3.跑 SDS-PAGE
3. NF-κB 和 iNOS 蛋白量之表現
NO 的生成是細胞對抗細菌、病毒、腫瘤細胞等病原體所產生發 炎反應之一。當巨噬細胞受到 cytokines、endotoxin 活化時，會誘發 iNOS 基因表現，iNOS 蛋白生成及加強 NO 產生；而 NF-κB 為轉錄因子，
已被證實可以受到 reactive oxygen 及 reactive nitrogen species 包括 NO 等 因子活化，而去調節訊息傳遞過程。
為了證實 nitric oxide（NO）和吸煙致肺病變的關聯性，我們進一 步探討 iNOS / NF-κB 蛋白量之表現。結果顯示，隨著煙霧的曝露確實 使大白鼠肺組織 iNOS / NF-κB 蛋白表現增加（Fig. 3）。特別是 NF-κB 在曝露 15 支香煙組，造成顯著的增加。因此，初步的結果顯示，香 煙煙霧中 NOx 可經由 MEKK-1, JNK / p38, NF-κB 活化 iNOS 產生 NO，
但不經由活化 Raf / MAPK 路徑。
曝露煙霧對大白鼠肺組織之 PI3-K / PKB /p-Bad 蛋白的影響 Akt/PKB 位於細胞內多條訊息傳遞路徑的分叉點，並作為由 growth factor receptor 所活化 phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3-K)所起始許 多功能的傳遞者。結果顯示，隨著煙霧的曝露確實使大白鼠肺組織 PI3-K / PKB 蛋白及其下游 Bad 磷酸化蛋白表現增加（Fig. 4）。而Akt/PKB 的活化主要是促使細胞生存，即 Anti-apoptosis。
曝露煙霧對大白鼠肺組織之 p53 / Bcl-2 / Bax / Cyt c / CPP32 蛋 白的影響
已知p53 蛋白的功能，是主要的轉錄因子，可促進一些基因的 表現，例如 GADD45、p21WAF1 cyclin G、Bax 和 mdm2，而這些基因的產 物調控細胞週期（cell cycle）及細胞凋亡（apoptosis）。根據過去研究 粒腺體在apoptosis 活化過程中扮演很重要的調節角色，包括cytochrome c 的釋放，CPP32 被活化分解極受質 PARP-γ有被切割等現象。結果 顯示，曝露煙霧使大白鼠肺組織中p53、 Bcl-2、 Bax、 Cyt c 及 CPP32 蛋白表現量增加，（Fig. 5）。
因此，結果顯示，香煙煙霧中 NOx 可經由 p53 /Bax /Cyt c / CPP32 路徑促使細胞走向凋亡（apoptosis）。
曝露煙霧對大白鼠肺組織之細胞週期相關蛋白的影響
已知cyclin E 和 cdk-2 結合形成 complex 與 cell cycle G0 / G1 進入 S phase 有關，而 cyclin D 會和 cdk-2, -4, -6 形成 complex，然後執行調控的 功能。由實驗結果發現，曝露煙霧使大白鼠肺組織中 cdk2, cdk-4 蛋白 表現量增加；而cyclin E, cyclin D1 蛋白表現則沒有影響。（Fig. 6）。
已知細胞週期的調控會透過3 個不同機制來進行，其中一個即為 CDKI / CKI 的抑制作用。過去有研究報導指出 cAMP 可以透過誘發 p27 蛋白表現而抑制細胞增殖，另外 TGF-β也可透過誘發 p27 蛋白導致
曝 露 煙 霧 對 大 白 鼠 肺 組 織 之 細 胞 內phosphotyrosine protein 蛋 白的影響
（Fig. 8a~e）是觀察曝露煙霧對促進細胞內一些 tyrosine 蛋白磷酸 化的影響。結果隨著曝露香煙數的增加，發現其中有5 個低分子量磷 酸化蛋白顯著增加，究竟是那些蛋白的磷酸化增加？需再進一步探 討。
曝露煙霧對大白鼠肺組織之 PKC /phospho-STAT1 蛋白的影響 PKC 可使下游一些不同的受質磷酸化，其中包括訊息傳遞相關 蛋白，例如 Raf-1 及一些可以調節 DNA 合成的蛋白等，也可調控 cell cycle 及 apoptosis。由實驗結果發現，曝露煙霧使大白鼠肺組織中 PKC 蛋白表現不顯著；STAT1 磷酸化蛋白則是些微增加（Fig.9）。
曝露煙霧對大白鼠肺組織之傷害
在老鼠肺組織的病理切片（Histopathological examination）於 Histo- pathological bronchioles 及 Alveolar ducts 有顯著的變化，在 terminal bronchioles 周邊區域有 lymphocyte 的浸潤（dilatation）和肺泡有廢棄腫
（emphysema）的現象。隨著曝露香煙數的增加（5, 10,15 支），lymphocyte 及 neutrophil 的聚集愈趨明顯，發炎反應也隨之增加，如箭頭所指。特 別是在曝露 15 支香煙組最為顯著，而未曝露煙霧的大白鼠肺組織其 相同區域，則沒有顯著改變。（Fig. 10）。
所以，曝露煙霧所造成的淋巴球浸潤、廢氣腫、發炎、周邊支氣
參、討論
從 以 上 數 據 顯 示 ， 香 煙 煙 霧 造 成 肺 鼠 組 織 發 炎 、 增 生
