Recombination mouse SDF-1a/CXCL12 配製方法

將 Recombination mouse SDF-1a/CXCL12(生工, Taiwan)加入含 有 0.1% BSA 的 PBS 中配製濃度為 1ng/µl 備用。

3、平滑肌細胞的培養

血管平滑肌細胞株（購自食品工業發展研究所，Cell no.:

60127，代號 A10）來自胎鼠胸主動脈(the thoracic aorta of DB1X embryonic rat)，多應用於血管平滑肌(vascular smooth muscle cells;

VSMCs)實驗模型。

將含有10% FBS 的DMEM培養基（含3.7g/ l NaHCO3, 4.5g/l D-Glucose, 1.028g/l N-Acetyl L-alanyl-L-glutamine, 1% Na-Pyruvate, 100 units/ml penicillin G及100 ug/ml streptomycin sulfate, 1%HEPES Buffer Solution）在37℃之水浴恆溫槽中加溫。將儲存在液態氮桶中大鼠主

動脈平滑肌細胞取出，檢查蓋子是否旋緊，因為熱脹冷縮過程中，

蓋子容易鬆脫，並插入浮板迅速放入37℃水浴中使其快速解凍，將 解凍後之冷凍小管用70%酒精擦拭， 移入無菌操作台內，以1 ml pipette將解凍之細胞懸浮液吸出放入10公分培養皿，並加入約10 ml 含10 %胎牛血清之培養基，混合均勻後放入細胞培養箱(37 ℃、95％

O2、5 ％CO2) 中進行培養，每二天換一次培養基。

次培養

當細胞長約九成滿時，用 9 吋滴管接抽氣幫浦移除培養皿中的 培養基，用 10 ml pipette 吸取 7 ml 1X PBS 緩衝液(pH:7.4)至培養皿 中並稍微搖晃後再以 9 吋滴管抽去，重複此步驟二次以維持培養皿 中為中性環境，接著以 1 ml pipette 吸取 1 ml Trypsin- EDTA (吸取的 量以蓋過培養皿表面為原則) 加到培養皿中，再放入細胞培養箱 3 分鐘，之後加入 1 ml 10% FBS- DMEM 2 ml 中和 Trypsin-EDTA 作 用,以抽吸方式將細胞沖散，盡量使細胞呈單顆懸浮，將培養皿液體 吸換至離心管後加入 10 % FBS- DMEM 共 10 ml ，離心 1500 rpm，

5分鐘，以 haemocytometer 計算細胞數後進行日常分盤或實驗用分 盤。

4、利用 haemocytometer 來計數細胞數目

將10 公分培養皿內之培養液吸去，以約7 ml 的1x PBS 緩衝液 (pH=7.4)清洗細胞兩次後加入約1 ml 的1x trypsin-EDTA 置入培養箱 內，待3分鐘後取出。加入2 ml 的培養液中和 trypsin-EDTA 活性，並 用1 ml 的pipette 以緩慢來回抽吸方式將細胞打散，將培養皿液體吸 換至15ml離心管後加入10 % FBS-DMEM共10 ml ，取出100 µl 細胞 懸浮液和10 µl typan-blue，在96-well內混合均勻，共取2次。分別從 混合液中各取出10 µl 的細胞懸浮液放在細胞計數盤

(haemocytometer)上下兩個凹槽上，利用蓋上蓋玻片時的虹吸作用將 細胞均勻平均分散於細胞計數區域。在顯微鏡放大100倍下以計數器 計算在haemocytometer 九大格中的左上，左下，右上，右下及中間 格的細胞數總合，除以5 （等於每一大格的平均細胞數），再乘以 10⁴（haemocytometer中的一大格體積是1×10^-4 ml），再乘上1.1（稀 釋倍數）x10（細胞懸浮液總量）x 10⁴ 即可得10 ml細胞總數目 (cells/10ml)。

細胞計數盤與細胞計數區域放大簡圖。

1 3

4 5

5、細胞週期同步化(synchronize)

將細胞分到實驗適合之dish或plates後(例如：6cm dish 細胞數目 約3.5 x10⁵ cells/ well)，加入含10 % 胎牛血清的培養液2 ml培養細 胞，並於放入培養箱前稍微搖晃使細胞分佈均勻。待12∼24 小時細 胞適應環境並貼覆上 plates 穩定後吸去培養廢液，再以1XPBS緩衝 液2 ml/well 小心清洗2 次，最後加入2 ml/well 的0 %胎牛血清培養 液，經24小時後即完成細胞同步化步驟。

