Germany)進行 real-time PCR 來分析基因型(genotyping) ，PCR 反應為使用 LightCycler-FastSrart DNA Master Hybridization Probes kit (Roche Applied Science,Germany)，每管的總體積為 10µl，內含 50-100 ng genomic DNA，0.5 µM prime -460-se (CCACAGGGAAGCTGGGTGAA)、primer -460-rev (AGCC GTTCCTCTTTGCTAG)，0.1µM probe -460Sens (CCCGCTCCAACGCCCTCA-FL)、 probe -460Anchor (LC RED640 CCCCACACGCACACACTCACTCACCC-P) (TIB MOLBIOL, Germany)，1X conc Genotyping Master (內含 DNA polymerase、reaction buffer、dNTP、MgCl2 )。反應的溫度條件：initial denaturation 95 ℃ 10 min，40 cycle： denaturation 95 ℃ 10 sec (4.4 ℃/sec)，annealing 56 ℃ 15 sec(2.2 ℃/sec，single acquisition)，extension 72 ℃ 12 sec (4.4 ℃/sec)，melting curve analysis：95 ℃ 1 min(4.4 ℃/sec)，40 ℃ 1 min(1.5 ℃/sec)，80 ℃ 0 sec( 0.2 ℃/sec，continuous acquisition)，cooling 40 ℃ 30 sec。. TNF-α.分析 6 個 TNF-α 基因多型性，5 個位於 promoter 區域 -238，-308，-857， -863，-1031，1 個位於 +489(intron)的核苷酸序列進行 PCR 反應，PCR primer： -238 G/A 為 5'-AAACAGACCACAGACCTGGTC-3' (forward)和 5'-CTCACACTC CCCATCCTCCCGGATC-3' (reverse)，reverse primer 含有兩個錯誤配對的核苷酸(畫有底線的部分)，使得能夠使用限制酶 Bam HⅠ，37 ℃ overnight 來測定-238 G/A 基因多型性。-308 G/A 為 5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'(forward)和 5'-ACACTCCC CATCCTCCCGGCT-3' (reverse)，forward primer 含有一個錯誤配對的核苷酸(畫有底線的部分)，使得能夠使用限制酶 NcoⅠ37 ℃ overnight，來測定-308 G/A 基因多型性。 -857 C/T 和-863 C/A 為使用共同的 forward prime 5'-GGCTCTGAGGAATGGGTTAC12.

(26) 3' ，reverse primer 則分別為 5'-CCTCTACATGGCCCTGTCTAC-3'和 5'-CTACATGGC CCTGTCTTCGTTACG-3'，兩個 reverse primer 都含有一個錯誤配對的核苷酸(畫有底線的部分)，使得能夠使用限制酶 HpyCH4Ⅳ，37 ℃ overnight，來測定-857 C/T 和-863 C/A 基因多型性。-1031 T/C 為 5'-TATGTGATGGACTCACCAGGT-3' (forward)和 5'-CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3' (reverse)，使用限制酶 BbsⅠ，37 ℃ overnight 來測定-1031 T/C 基因多型性。+489 G/A 為 5'-GGAGAGAAGCAACTACAGAC-3'(forward) 和 5'-CACACTTAGTGAGCACCTTC-3' (reverse) ，使用限制酶 HpyCH4Ⅳ ， 37 ℃ overnight 來測定+489 G/A 基因多型性。 PCR 反應的溫度條件：initial denaturation step 95 ℃ 5 min，35 cycles 的反應溫度條件：denaturation 95 ℃ 30 sec，annealing -238 G/A：59 ℃、-308 G/A：touchdown 60-50 ℃、-857 C/T：59 ℃、-863 C/A：59 ℃、-1031 T/C：57 ℃、+489 G/A：60 ℃. 30sec，. extension 72 ℃ 40sec，final extension step 72 ℃ 7min，PCR 產物分別使用上述的 restriction. enzyme(New. England. Biolabs,Beverly,MA). digestion ， -238. G/A. polymorphism：homozygous A genotype (AA)產生一個 155 bp 片段；homozygous G genotype (GG) 產生 130 bp 及 25 bp 兩個片段；heterozygous genotype (GA)則產生三個片段。-308 G/A polymorphism：homozygous A genotype (AA)產生一個 117 bp 片段； homozygous G genotype (GG)產生 97 bp 及 20 bp 兩個片段；heterozygous genotype (GA) 則產生三個片段。-857 C/T polymorphism：homozygous T genotype (TT)產生一個 129 bp 片段；homozygous C genotype (CC) 產生 107 bp 及 22 bp 兩個片段；heterozygous genotype (CT)則產生三個片段。-863 C/A polymorphism：homozygous C genotype (CC) 產生一個 126 bp 片段；homozygous A genotype (AA)產生 101 bp 及 25 bp 兩個片段； heterozygous genotype (CA)則產生三個片段。-1031 T/C polymorphism：homozygous T genotype (TT)產生一個 250 bp 片段；homozygous C genotype (CC)產生 194 bp 及 56 bp 兩個片段；heterozygous genotype (CT)則產生三個片段。+489 G/A polymorphism： homozygous A genotype (AA)產生 392 bp 及 159 bp 兩個片段；homozygous G genotype (GG)產生 281 bp，159 bp 及 111 bp 三個片段；heterozygous genotype (AG)則產生 392 bp，281 bp，159 bp 及 111 bp 四個片段(如表一)。 13.

(27) IL-10.IL-10 gene promoter polymorphism(-1082，-819，-592)的核苷酸序列進行 PCR 反應，PCR primer：-1082 A/G 為 5'-CTCGCTGCAACCCAACTGGC-3'(forward) 和 5'-TCTTACCTATCCCTACTTCC-3' (reverse)，-819 T/C 為 5'-TCATTCTATGTG CTGGAGATGG-3'(forward)和 5'-TGGGGGAAGTGGGTAAGAGT-3'(reverse)， -592 A/C 為 5'-GGTGAGCACTACCTGACTAGC-3' (forward)和 5'-CCTAGGTCAC AGTGACGTGG-3' (reverse)，PCR 反應的溫度條件：initial denaturation step 95 ℃ 5 min，35 cycles 的反應溫度條件：denaturation 95 ℃ 30 sec，annealing -1082 A/G： touchdown 60-50 ℃、-819 T/C：55 ℃、-592 A/C：60 ℃ 30 sec，extension 72 ℃ 40sec， final extension step 72 ℃ 7min。PCR 產物使用 restriction enzyme digestion，-1082 A/G 所使用的 restriction enzyme 為 MnlⅠ(New England Biolabs,Beverly,MA)，37 ℃ overnight；-819 T/C 為 Mae Ⅲ (Roche Applied Science,Germany)，55 ℃ overnight； -592 A/C 為 RsaⅠ，37 ℃ overnight(New England Biolabs,Beverly,MA)。-1082 A/G polymorphism：homozygous A genotype (AA)產生一個 139 bp 片段；homozygous G genotype (GG)產生 106 bp 及 33 bp 兩個片段；heterozygous genotype (AG)則產生三個片段。-819 T/C polymorphism：homozygous T genotype (TT)產生一個 209 bp 片段；homozygous C genotype (CC)產生 125 bp 及 84 bp 兩個片段；heterozygous genotype (TC)則產生三個片段。-592 A/C polymorphism：homozygous C genotype (CC)產生一個 412 bp 片段； homozygous A genotype (AA)產生 236 bp 及 176 bp 兩個片段；heterozygous (AC)則產生三個片段(如表一)。. IL-6，IL-8，IL-1β，TGF-β1，HTRA 1，LOC387715.分析 IL-6 promoter -572 G/C；IL-8 promoter -251 A/T，IL-1β promoter -511 T/C，TGF-β1 promoter -509 C/T，HTRA1 promoter G/A (rs11200638)，LOC387715 exon 1 T/G (rs10490924)基因多型性，將其核苷酸序列進行 PCR 反應(HTRA1 rs11200638 PCR 內容物額外添加 8% DMSO)，PCR primer：IL-6 -572 G/C 為 5'-GCAAAGTCCTCACTGGGAGGA-3' (forward)和 5'-TCTGA CTCCATCGCAGCCC-3'(reverse)。IL-8 -251 A/T 為 5'-TCATCCATGATCTTGTTCTA A-3' (forward)和 5'-GGAAAACGCTGTAGGTCAGA-3' (reverse)。IL-1β -511 T/C 為 14.