（hyperplasia），此種作用，可能是煙霧中成份所致，其成份中 NOx 含 量大於1000 ppm，其中 NO 可與 superoxide 產生 peroxynitrite 攻擊 DNA，
本研究證實其 DNA adduct 為 8-NO2-G；另一產生過氧化傷害及 DNA damage 的原因為 cigarette smoke 活化 pulmonary alveolar marcrophages
（PAM），產生 superoxide 及 hydroxy radical 直接作用於 DNA，產生 8-OH-dG；煙霧中 NO 可氧化為 NO2，再與 hydrogen peroxide 作用為 hydrogen radical 或 superoxide 等。氧化性傷害（oxidative stress damage）
造成damage，過去一直以 8-OH-dG 為指標，但對於 NOx 或 NO 造成之 氧化壓力對 DNA 沒有特異性，而 8-NO2-G 可能是 NO 或 NOx 攻擊 DNA 之 specific adduct。
我們實驗室先前證實 NOx 氣體可直接攻擊 DNA，其產物 8-NO2-G 可做為specific marker（30）。而在本實驗中，證實煙霧中的成分也能促 使大白鼠肺組織中 MAPK kinase（Tyrosine kinase、MEKK-1、p38）蛋白 或磷酸化蛋白活性的增加，也是經由 iNOS 的活化，進而啟動細胞核 中轉錄因子 NF-κB translocation 到細胞核中，類似的結果也發現 ATF-2 蛋白磷酸化的表現增加，且隨煙霧曝露量的增加而增加，這可能是造 成細胞增生作用（hyperplasia）的原因。此種增生作用，可能也促進 癌化之作用；而 cytoplasmic transcription factor--STAT1（Signal Transducers
發細胞增生、阻斷細胞分化、防止細胞凋亡，使得maligant transformation 及 turmorigenesis（77）。Kleinert 等人的研究指出在人類 DLD 細胞，IFN-r 活化STAT1 是促使 iNOS 表現的重要因子，而 AP-1 似乎是扮演富調節 的角色，NF-κB 則是維持 iNOS promoter 的 basal activity 所必需（78）。
曝露煙霧也能使大白鼠肺組織中 STAT1 蛋白磷酸化增加，但其活化 STAT1 之機制還殆盡一步研究。除此，對於 Raf/ MEK1 路徑則無影響。
許多研究顯示 PI3-kinase/ Akt 這個訊息傳遞路徑是 Anti-apoptosis
（84），Akt 會造成 Bad 的 phosphorylation（85），經由恩 PI3-kinase 直接 傳遞到 Akt 這個路徑核細胞的生存有關。在我們的結果顯示，煙霧可 使大白鼠肺組織中 PI3-kinase/ Akt 蛋白及 Bad 磷酸化蛋白增加，可能引 起肺組織持續發炎（inflammation），誘發細胞增生（hyperplasia），並可 防止細胞凋謝死亡（Apoptosis），最終促使細胞癌化。由過去的研究得 之癌症和細胞週期的調控有密切關係（86）。許多研究也提出在腫瘤 細胞中，G1 cyclin（cyclin D/E）常有過度表現的情形（87-90）。而 Hass 及 Ito 等也發現 CDK2 和 CDK4 的活性會影響細胞週期的變化，和癌症 的形成有關（87, 91）由這些研究報告知道，調節細胞週期的蛋白，
如果過度表現，會導致細胞週期縮短，讓細胞過度增生，產生癌化。
又有文獻指出以抗癌藥物處理癌細胞株可使cyclin 及 CDK 裂解或是增 加 CDK/ CKI(cyclin dependent kinase inhibitor)的表現，改變其生長週期，
進而達到抑制腫瘤細胞的增生。G1 cyclin 是否具有磷酸化 Rb 的能力跟 CDKI 緊密關聯（92）。
使 p53 累積（94）；我們實驗室之前也證實曝露氣體 NO 的確會促使人 類肺纖維細胞（MRC5）之 p53 累積，增加磷酸化現象。而煙霧的曝 露也能使大白鼠肺組織中 p53 蛋白增加，並使 p53 活化去當一個轉錄 因子，進而活化下游一些目標元素（target element），像 Bax 促使 cytochrom c（cyt c）從粒腺體釋放至 cytosol 中，進而活化 CPP32 蛋白，
導致細胞走向 apoptosis。
有趣的是，曝露煙霧使大白鼠肺組織內一些蛋白的磷酸化，從 Fig 9 結果顯示，有五個位置的低分子量蛋白，分別是 20, 29, 36, 52,82 Kda，其磷酸化非常明顯，仍有待進一步研究。在本篇實驗中某些蛋 白（iNOS, Cyt c, p53, PI3-K, PKB..），在曝露 5, 10, 15 支香煙後，15 支（重 度）曝露組，蛋白表現量有下降的趨勢。這可解釋，當大白鼠曝露煙 霧，使 DNA 受到 damage 會透過一連串訊息傳遞將訊息由細胞外傳遞 到細胞核，可能造成細胞增生、發炎或分化然而當重度曝露時，可能 促使cell 生長停止或走向 apoptosis，蛋白的表現可能就下降了。
在動物模式中，曝露煙霧能夠使大白鼠之訊息傳遞相關蛋白活化 其傳遞路徑是複雜且龐大的（如 summary），此作用可能為香煙致肺 病變之重要角色。