6、細胞蛋白質抽取

將培養於 6 cm dish 的細胞取出，加入 5 ml 1x PBS 緩衝液沖洗 2次，加入 200 µl 的 Lysis buffer 反應 3 分鐘，使用細胞刮杓將細胞 刮下並將細胞液體收集至微量離心管放入乾浴加溫器內加溫

（95℃、5 分鐘），隨即放置於冰上 30 秒以上，4℃離心（13000 rpm、10 分鐘），取上清液，進行蛋白質定量或冰存於-20℃。

◎ Lysis buffer配製方法

組成 最終濃度 最初濃度 體積 / 重量

Tris-Hcl（PH:6.8） 6.25M 0.5M 6.25ml

SDS 2% 10% 10ml

DTT 50mM 0.3M 8.34ml

DDW － － 25.41ml

總體積 50ml

* Lysis buffer 需4℃避光存放，並且在使用前需待完全溶解。

(SDS在低溫時會結晶析出)

7、蛋白質定量

(1)原理 : 以胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin; BSA)為蛋白質標 準品，確定蛋白質的體積濃度，並使其均一化，以利實驗之進行。

蛋白質檢量線製作，依照下面表格製作蛋白質標準品樣品：

組成 0 5 10 15 20 25

0.1mg/ml BSA (µl) 0 50 100 150 200 250

DDW(µl) 800 750 700 650 600 550

Baradford（µl） 200

總體積（µ l） 1000

Bradford 為蛋白質染劑，具有毒性，使用時需戴手套。加入染劑混 合均勻後需反應5分鐘後，利用酵素免疫分析儀(ELISA reader)在 O.D. 590nm 測定各蛋白質標準品吸光值之平均值。吸光值測定時每 個樣本數需3重複，使其數值穩定。以測定出來的標準品吸光質與蛋 白質濃度畫出檢量線，並求出趨勢線方程式即R²值。R²值需 >0.99以 上的準確度。

使用 Excel 軟體會出蛋白質檢量線算出趨勢線方程式，經帶入 測得之吸光值(y)，則可求出蛋白質濃度(µg/ml)。

(2)樣品蛋白質濃度測定

蛋白質濃度 (ug/ml)

取10µl 的蛋白質樣品與790µl 的二次水混合，再加入200µl的 Bradford 染劑，混勻5 分鐘後以每個樣品放在3 個wells 的方式依序 放入96 孔細胞培養盤中，利用酵素免疫分析儀在O.D.590 nm 測定 其吸光值平均值。將樣品吸光值平均值代入趨勢線方程式，則可算 出稀釋後樣品之蛋白質濃度，最後再乘上稀釋倍數，則可求得實際 蛋白質樣品濃度。

8、蛋白質電泳（SDS-PAGE）

依照下列配方先配製下層膠和上層膠：

下層膠(10%Separation gel) 上層膠(5% Stacking gel)

組成 一片量 兩片量 一片量 兩片量

DDW 4.75 ml 9.5 ml 3.04 ml 6.08 ml

1.5M Tris(PH:8.8) 2.5 ml 5.0 ml － －

0.5M Tris(PH:6.8) － － 1.25 ml 2.5ml

10%SDS 100 µl 200 µl 50µl 100 µl

40%Acrylamide/bis

(29:1) 2.5 ml 5.0 ml 610 µl 1.22 ml

10%APS 50 µl 100 µl 50 µl 100µl

TEMED 10 µl 20 µl 6 µl 12 µl

下層膠注入造膠檯內約八分滿，剩餘的空間先用 75% 酒精填滿去除 上面的氣泡並壓平膠之上緣，等待凝固約 30 分鐘，造上層膠 ， TEMED 則須等下層膠凝固後將 75% 酒精倒出後加入，下層膠凝固 後，注入上層膠，插入 comb 等待凝固約 30 分鐘將 comb 取出後先

用 DDW 清洗 well，將膠檯放入電泳槽內裝滿 Running buffer，將 loading sample 先加熱（95℃、5 分鐘）立即放置於冰上冷卻 30 秒以 上， 將 Marker（ 5∼10µl） 和 sample（18∼24 µl）loading 到 well 內 ， 利 用 100V 跑 電 泳 約 2 個 半 小 時 ， 取 出 下 層 膠 放 入 0.1 % Commassie blue 進行蛋白質染色，或準備進行蛋白質轉漬至 PVDF 膜 Western Blot步驟。