(28) 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3'(forward)和 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' (reverse)。TGF-β1 -509 C/T 為 5'-CCAGCTAAGGCATGGCACCG-3'(forward)和 5'-GCGGTGTGGGTCACCAGAGA-3'(reverse)。HTRA1 rs11200638 為 5'-CACCCTCGC CAGTTACGA-3' (forward)和 5'-GGGGAAAGTTCCTGCAAATC-3'(reverse)。 LOC387715 rs10490924 為 5'-TACCCAGGACCGATGGTAAC-3'(forward)和 5'-TGTGG ATGATAGACAGTGTCAGG-3'(reverse)。PCR 反應的溫度條件：initial denaturation step 95 ℃ 5 min，35 cycles 的反應溫度條件：denaturation 95℃ 30 sec，annealing：60 ℃( IL-6 -572 G/C；TGF-β1 -509 C/T)或 58 ℃(IL-8 -251 A/T；IL-1β -511 T/C)或 56 ℃(HTRA1 rs11200638)或 touchdown 60-50 ℃(LOC387715 rs10490924) 30sec，extension 72 ℃ 40sec，final extension step 72 ℃ 7 min。PCR 產物使用 restriction enzyme digestion，IL-6 -572 G/C 為使用 BsrBⅠ；IL-8 -251 A/T 為 MfeⅠ；IL-1β -511 T/C 為 Ava Ⅰ，TGF-β1 -509 C/T 為 Bsu36Ⅰ，37 ℃ overnight，HTRA1 rs11200638 為 BsiE I 60 ℃ overnight， LOC387715 rs10490924 為 Tse I 65 ℃ overnight(New England Biolabs ,Beverly, MA )。 IL-6 -572 G/C polymorphism：homozygous C genotype (CC)產生一個 296 bp 片段； homozygous G genotype (GG)產生 201 bp 及 95 bp 兩個片段；heterozygous genotype (CG)則產生三個片段。IL-8 -251 A/T polymorphism：homozygous T genotype (TT)產生一個 542 bp 片段；homozygous A genotype (AA)產生 449 bp 及 92 bp 兩個片段； heterozygous genotype (TA)則產生三個片段。IL-1β -511 T/C polymorphism： homozygous T genotype (TT)產生一個 304 bp 片段；homozygous C genotype (CC)產生 190 bp 及 114 bp 兩個片段；heterozygous genotype (TC)則產生三個片段。TGF-β1 -509 C/T polymorphism：homozygous C genotype (CC)產生一個 400 bp 片段；homozygous T genotype (TT)產生 202 bp 及 198 bp 兩個片段；heterozygous genotype (CT)則產生三個片段。HTRA1 G/A (rs11200638) polymorphism：homozygous A genotype (AA)產生一個 383 bp 片段；homozygous G genotype (GG)產生 203 bp 及 180 bp 兩個片段；heterozygous genotype (GA)則產生三個片段。LOC387715 T/G (rs10490924) polymorphism： homozygous T genotype (TT)產生 261 bp 及 37 bp 兩個片段；homozygous G genotype 15.

(29) (GG)產生 190 bp，71 bp 及 37 bp 三個片段；heterozygous genotype (GT)則產生四個片段(如表一)。. 表一.PCR-RFLP typing：PCR primer pairs 和 PCR 反應條件、PCR product size、restriction enzyme site 及每一個 allele 的 restriction fragment sizes Product size. Polymorphism (rs number). DNA. PCR. Sequence. primer. (bp). Fragment size. PCR conditions. Restriction. (annealing temp.). Enzyme site. Alleles. 65℃. BstYⅠ. C. 439. A. 231，208. C. 304. G. 193，111. C. 208. T. 122，86. A. 155. G. 130，25. A. 117. G. 97，20. T. 129. C. 107，22. C. 126. A. 101，25. T. 250. C. 194，56. A. 392，159. G. 281，159，111. A. 139. G. 106，33. T. 209. G. 125，84. C. 412. A. 236，176. (bp). VEGF -2578 C/A. F5'-GGCCTTAGGACACCATACC-3'. (rs699947). R5'-CACAGCTTCTCCCCTATCC-3'. -634 C/G. F5'-ATTTATTTTTGCTTGCCATT-3'. (rs2010963). R5'-GTCTGTCTGTCTGTCCGTCA-3'. 936 C/T (rs3025039). F5'-AAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGC-3'. 439. 304. 208. 55℃. 65℃. BsmFⅠ. Nla Ⅲ. R5'-TAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTACAGG-3'. TNF-α -238 G/A (rs1800629) -308 G/A. F5'-AAACAGACCACAGACCTGGTC-3'. F5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3' R5'-ACACTCCCCATCCTCCCGGCT-3'. -857 C/T. F5'-GGCTCTGAGGAATGGGTTAC-3'. (rs1799724). R5'-CCTCTACATGGCCCTGTCTAC-3'. -863 C/A. F5'-GGCTCTGAGGAATGGGTTAC-3'. -1031 T/C (rs1799724). 59℃. Bam HⅠ. R5'-CTCACACTCCCCATCCTCCCGGATC-3'. (rs1800629). (rs1800630). 155. 117. 129. 126. Touchdown 60-50℃. 59℃. 59℃. NcoⅠ. HpyCH4Ⅳ. HpyCH4Ⅳ. R5'-CTACATGGCCCTGTCTTCGTTACG-3' F5'-TATGTGATGGACTCACCAGGT-3'. 250. 57℃. BbsⅠ. R5'-CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3'. +489 G/A. F5'-GGAGAGAAGCAACTACAGAC-3'. (rs1800610). R5'-CACACTTAGTGAGCACCTTC-3'. 551. 60℃. HpyCH4Ⅳ. IL-10 -1082 G/A. F5'-CTCGCTGCAACCCAACTGGC-3'. (rs1800896). R5'-TCTTACCTATCCCTACTTCC-3'. -819 C/T. F5'-TCATTCTATGTGCTGGAGATGG-3'. (rs1800871). R5'-TGGGGGAAGTGGGTAAGAGT-3'. -592 C/A. F5'-GGTGAGCACTACCTGACTAGC-3'. (rs1800872). R5'-CCTAGGTCACAGTGACGTGG-3'. 139. 209. 412. 16. Touchdown 65-55℃. 55℃. 60℃. MnlⅠ. MaeⅢ. Rsa Ⅰ.

(30) 表一.PCR-RFLP typing：PCR primer pairs 和 PCR 反應條件、PCR product size、restriction enzyme site 及每一個 allele 的 restriction fragment sizes DNA. PCR Product size. Sequence primer. polymorphism. (bp). Fragment size. PCR conditions. Restriction. (annealing temp.). Enzyme site. Alleles. 60℃. BsrBⅠ. C. 296. G. 201，95. T. 542. A. 449，92. T. 304. C. 190，114. C. 400. T. 202，198. A. 383. G. 203，180. T. 261，37. G. 190，71，37. (bp). IL-6 -572 C/G. F5'-GCAAAGTCCTCACTGGGAGGA-3'. (rs1800796). 296. R5'-TCTGACTCCATCGCAGCCC-3'. IL-8 -251 A/T. F5'-TCATCCATGATCTTGTTCTAA-3'. (rs4073). R5'-GGAAAACGCTGTAGGTCAGA-3. 542. 58℃. MfeⅠ. IL-1β -511 T/C. F5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3'. (rs16944). R5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3'. 304. 58℃. Ava Ⅰ. TGF-β1 -509 C/T. F5'-CCAGCTAAGGCATGGCACCG-3'. (rs1800469). R5'-GCGGTGTGGGTCACCAGAGA-3'. HTRA1 G/A. F5'-CACCCTCGCCAGTTACGA-3'. (rs11200638). R5'-GGGGAAAGTTCCTGCAAATC-3'. LOC387715 T/G. F5'-TACCCAGGACCGATGGTAAC-3'. (rs10490924). 400. 383. 298. -. R5' TGTGGATGATAGACAGTGTCAGG-3'. 60℃. 58℃. Touchdown 60-50℃. Bsu36Ⅰ. BsiE I. Tse I. 第三節統計分析(Statistic Analysis) 統計分析為使用標準統計軟體(SPSS for Windows v12.0；SPSS ,Chicago,IL)，使用 Student’s t-tests 及 Chi-square tests 來評估 AMD 病患與對照組臨床特徵上的差異。 genotype、allele 及 haplotype 的機率在兩組中的差異，則使用 Chi-square tests or Fisher’s exact test(使用於期望次數小於 1 及 20%格子之期望次數小於 5)來評估，Odds ratios (OR)及 95% confidence intervals (CI)則來比較與類別變數間的相關強度。haplotype 的組成為使用 PHASE 軟體(version 2.1)來評估。統計學上 two-tailed p-value <0.05，則認為具有統計學上顯著的差異。. 17.

(31) 第三章. 研究結果. 第一節臨床特徵(Clinical characteristics) AMD 患者與對照組個體之臨床特徵呈現於表二，95 位 AMD 患者及 90 位對照組個體，在年齡(p=0.975)及性別(p=0.743)上並無差異，其他的危險因子，如：抽煙、 BMI、血壓、高血壓、醣尿病、心血管疾病、高血脂，也無顯著的差異存在。. 表二.AMD 患者與對照組間，臨床特徵之比較. Age (y) 60 – 69 (n) 70 – 79 (n) ≧ 80 (n) Female/Male (n) Smoking status (n) Never Past Current Body mass index (kg/m2) Blood pressure (mmHg) Systolic Diastolic Hypertension (%) Diabetes (%) Cardiovascular disease (%) Hyperlipidemia (%) Values are mean ± SD. AMD Cases (n = 95) 71.2 ± 7.1. Controls (n = 90) 71.5 ± 6.9. p value. 44 39 13 41/54. 40 38 12 41/49. 0.975. 47 36 12 24.3 ± 0.5. 43 35 12 24.7 ± 0.8. 0.972. 138.4 ± 10.2 88.1 ± 7.1. 135.8 ± 9.5 86.6 ± 6.9. 47.4 9.5 14.7. 48.3 9.1 13.6. 21.3. 18.6. 18. 0.743.

(32) 第二節血管內皮生長因子基因之多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連性 (Association of VEGF gene polymorphisms with AMD patients and control subjects) VEGF 四個單核酸多型性( single nucleotide polymorphisms, SNPs )，promoter -2578 C/A；-1498 T/C、5'-UTR -634 C/G、3'-UTR 936 C/T 進行分析，圖十一呈現出三個 VEGF SNP 基因型的電泳分析圖，我們發現-2578 C/A，具有 A allele 的個體，多 18 個核苷酸嵌入，而 CC homozygous 的個體則無此 18 個核苷酸嵌入，與之前的研究報告相同 52。AMD 患者與對照組個體間，genotype 與 allele 的機率分佈呈現於表三及表四，-2578 C/A、-1498 T/C、-634 C/G、936 C/T genotype 在 AMD 患者與對照組個體間並無顯著的差異(-2578 C/A, p=0.189；-1498 T/C, p=0.926；-634 C/G, p=0.345；936 C/T, p=0.137)，但 936 C/T 在 dominant genetic analysis (CC vs CT+TT)中，發現 AMD 患者有攜帶 T allele 的傾向(p=0.072；OR=0.561；95% CI＝0.299~1.055)，而在 allele 分析中，-2578 C/A、-1498 T/C、-634 C/G 在 AMD 患者與對照組個體中並無顯著的差異(-2578 C/A, p=0.104；-1498 T/C, p=0.574；-634 C/G, p=0.367)，936 C/T 在 AMD 患者與對照組個體間具有顯著的差異，AMD 患者比較於對照組個體，有較多的比例帶有 VEGF 936 T allele (22.3% vs 14.0%，OR=1.761，95% CI=1.02~3.04，p=0.038)。. 19.

(33) CC CA CA CA CC CC AA CC. CC CG CG CG CG CG GG. 400. 100. A. promoter -2578 C/A. B.5'-UTR -634 C/G. CC CT TT CC CC CT CC. C. 3'-UTR 936 C/T 圖十一. VEGF polymorphisms.(A) promoter -2578 C/A：CC genotype 產生一個 439 bp 片段，AA genotype 產生 231 bp 及 208 bp 兩個片段，CA genotype 產生 439 bp， 231 bp 及 208 bp 三個片段，A allele 的個體，具有多 18 個核苷酸嵌入。(B) 5'-UTR -634 C/G：CC genotype 產生一個 304 bp 片段，GG genotype 產生 193 bp 及 111 bp 兩個片段，CG genotype 產生 304 bp，193 bp 及 111 bp 三個片段。(C) 3'-UTR 936 C/T：CC genotype 產生一個 208 bp 片段，TT genotype 產生 122 bp 及 86 bp 兩個片段，CT genotype 產生 208 bp，122 bp 及 86 bp 三個片段。. 20.