9、西方墨點法（Western blot）

準備用物－PVDF membrane 需先用 Methanol潤濕 30 秒，將下 層膠自水龍頭下取去下，並將膠體放至轉漬夾上其順序如下：

PVDF membrane 膠體(gel) Filter paper

海綿 黑底網夾

鐘，共 3 次後進行暗房底片顯影。

◎ 暗房底片顯影（壓片）

準備用物：1 ml Pipet、1 ml tip、cassette、鑷子、感光底片、剪刀、

透明膠片、ECL、Developer、Fixer， 並將 membrane 浸泡於 ECL（比 例為 1:1）混合液中約 30 秒，將 membrane（正面朝上）放置於透明 膠固定好，剪適當大小的底片，進行曝光。（依 membrane 上冷光亮 度決定曝光時間，數秒至 1 小時），曝光後用顯影劑及定影劑洗底 片，後將底片風乾保存並進行分析。

◎Membrane 保存

將壓片後的 membrane 以 0.1% PBST 10 分鐘 3 次，放入含 0.1%

PBST的密封袋4℃保存。（可保存 2 星期）

◎ Commassie Blue染色

gel 先以 DDW 清洗 15 分鐘，共 3 次，加入適當的 Commassie Blue 反應 20 分鐘，加入 destain buffer 搖盪至清楚呈現 band。

◎ Comassie Brilliant Blue R-250泡製方法

組成 最終濃度 最初濃度 體積 / 重量

Comassie Brilliant Blue － － 0.25g

Methanol － 100% 45ml

Acetic acid － 100% 10ml

DDW － － 45ml

總體積 100ml

◎ Destain buffer 泡製方法

組成 最終濃度 最初濃度 體積 /重量

Methanol 10% 100% 100ml

Acetic acid － 100% 70ml

DDW － － 830ml

總體積 1000ml

10、MTT assay

主 要 是 依 賴 粒 線 體 中 琥 珀 酸 去 氫 脢 的 作 用 將 MTT 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 的 tetrazolium 轉變為藍色產物 MTT formazan。MTT 轉變僅在活細胞中進行，並堆 積在細胞內 ，且 formazan 形成量與細胞數目呈正比 ，加 入 10 % SDS-Hcl 溶解後，可以由波長約 590nm 知吸光測量並定量。由於細 胞還原 MTT 的能力代表細胞粒線體的活性，因此可以做為細胞存 活率的一個指標。【MTT 保存方法：避光，冷藏於 2∼8℃。】

◎方法步驟

將細胞分盤至平面 96 well 培養，種植細胞數約 1×10⁴/well，以 10% FBS-DMEM 100µl 飼養 24 小時後，以 1 x PBS（PH:7.4）100 µl 沖洗 1~2 次，加入 0﹪FBS-DMEM 100µl同步化 24 小時，加入含不 同濃度 SDF-1a 的 0.5% FBS-DMEM 100 µl及 salivanolic acid B、

magnolol 的 15% FBS-DMEM 100 µl 或是含 SDF-1a10µg、及 0.075mg/

ml的 salivanolic acid B 和 magnolol 的 0.5% FBS-DMEM 100 µl培養 至時間點加入濃度 5 mg /ml 的 MTT 佔 D100 µl MEM 量的 l/10，培 養 4 小時後再加入 100 µl 10﹪SDS-Hcl （終止反應）隔天測吸光值 OD590 nm。

◎MTT 溶液的配製 ﹙避光4℃儲存﹚

組成 最終濃度 初濃度 體積/重量

MTT 5 mg/ml -- 250 mg

PBS(pH7.4) -- -- 50 ml

總體積 50 ml

Solubilization solution 配製﹙室溫儲存﹚

組成 最終濃度 初濃度 體積/重量

SDS 10% － 10 g

Hcl 0.01M 1M 1 ml

總體積 100 ml

11、Wound assay

將 2.5×10⁴的平滑肌細胞種至 24 well 培養盤的每一個 well 中，

培養 24 小時，加入 0% FBS-DMEM 同步化 24 小時，移去培養基，

以 1X PBS (pH7.4) 1ml沖洗一次後，用 200µl tip 輕劃一道缺口於含 有平滑肌細胞貼附的 well 上，並用光學顯微鏡( Motic, Japan)拍照，