(34) 表三. AMD 患者與對照組個體間 VEGF SNP genotypes 的機率分佈 VEGF-2578. AMD(n=94). Control(n=90). p value. OR (95% CI). CC. 47(50.0%). 57(63.3%). CC vs AA：0.66. 0.550(0.088-3.428). CA. 44(46.8%). 31(34.4%). CA vs AA：1.0. 0.946(0.149-6.002). AA. 3(3.2%). 2(2.2%). AA vs CC,CA：0.189. VEGF -1498. AMD(n=86). Control(n=89). p value. OR (95% CI). TT. 53(59.6%). 58(62.4%). TT vs CC：0.882. 0.914(0.278-3.008). TC. 30(33.7%). 29(31.2%). TC vs CC：0.957. 1.034(0.299-3.580). CC. 6(6.7%). 2(6.5%). CC vs TT,TC：0.926. VEGF -634. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). CC. 9(9.5%). 15(16.7%). CC vs GG：0.21. 0.510(0.179-1.456). CG. 66(69.5%). 58(64.4%). GG. 20(21.0%). 17(18.9%). GG vs CC,CG：0.345. VEGF 936. AMD(n=94). Control(n=89). p value. OR (95% CI). CC. 58(61.7%). 66(74.2%). CC vs TT：0.16. 0.293(0.057-1.508). CT. 30(31.9%). 21(23.6%). CT vs TT：0.47. 0.476(0.087-2.593). TT. 6(6.4%). 2(2.2%). GG vs CC,CG：0.137. CG vs GG：0.93. CC vs CT+TT. 0.072. 0.967(0.463-2.020). 0.561(0.299-1.055). 表四.AMD 患者與對照組個體間 VEGF SNP Allele 的機率分佈 VEGF-2578 A/C. AMD(n=94). Control(n=90). p value. OR (95% CI). C. 138(73.4%). 145(80.6%). A. 50(26.6%). 35(19.4%). 0.104. 1.50(0.92-2.45). VEGF -1498 T/C. AMD(n=86). Control(n=89). p value. OR (95% CI). T. 136(44.2%. 145(48.9%). C. 36(55.8%). 33(51.1%). 0.574. 0.86(0.51-1.46). VEGF -634 G/C. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). C. 84(44.2%. 88(48.9%). G. 106(55.8%). 92(51.1%). 0.367. 1.21(0.81-1.82). VEGF 936 T/C. AMD(n=94). Control(n=89). p value. OR (95% CI). T. 42(22.3%). 25(14.0%). C. 146(77.7%). 153(86.0%). 0.038. 1.76(1.02-3.04). 21.

(35) VEGF -2578 C/A、-1498 T/C、-634 C/G、936 C/T SNP 進行 haplotype 的分析，在我們研究的族群中，以 CTCC haplotype 佔最多數，其次為 CTGC，ACGC(表五)，在 AMD 患者與對照組個體間相比較並無顯著的差異(表六)，然而 AMD 患者帶有較高比率 ATGT haplotype 的傾向(0.6% vs 3.7%，OR=0.146，95% CI=0.018~1.199， p=0.068)，但進行 haplotypes/genotypes 的分析，我們發現 AMD 患者與對照組個體間有顯著的差異，對照組個體有較高比率帶有 CTCC/CTGC genotype (33.3% vs 20%， OR=2.0，95% CI=1.027~3.897，p=0.040)(表七)。. 表五.VEGF -2578，-1498，-634，936 polymorphisms，所組成可能的 haplotypes 結構及在台灣族群的比例(n=185) Haplotype -2578 -1498 -634 +936. Frequencies. CTCC. 0.331422. CTCT CTGC CTGT CCCC CCCT CCGC CCGT ATCC ATCT ATGC ATGT ACCC ACCT ACGC ACGT. 0.052040 0.316102 0.065679 0.001042 0.001975 0.000910 0.001086 0.013856 0.001980 0.008022 0.009818 0.054175 0.005671 0.096077 0.040144. 22.

(36) 表六. AMD 患者與對照組個體間，VEGF -2578，-1498，-634，936 polymorphisms， haplotypes 的分佈 -2578/-1498/-634/+963 Haplotypes. Control n=180. AMD n=190. p value. Odds ratio (95% CI). ACCC. 1(0.6%). 1(0.5%). 1.0. 1.056(0.066-17.008). ACGC ACGT AT G T CTCC CTCT CTGC CTGT AT C C AT G C CCGC. 22(12.2%) 11(6.1%) 1(0.6%) 83(46.1%) 4(2.2%) 50(27.8%) 8(4.4%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%). 23(12.1%) 14(7.4%) 7(3.7%) 74(38.9%) 6(3.2%) 42(22.1%) 16(8.4%) 2(1.1%) 4(2.1%) 1(0.5%). 0.973 0.630 0.068 0.163 0.751 0.207 0.121 0.499 0.124 1.0. 1.011(0.542-1.886) 0.818(0.361-1.853) 0.146(0.018-1.199) 1.341(0.887-2.028) 0.697(0.193-2.512) 1.355(0.844-2.175) 0.506(0.211-1.213) -. 23.

(37) 表七. AMD 患者與對照組個體間 VEGF -2578，-1498，-634，936 polymorphisms， geontypes 的分佈 -2578/-1498/-634/936 geontypes. Control n=90. AMD n=95. p value. Odds ratio (95% CI). ACCC / ACGT. 1(1.1%). 1(1.1%). 1.0. 1.056(0.065-17.143). ACGC / ACGC CTCC / ACGC CTCC / ACGT CTCC / ATGT CTCC / CTCC CTCC / CTCT CTCC / CTGC CTCC / CTGT CTCT /ACGT CTGC / ACGC CTGC / ACGT CTGC / CTGC CTGC / CTGT ACGC / ACGT CTCC / ATCC CTCC / ATGC CTCC / CCGT CTCT /ATGT CTGT / ACGT CTGT / CTGT. 1(1.1%) 13(14.4%) 6(6.7%) 1(1.1%) 12(13.3%) 3 (3.3%) 30(33.3%) 6(6.7%) 1(1.1%) 7(7.8%) 3(3.3%) 4(4.4%) 2(2.2%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%). 1(1.1%) 14(14.7%) 7(7.4%) 4(4.2%) 6(6.3%) 1(1.1%) 19(20.0%) 11(11.6%) 1(1.1%) 5(5.3%) 4(4.2%) 6(6.3%) 2(2.1%) 1(1.1%) 2(2.1%) 4(4.2%) 1(1.1%) 3(3.2%) 1(1.1%) 1(1.1%). 1.0 0.955 0.852 0.369 0.107 0.358 0.040 0.248 1.0 0.488 1.0 0.748 1.0 1.0 0.498 0.121 1.0 0.246 1.0 1.0. 1.056(0.065-17.143) 0.977(0.432-2.211) 0.898(0.290-2.782) 0.256(0.028-2.332) 2.282(0.818-6.367) 3.241(0.331-31.749) 2.0(1.027-3.897) 0.545(0.193-1.543) 1.056(0.065-17.143) 1.518(0.464-4.969) 0.784(0.171-3.607) 0.690(0.188-2.530) 1.057(0.146-7.666) -. 第三節腫瘤壞死因子基因之多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連性 (Association of TNF-α gene polymorphisms with AMD patients and control subjects) 六個 TNF-α 單核酸多型性( single nucleotide polymorphisms, SNPs )，五個位於 promoter 區域 -1031 T/C，-863 C/A，-857 C/T，-308 G/A，-238 G/A，1 個位於 intron 區域 489 G/A 進行分析，圖十二呈現出六個 TNF-α SNP 基因型的電泳分析圖，AMD 患者與對照組個體間，genotype 與 allele 的機率分佈呈現於表八及表九，-1031 T/C， -863 C/A，-857 C/T，-308 G/A，-238 G/A，489 G/A genotype 在 AMD 患者與對照組個體間的比較，AMD 患者缺乏-1031 CC genotype，與對照組個體具有顯著的差異(0.0 24.

(38) % vs 6.7%，p=0.026)，但在 allele 分析中，AMD 患者與對照組個體間並無顯著的差異 (-1031 T/C， p=0.516；-863 C/A，p=0.163；-857 C/T，p=0.347；-308 G/A，p=0.716； -238 G/A，p=1.0；489 G/A，p=0.322)。 TC TT CC TT TC TT TT. CC CC CA CC CA CC CC AA. A. TNF-α -1031 T/C CC. B. TNF-α -863 C/A. CC CC TC TT CC CC. GG. C. TNF-α -857 C/T GG GG. AAGGAG GG. D. TNF-α -308 G/A AG GG GG GG AG AA GG. GG GG GG GG AG GG. E. TNF-α -238 G/A F. TNF-α 489 G/A 圖十二. TNF-α polymorphisms.(A) -1031 T/C：TT genotype 產生一個 250 bp 片段，CC genotype 產生 194 bp 及 56 bp 兩個片段，TC genotype 產生 250 bp，194 bp 及 56 bp 三個片段。(B) -863 C/A：CC genotype 產生一個 126 bp 片段，AA genotype 產生 101 bp 及 25 bp 兩個片段，CA genotype 產生 126 bp，101 bp 及 25 bp 三個片段。(C) -857 C/T：TT genotype 產生一個 129 bp 片段，CC genotype 產生 107 bp 及 22 bp 兩個片段，TC genotype 產生 129 bp，107 bp 及 22 bp 三個片段。(D) -308 G/A：AA genotype 產生一個 117 bp 片段，GG genotype 產生 97 bp 及 20 bp 兩個片段，AG genotype 產生 117 bp，97 bp 及 20 bp 三個片段。(E) -238 G/A : AA genotype 產生一個 155 bp 片段，GG genotype 產生 130 bp 及 25 bp 兩個片段，AG genotype 產生 155 bp，130 bp 及 25 bp 三個片段。(F) 489 G/A： AA genotype 產生 392 bp 及 159 bp 兩個片段，GG genotype 產生 281 bp，159 bp 及 111 bp 三個片段，AG genotype 產生 392 bp，281 bp，159 bp 及 111 bp 四個片段。 25.

(39) 表八.AMD 患者與對照組個體間 TNF-α SNP genotypes 的機率分佈 TNF-α -1031. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). TT. 61(64.2%). 59(65.6%). TT vs CC：0.028. 0.492(0.410-0.590). TC. 34(35.8%). 25(27.8%). TC vs CC：0.009. 0.424(0.315-0.571). CC. 0(0%). 6(6.7%). TT vs TC,CC：0.026. TNF-α -863. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). CC. 65(68.4%). 50(55.6%). CC vsAA：0.815. 1.138(0.387-3.347). CA. 22(23.2%). 33(36.7%). CA vs AA：0.355. 0.583(0.185-1.840). AA. 8( 8.4%). 7(7.8%). AA vs CA,CC：0.129. TNF-α -857. AMD(n=94). Control(n=90). p value. OR(95% CI). TT. 1(1.1%). 1(1.1%). TT vs CC：1.0. 1.045(0.064-17.060). TC. 27(28.7%). 20(22.2%). TC vs CC：0.312. 1.411(0.723-2.757). CC. 66(70.2%). 69(76.7%. CC vs TT,TC：0.6. TNF-α -308. AMD(n=83). Control(n=88). p value. OR (95% CI). AA. 2(2.4%). 0(0.0%). AA vs GG：0.24. 2.062(1.732-2.454). AG. 16(19.3%). 19(21.6%). AG vs GG：0.768. 0.894(0.424-1.886). GG. 65(78.3%). 69(78.4%). GG vs AA,AG：0.328. TNF-α -238. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). AA. 0(0.0%). 0(0.0%). AG. 4(4.3%). 3(3.3%). GG. 89(95.7%). 87(96.7%). 1.0. 1.303(0.283-5.994). TNF-α 489. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). GG. 62(66.7%). 66(73.3%). GG vs AA：0.676. 0.626(0.101-3.875). AG. 28(30.1%). 22(24.4%). AG vs AA：1.0. 0.848(0.130-5.529). AA. 3(3.2%). 2(2.2%). AA vs AG ,CG：0.608. 26.

(40) 表九.AMD 患者與對照組個體間 TNF-α SNP Allele 的機率分佈 TNF-α -1031 C/T. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). T. 156(82.1%). 143(79.4%). C. 34(17.9%). 37(20.6%). 0.516. 0.84(0.50-1.41). TNF-α -863 A/C. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). C. 152(80.0%). 133(73.9%). A. 38(20.0%). 47(26.1%). 0.163. 0.71(0.44-1.15). TNF-α -857 C/T. AMD(n=94). Control(n=90). p value. OR(95% CI). T. 29(15.4%). 22(12.2%). C. 159(84.6%). 158(87.8%). 0.347. 0.76(0.42-1.39). TNF-α -308 G/A. AMD(n=83). Control(n=88). p value. OR (95% CI). A. 20(12.0%). 19(10.8%). G. 146(88.0%). 157(89.2%). 0.716. 0.88(0.45-1.72). TNF-α -238 A/G. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). G. 182(97.8%). 177(98.3%). A. 4(2.2%). 3(1.7%). 1.0. 1.297(0.286-5.877). TNF-α 489 A/G. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). G. 152(81.7%). 154(85.6%). A. 34(18.3%). 26(14.4%). 0.322. 1.33(0.76-2.31). TNF-α promoter 區域 -1031 T/C，-863 C/A，-857 C/T，-308 G/A，-238 G/A SNP 進行 haplotypes 的分析，在我們研究的族群中，以 TCCGG haplotype 佔最多數，其次為 CACGG，TCTGG(表十)，在 AMD 患者與對照組個體間相比較有顯著的差異(表十一)，對照組個體帶有較高比率的 TACGG haplotype(6.7% vs 1.1%，OR=6.714，95% CI=1.481~30.435，p=0.011)，而在 haplotypes/genotypes 的分析，我們發現 AMD 患者缺乏 TCCGG/TACGG genotype，與對照組個體具有顯著的差異(0.0% vs 8.9%， p=0.003)，此外 CACGG/TCCAG genotype 與對照組個體間有較弱的關連性(7.8% vs 1.1%，OR=7.928，95% CI=0.955~65.782，p=0.031)，且對照組個體也有較高比率帶. 27.