加入 SDF-1a10 ng/ml 及 SDF-1a10 ng/ml 加丹參 Salvianolic acid B 抽

取物 0.075mg/ml 及厚朴 magnolol 抽取物 0.075mg/ml，培養不同時 間點，並於 24 小時、48 小時用光學顯微鏡拍下並觀察細胞遷移的情 形。

12、評估丹參、厚朴抽取物對 NF?B promoter 轉殖至血管平滑肌細 胞的表現情形

採用 Promega 的 TransFast^TM transfection reagent試劑（屬於微脂 體）。將 3.5×10⁵的平滑肌細胞種至 6 well 培養盤的每一個 well，培 養 24 小時。準備 6 薄壁微量管，6 管包含 3µl TransFast^TM transfection reagent ＋ 997µl 0% FBS-DMEM ， 另 外 12 管 含 3µl TransFast^TM transfection reagent ＋ 0.5µl (3.88µg) NF-?B promoter-Luciferase Construc^t＋ 1.5µl(2.6µg) ß-galactosidase Construc^t＋ 995µ 0% FBS-DMEM，個別混合均勻並於室溫下作用 15 分鐘即成 lipid-DNA 複合 物。移去培養盤中的培養基，以 1 x PBS（pH:7.4）1ml 沖洗 2 次，加 入剛才的 lipid-DNA 複合物培養 1~3 小時後，加入 10％ FBS-DMEM 繼續培養 24 小時後，用 0% FBS-DMEM 同步化 24 小時。接著給予 SDF-1a10 ng/ml及 SDF-1a10 ng/ml 加丹參 Salvianolic acid B 抽取物 0.075mg/ml及厚朴 magnolol 抽取物 0.075mg/ml，培養 24 小時。用 1X reporter lysis buffer 將細胞的蛋白質抽出來。使用 Promega 的

ß-galactosidase Enzyme assay system來測定 ß-galactosidase 的量來確定 轉殖的效率並當作 internal control。取 50µl 的蛋白質和 50µl 的 2X assay buffer加入 96 well 孔盤中混和均勻，放入培養相中培養 4 小時 後加入 150µl 的 1M sodium bicarbonate 混勻，測吸光值 OD450 nm，

並 計 算 ß-galactosidase 的 含 量 。 使 用 Promega 的 Dual-Luciferase reporter assay system來測定 luciferase 表現量，取 20µl的蛋白質，在 上 冷 光 分 析 儀 前 才 加 入 100ul luciferase reagent （ 每 一 管 加 入 luciferase reagent與上機的間隔時間盡量一致）測定 luciferase 的含 量。

13、利用 DNA 電泳法來檢測 salivanolic acid B、Magnolol 對 SDF-1a 處理後的血管平滑肌細胞引起細胞凋亡的情形

將 8 ×10⁶的平滑肌細胞種至 10cm 培養盤，培養 24 小時後，加 入 0% FBS-DMEM 同步化 24 小時。接著給予 SDF-1a10 ng/ml 及 SDF-1a10 ng/ml加丹參( Salvianolic acid B )抽取物 0.075mg/ml 及厚 朴( Magnolol )抽取物 0.075mg/ml，培養 48 小時後，使用冷泉港

（豐記）的 GINOME DNA kit 來進行 DNA 的抽取。將將細胞從培養 皿收到 15ml 試管中，加入 1.85 ml 的 cell suspension solution、50µl RNase MIX、100µl cell lysis/denaturing solution 於55℃水浴槽中加熱

30分鐘，接著加入 25µl的 protease Mix 於55℃水浴槽中加熱 1 小時 後，加入 500µl 的 salt out mixture 輕輕混勻，10,000xg 離心 10 分鐘 後取上清液並加入 2ml 的 TE buffer 和 8 ml 的 ethanol absolute 1,000 離心 10 分鐘，倒掉上清液風乾後，加入 40~90µl的 TE buffer( TE buffer中所含即為 DNA)。

30分鐘，接著加入 25µl的 protease Mix 於55℃水浴槽中加熱 1 小時 後，加入 500µl 的 salt out mixture 輕輕混勻，10,000xg 離心 10 分鐘 後取上清液並加入 2ml 的 TE buffer 和 8 ml 的 ethanol absolute 1,000 離心 10 分鐘，倒掉上清液風乾後，加入 40~90µl的 TE buffer( TE buffer中所含即為 DNA)。