(41) 有 CACGG/CACGG genotype 的傾向(4.4 % vs 0.0%，p=0.054)(表十二)。. 表十.TNF-α promoter region：-1031，-863，-857，-308，-238 SNP，所可能組成 haplotypes 的結構及在台灣族群的比例(n=185) Haplotype -1031 -863. -857. -308. -238. Frequencies. T. C. C. G. G. 0.538462. C T C T T C T C T C T T C T C. C A A C A A C C A A C C C A A. C C C T T T C C C C T C C C C. G G G G G G A A A A A G G G G. G G G G G G G G G G G A A A A. 0.016988 0.049174 0.132110 0.112429 0.010296 0.014038 0.084705 0.002704 0.005458 0.013613 0.001087 0.008271 0.005622 0.003631 0.001409. 28.

(42) 表十一. AMD 患者與對照組個體間 TNF-α gene -1031，-863，-857，-308，-238 polymorphisms，haplotypes 的分佈 -1031/-863/-857/-308/-238 haplotypes. Control n=180. AMD n=190. p value. Odds ratio (95% CI). CACGA. 1(0.6%). 1(0.5%). 1.0. 1.056(0.066-17.008). 1.0 1.0 1.0 0.713 0.011 1.0 0.696 1.0 0.373 0.645 1.0 1.0 0.499 1.0 1.0. 0.525(0.047-5.842) 1.003(0.516-1.948) 1.157(0.660-2.028) 6.714(1.481-30.435) 1.056(0.066-17.008) 0.902(0.6000-1.357) 1.056(0.066-17.008) 0.260(0.029-2.347) 0.816(0.431-1.548) 1.056(0.066-17.008) -. TACGA CCCGA TCCAG CACGG TACGG CCCGG TCCGG CATGG TATGG TCTGG CCCGG TATGG TCCGA TACAG CCCAG. 1(0.6%) 0(0.0%) 1(0.6%) 2(1.1%) 19(10.6%) 20(10.5%) 30(16.7%) 28(14.7%) 12(6.7%) 2(1.1%) 1(0.6%) 1(0.5%) 92(51.1%) 102(53.7%) 1(0.6%) 1(0.5%) 1(0.6%) 4(2.1%) 19(10.6%) 24(12.6%) 1(0.6%) 0(0.0%) 1(0.6%) 1(0.5%) 0(0.0%) 2(1.1%) 0(0.0%) 1(0.5%) 0(0.0%) 1(0.5%). 29.

(43) 表十二. AMD 患者與對照組個體間 TNF-α gene -1031，-863，-857，-308，-238 polymorphisms，geontypes 的分佈 -1031/-863/-857/-308/-238 geontypes. Control n=90. AMD n=95. p value. Odds ratio (95% CI). CACGG/TCCAG. 7(7.8%). 1(1.1%). 0.031. 7.928(0.955-65.782). CACGG/CACGG CACGG/TATGG TACGG/TCCAG TACGG/CACGG TACGG/CATGG CCCGG/CACGG CCCGG/TCTGG TCCGG/CACGA TCCGG/TACGA TCCGG/CCCGA TCCGG/TCCAG TCCGG/TACGG TCCGG/TACGG TCCGG/TCCGG TCCGG/TCTGG TCCGG/TATGG TCTGG/TCCAG TCTGG/TCTGG TCCAG/CCCAG TCCAG/CACGA TCCAG/TCCAG CACGG/TCCGA CACGG/TACAG CACGG/TCTGG TCCGG/TCCGA TCCGG/CCCGG. 4(4.4%) 1(1.1%) 2(2.2%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 9(10.0%) 12(13.3%) 8(8.9%) 22(24.4%) 15(16.7%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%). 0(0.0%) 5(5.3%) 0(0.0%) 1(1.1%) 1(1.1%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%) 2(2.1%) 11(11.6%) 16(16.8%) 0(0.0%) 28(29.5%) 15(15.8%) 0(0.0%) 4(4.2%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 1(1.1%) 3(3.2%) 1(1.1%) 1(1.1%). 0.054 0.212 0.235 1.0 1.0 0.486 0.486 0.486 0.486 1.0 0.913 0.645 0.003 0.546 1.0 0.486 0.369 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.246 1.0 1.0. 0.202(0.023-1.766) 1.056(0.065-17.143) 1.056(0.065-17.143) 0.522(0.047-5.864) 0.848(0.334-2.155) 0.760(0.338-1.710) 0.774(0.403-1.487) 1.067(0.488-2.331) 2.067(1.781-2.4) 0.256(0.028-2.332) 1.056(0.065-17.143) -. 30.

(44) 第四節腫瘤壞死因子基因結合血管內皮生長因子基因之多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連性(Association of TNF-α gene polymorphisms combine with VEGF gene polymorphisms in AMD patients and control subjects) 因 VEGF 可誘發 retinal vascular endothelium 表現 intercellular adhesion molecular-1(ICAM-1)及調節白血球附著到內皮細胞 35，引起 leukostasis 及發炎反應，而 TNF-α 是一個多功能的 proinflammatory cytokine，會活化發炎性白血球，這些白血球則會釋放出內皮生長因子(endothelial growth factors)引發血管新生，所以加以評估 VEGF 與 TNF-α gene 相互影響對於 AMD 的相關連性，我們結合了 TNF-α haplotypes/genotypes 及 VEGF haplotypes/genotypes 的資料，發現在 55 個預測的 haplotypes 中，TNF-α haplotype：CACGG 與 VEGF haplotypes：CTGC 的結合缺乏於 AMD 患者身上，而與對照組個體有顯著的差異(0.0% vs 3.3%，p=0.013)，另外 TNF-α haplotype：TACGG 與 VEGF haplotype：CTGC 的結合，對照組個體則有較高比例的傾向(2.2% vs 0.0%，p=0.055)。在 92 個預測的 genotypes 中 TNF-α：TCCGG/TACGG 與 VEGF：CTCC/CTGC genotype 的結合，缺乏於 AMD 患者身上，而與對照組個體有顯著的差異(0.0% vs 5.6%，p=0.026)，而 TNF-α：TCCGG/CACGG 與 VEGF： CTCC/CTGC genotyp 的結合，對照組個體則有較高比例的傾向(4.4% vs 0.0%，p=0.054) (表十三) 。. 表十三. TNF-α haplotypes/genotypes 與 VEGF haplotypes/genotypes 的結合，在 55 個預測的 haplotypes 及 92 個預測的 genotypes 中，這裡只列出與 AMD 患者及對照組個體間比較有關係的組合。 TNF-α haplotype + VEGF haplotype CACGG CTGC TACGG CTGC. Control(n=180) 6(3.3%) 4(2.2%). AMD(n=190) 0(0.0%) 0(0.0%). p value 0.013 0.055. TNF-α genotype + VEGF genotype TCCGG/CACGG CTCC/CTGC TCCGG/TACGG CTCC/CTGC. Control(n=90) 4(4.4%) 5(5.6%). AMD(n=95) 0(0.0%) 0(0.0%). p value 0.054 0.026. 31.

(45) 第五節抗發炎基因，間白素-10 之基因多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連性 (Anti-inflammatory gene：interleukin-10 gene polymorphisms are associated with AMD patients and control subjects) IL-10 promoter polymorphisms -1082 A/G；-819 T/C；-592 A/C 基因型的電泳分析圖呈現於圖十三。AMD 患者與對照組個體間，genotype 與 allele 的機率分佈在兩族群中並無顯著差異(表十四；表十五)，haplotypes 的分析，在我們研究的族群中，以 ATA； ACC；GCC 佔絕多數(表十六)，在 haplotypes/genotypes 的分析中，AMD 患者與對照組個體間，仍無差異存在(表十七；表十八) 。. AG AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AA AG AA AA. IL-10 -1082 A/G. A. TT TC. TC. CC. TT TT CA CA CA AA AA CA AA CA CA AA CACCCA CA. B.. IL-10 -819 T/C. C.. IL-10 -592 A/C. 圖十三. IL-10 promoter polymorphisms.(A) -1082 A/G：AA genotype 產生一個 139 bp 片段，GG genotype 產生 106 bp 及 33 bp 兩個片段，AG genotype 產生 139 bp， 106 bp 及 33 bp 三個片段，我們研究的族群中，並沒有發現 GG genotype。(B) -819 T/C：TT genotype 產生一個 209 bp 片段，CC genotype 產生 125 bp 及 84 bp 兩個片段，TC genotype 產生 209 bp，125 bp 及 84 bp 三個片段。(C) -592 A/C： CC genotype 產生一個 412 bp 片段，AA genotype 產生 236 bp 及 176 bp 兩個片段，CA genotype 產生 412 bp，236 bp 及 176 bp 三個片段。. 32.

(46) 表十四. AMD 患者與對照組個體間 IL-10 promoter SNP genotypes 的機率分佈 IL-10 -1082. AMD(n=92). Control(n=90). p value. OR (95% CI). AA. 82(89.1%). 80(88.9%). AG. 10(10.9%). 10(11.1%). GG. 0(0.0%). 0(0.0%). 0.958. 0.976(0.385-2.470). IL-10 -592. AMD(n=94). Control(n=90). p value. OR(95% CI). CC. 5(5.3%). 5(5.6%). CC vs AA：1.0. 0.953(0.257-3.539). CA. 46(48.9%). 44(48.9%). CA vs AA：0.992. 0.997(0.550-1.807). AA. 43(45.7%). 41(45.6%). AA vs CC,CA：0.997. IL-10 -819. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). TT. 48(51.6%). 41(45.6%). TT vs CC：0.469. 0.650(0.202-2.096). TC. 36(38.7%). 44(48.9%). TC vs CC：0.183. 0.455(0.140-1.477). CC. 9( 9.7%). 5(5.6%). CC vs TT,TC：0.295. 表十五.AMD 患者與對照組個體間 IL-10 promoter SNP allele 的機率分佈 IL-10 -1082 A/G. AMD(n=92). Control(n=90). p value. OR (95% CI). G. 10(5.4%). 10(5.6 %). A. 174(94.6 %). 170(94.4 %). 0.960. 0.977(0.397-2.407). IL-10 -592 A/C. AMD(n=94). Control(n=90). p value. OR(95% CI). C. 56(29.8%). 54(30.0%). A. 132(70.2%). 126(70.0%). 0.964. 1.01(0.65-1.58). IL-10 -819 T/C. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). T. 132(71.0%). 126(70.0%). C. 54(29.0%). 54(30.0%). 0.839. 1.048(0.668-1.642). 33.

(47) 表十六.IL-10 promoter region：-1082，-819，-592 SNP，所組成 haplotypes 的結構及在台灣族群的比例(n=185) Haplotype -1082 -819 -592. Frequencies. ATC. 0.022375. ATA ACC ACA GTA GCC. 0.678569 0.225906 0.019096 0.003751 0.050292. 表十七. AMD 患者與對照組個體間 IL-10 promoter -1082，-819，-592 polymorphisms， haplotypes 的分佈 -1082/-819/-592 haplotype. Control n=180. AMD n=190. p value. Odds ratio (95% CI). ACA. 1(0.6%). 5(2.6%). 0.216. 0.207(0.024-1.787). ACC ATA AT C GCC GTC. 43(23.9%) 125(69.4%) 1(0.6%) 10(5.6%) 0(0.0%). 40(21.1%) 129(67.9%) 6(3.2%) 9(4.7%) 1(0.5%). 0.513 0.748 0.122 0.721 1.0. 1.177(0.722-1.919) 1.075(0.692-1.668) 0.171(0.020-1.437) 1.183(0.469-2.982) -. 34.

(48) 表十八.AMD 患者與對照組個體間，IL-10 gene -1082,-819,-592 polymorphism， geontypes 的分佈. -1082/-819/-592 geontypes. Control n=90. AMD n=95. p value. Odds ratio (95% CI). ACC/ACC. 2(2.2%). 4(4.2%). 0.683. 0.517(0.092-2.895). ACC/GCC ATA /ACA ATA /ACC ATA /ATA ATA /GCC ATC/ATA ACA/GCC ACC/ACA ATA/GTC. 3(3.3%) 1(1.1%) 36(40.0%) 40(44.4%) 7(7.8%) 1(1.1%) 0(0.0%) 0(0.0%) 0(0.0%). 1(1.1%) 1(1.1%) 29(30.5%) 43(45.3%) 6(6.3%) 6(6.3%) 2(2.1%) 2(2.1%) 1(1.1%). 0.358 0.212 0.177 0.911 0.697 0.119 0.498 0.498 1.0. 3.241(0.331-31.749) 0.202(0.023-1.766) 1.517(0.827-2.784) 0.967(0.542-1.727) 1.251(0.404-3.875) 0.167(0.020-1.413) -. 第六節 IL-6，IL-8，IL-1β，TGF-β1，HTRA 1，LOC387715 之基因多型性與 AMD 患者及對照組個體之關連性(IL-6，IL-8，IL-1β，TGF-β1，HTRA 1，LOC387715 gene polymorphisms are associated with AMD patients and control subjects) 我們分析了 IL-6 promoter -572 G/C；IL-8 promoter -251 A/T，IL-1β promoter -511 T/C，TGF-β1 promoter -509 C/T，HTRA1 promoter G/A(rs11200638)，LOC387715 exon 1 T/G (rs10490924) SNP 之基因多型性，其電泳分析圖呈現於圖十四。AMD 患者與對照組個體間的比較，IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C，TGF-β1 -509 C/T genotype 的機率分佈在兩族群中並無顯著差異，但 HTRA1 G/A (rs11200638)與 LOC387715 T/G (rs10490924)基因型在 AMD 患者與對照組個體間相比較有非常顯著的差異存在，AMD 患者有非常高的比率具有 HTRA1 AA 基因型(55.9% vs 25.0%，p <0.001)及 LOC387715 TT 基因型(61.2 % vs 32.1%，p <0.001) (表十九)；同樣地，IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C，TGF-β1 -509 C/T allele 的機率分佈在兩族群中也無顯著的差異存在，HTRA1 G/A (rs11200638)與 LOC387715 T/G (rs10490924) allele 在 AMD 患者與對照組個體間相比較有非常顯著的差異存在(表二十)，此外，我們也結合 HTRA1 與 LOC387715 基因型在 AMD 患者與對照組個體間相比較，同樣地，. 35.

(49) 帶有 HTRA1 AA 基因型 AMD 的患者也帶有非常高比例的 LOC387715 TT 基因型與對照組個體仍有顯著的差異(55.3% vs 19.2%，OR=0.177，95% CI=0.051~0.612， p=0.008)，我們也發現 HTRA1 A allele 與 LOC387715 T allele 具有高度的連鎖性 (linkage)(表二十一)。. 36.

(50) AA. TA TA TT TA TA TA TA. CC CG CC CG CG CC GG. A. IL-6 -572 G/C. B.. IL-8 -251 A/T. TT TT CC CC TT TC TC CT TT CC CT CT CT CC. C.. IL-1β -511 T/C. D. TGF-β1 -509 C/T TT TG GG TG TT GG. AG GG. AG AG AG AA AA. E. HTRA1 G/A (rs1120638). F. LOC387715 T/G (rs10490924). 圖十四.(A) IL-6 -572 G/C SNP：CC genotype 產生一個 296 bp 片段，GG genotype 產生 201 bp 及 95 bp 兩個片段，CG genotype 產生 296 bp，201 bp 及 95 bp 三個片段。(B) IL-8 -251 A/T SNP：TT genotype 產生一個 542 bp 片段，AA genotype 產生 449 bp 及 92 bp 兩個片段，TA genotype 產生 542 bp，449 bp 及 92 bp 三個片段。(C) IL-1β -511 T/C SNP：TT genotype 產生一個 304 bp 片段，CC genotype 產生 190 bp 及 114 bp 兩個片段，TC genotype 產生 304 bp，190 bp 及 114 bp 三個片段。(D) TGF-β1 -509 C/T SNP：CC genotype 產生一個 400 bp 片段，TT genotype 產生 202 bp 及 198 bp 兩個片段，CT genotype 產生 400 bp，202 bp 及 198 bp 三個片段(E) HTRA1 G/A (rs11200638) SNP：AA genotype 產生一個 383 bp 片段，GG genotype 產生 203 bp 及 180 bp 兩個片段；AG genotype 產生 383 bp，203 bp 及 180 bp 三個片段。LOC387715 T/G (rs10490924) SNP：TT genotype 產生 261 bp 及 37 bp 兩個片段，GG genotype 產生 190 bp，71 bp 及 37 bp 三個片段；TG genotype 產生 261 bp， 190 bp，71 bp 及 37 bp 四個片段。 37.

(51) 表十九.AMD 患者與對照組個體間 IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C， TGF-β1 -509 C/T， HTRA 1 A/G，LOC387715 T/G SNP genotype 的機率分佈 IL-6 -572. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). CC. 52(55.9%). 47(52.2%). CC vs GG：0.656. 1.328(0.380-4.637). CG. 36(38.7%). 37(41.1%). CG vs GG：0.811. 1.168(0.327-4.168). GG. 5( 5.4%). 6 (6.7%). GG vs CC,CG：0.857. IL-8 -251. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). TT. 27(28.4%). 35(38.9%). TT vs AA：0.579. 0.771(0.308-1.932). TA. 55(57.9%). 42(46.7%). TA vs AA：0.542. 1.310(0.550-3.117). AA. 13(13.7%). 13(14.4%). TT vs TA,AA：0.267. TGF-β1 -509. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). CC. 32(33.7%). 40(44.4%). CC vs TT：0.101. 0.471(0.190-1.168). CT. 46(48.4%). 40(44.4%). CT vs TT：0.387. 0.676(0.278-1.645). TT. 17(17.9%). 10 ( 11.1%). TT vs CC,CT：0.224. IL-1β -511. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). TT. 22(23.2%). 14(15.6%). TT vs CC：0.062. 2.316(0.953-5.627). TC. 54(56.8%). 48(53.3%). TC vs CC：0.156. 1.658(0.823-3.340). CC. 19(20.0%). 28(31.1%). CC vs TT,TC：0.267. HTRA1. AMD(n=93). Control(n=81). p value. OR (95% CI). AA. 52(55.9%). 17(25.0%). AA vs GG：0.036. 3.059(1.045-8.953). AG. 32(34.4%). 42(61.8%). AG vs GG：0.605. 0.762(0.271-2.139). GG. 9(9.7%). 9(13.2%). GG vs AA,AG：<0.001. LOC387715. AMD(n=85). Control(n=84). p value. OR (95% CI). TT. 52(61.2%). 27(32.1%). TT vs GG：<0.001. 4.727(2.038-10.963). TG. 22(25.9%). 30(35.7%). TG vs GG：0.194. 1.800(0.738-4.388). GG. 11(12.9%). 27(32.1%). GG vs TT,TC：<0.001. (rs11200638). (rs10490924). 38.

(52) 表二十.AMD 患者與對照組個體間 IL-6 -572 G/C，IL-8 -251 A/T，IL-1β -511 T/C， TGF-β1 -509 C/T，HTRA 1 A/G，LOC387715 T/G SNP allele 的機率分佈 IL-6 -572 G/C. AMD(n=93). Control(n=90). p value. OR (95% CI). C. 140(75.3%). 131(72.8%). G. 46(24.7%). 49(27.2%). 0.587. 0.88(0.55-1.40). IL-8 -251 A/T. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). T. 109(57.4%). 112(62.2%). A. 81(42.6%). 68(37.8%). 0.341. 1.22(0.81-1.86). TGF-β1 -509 T/C. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). C. 110(57.9%). 120(66.7%). T. 80(42.1%). 60(33.3%). 0.082. 1.46(0.95-2.22). IL-1β -511 C/T. AMD(n=95). Control(n=90). p value. OR (95% CI). T. 98(51.6%). 76(42.2%). C. 92(48.4%). 104(57.8%). 0.071. 0.69(0.46-1.03). HTRA1. AMD(n=93). Control(n=81). p value. OR (95% CI). A. 136(73.1%). 76(46.9%). G. 50(26.9%). 86(53.1%). <0.001. 3.078(1.967-4.815). LOC387715. AMD(n=85). Control(n=84). p value. OR (95% CI). T. 126(74.1%). 84(50.0%). G. 44(25.9%). 84(50.0%). <0.001. 2.864(1.812-4.525). (rs11200638). (rs10490924). 表二十一.HTRA1-LOC387715 genotype 在 78 位對照組個體與 85 位 AMD 患者的分佈 HTRA1. LOC387715. (rs11200683). (rs10490924). Controls(％). AMD(％). p value; Odds ratio(95% CI). TT. TG. GG. TT. TG. GG. TT. TG. GG. AA. 15(19.2). 1(1.3). 0. 47(55.3). 2(2.4). 0. 0.008. 0.571. 0.343. AG. 9(11.5). 28(35.9). 3(3.8). 5(5.9). 20(23.5). 3(3.5). 0.177(0.051-0.612). 0.357(0.030-4.214). 0.364(0.061-2.185). GG. 0. 0. 22(28.2). 0. 0. 8(9.4). 39.