丹參酚酸B及厚朴酚抑制由SDF-1α所引起之血管平滑肌細胞增生及遷移作用; Salvianolic acid B and magnolol inhibit vascular smooth muscle cell proliferation and migration by stromal cell-derived factor -1α
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(2) 第三章、實驗結果…………………………………………………… .. 56 第四章、討論………………………………………………………… .. 66 第五章、結論………………………………………………………… .. 72 第六章、參考文獻……………………………………………..… … … 73. 中文摘要 動脈粥狀硬化是一個複雜的疾病過程，與單核白血球和淋巴球由血 液進入並聚集至動脈內膜中相關 。近年來許多研究發現在 Apolipoprotein E 缺乏的小鼠在其血管損傷後 ，Stromal cell-derived factor-1alpha 及其專一性的接受器 CXCR4 在構成血管內膜新生中有 著非常重要的角色。在此篇論文中，我們使用兩種可以顯著的抑制 由中草藥粹取物：丹參酚酸 B 及厚朴酚來觀察其抑制老鼠血管平滑 肌細胞的增生、CXCR4、細胞遷移及相關的訊息分子路徑的表現。 結果發現丹參酚酸 B 及厚朴酚 SDF-1a 所引起的血管平滑肌細胞的 增生以及顯著抑制細胞的遷移。而在細胞凋亡方面，丹參酚酸 B 及 厚朴酚可以誘導細胞的凋亡，最主要是透過 caspase3 蛋白質表現增 加以及 Bcl-2 蛋白質表現量減少所引起的。因此，丹參酚酸 B 及厚朴 酚具有抑制細胞增生及遷移的效果，也許可以用來預防粥狀動脈硬 化及氣球擴張後的再阻塞。. 英文摘要 Atherosclerosis is a d isease with complex processes in which 2.
(3) monocytes and lymphocytes are recruited form the blood into the arterial intima. Stromal cell-derived factor-1alpha (SDF-1alpha) and its unique receptor, CXCR4, have been recently implicated in the development of neoitimal formation after vascular injury in apolipoprotein E-deficient mice. In the present study we investigated two Chinese herbal extracts, salvianolic acid B and magnolol, about their inhibitory effects on rat vascular smooth muscle cells (VSMCs) for cells proliferation, CXCR4 expression, cellular migration and its related signal pathway. Our results demonstrated that SDF-1alpha-induced cell proliferation can be significantly inhibited by salvianolic acid B and magnolol. Cell migration potentiated by SDF-1alpha was also attenuated by salvianolic acid B and magnolol. In the aspect of apoptosis, salvianolic acid B and magnolol can induce VSMCs apoptosis via cpspase 3 or upregulation Bcl-2 downregulation expression. In summary, considering their effects on cell proliferation and migration, salvianolic acid B and magnolol may play an important role in preventing atherosclerosis and balloon injuryinduced neoitimal formation.. Key word: Vascular smooth muscle cell, Salvianolic acid B, Magnolol, Atherosclerosis. 圖目錄. 3.
(4) 圖 1、正常動脈血管壁的構造……………………………………..… 10 圖 2、粥狀動脈硬化形成圖……………………………………… ..… ..13 圖 3、粥狀動脈硬化形成過程圖………………………………..… … … 13 圖 4、趨化因子及其接受器之介紹……………………………..… … … 16 圖 5、血管新生之步驟…………………………………………………18 圖 6、發炎反應中化學趨化因子扮演的角色………………….… … … 19 圖 7 SDF-1a 與 CXCR4 receptor 訊息傳遞………………… .… … … … 20 圖 8 MAPK 訊息傳遞途徑…………………………… ..… … … … … … 21 圖 9 細胞週期及其控制蛋白…………………………...… … … … … … 23 圖 10 由 death receptor 活化細胞凋亡的路徑…………………………28 圖 11、以 MTT 方式評估 SDF-1a 對平滑肌細胞的影………………81 圖 12、以 MTT 方式評估 DMSO 對平滑肌細胞毒性之影響………… ……………………………………..… … … … … 82 圖 13、以 MTT 方式評估 salvianolic acid B 抑制由高濃度血清刺激平 滑肌細胞增生影響……………………………………… ..… … … 83 4.
(5) 圖 14、以 MTT 方式評估 magnolol 抑制由高濃度血清刺激平滑肌細 胞增生之影響……………………………………………..… … … … 84 圖 15、以 MTT 方式評估 salvianolic acid B、magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激平滑肌細胞增生之影響…………………………… ..… … 85 圖 16、觀察 salvianolic acid B、magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激平滑肌細 胞增生 24 小時後之影響…………………………….… … … … 86 圖 17、以二維電泳觀察氣球擴張後老鼠血液中蛋白質改變情形…… ……………………………………………………… ......87 圖 18、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞 CXCR4 之影響………….… … … 88 圖 19、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞 Raf-1 之影響……………..… … 89 圖 20、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞 MEK 之影響…………..… … … 90 圖 21、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞 Erk 1/2 之影響…………...… … 91 圖 22、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞立即性早期磷酸化 Erk 1/2 之影 5.
(6) 響………………………………………………………… ...… … 92 圖 23、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞 FAK 之影響……………… ...… 93 圖 24、觀察在不同時間點 salvianolic acid B 、magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激平滑肌細胞遷移之影響…………………………..… … 94 圖 25、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞 JNK 之影響………………..… 95 圖 26、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞磷酸化 JNK 之影響……..… .… 96 圖 27 、 Salvianolic acid B 和 magmolol 對 由 SDF-1a 刺 激 NF-?B promoter 活性之影響…………………………………...… … … 97 圖 28、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞磷酸化 caspase-3 之影響.… … 98 圖 29、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞磷酸化 Bax 之影響……..… … .99 圖 30、以西方墨點轉漬法觀察 salvianolic acid B 和 Magnolol 抑制由. 6.
(7) SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞磷酸化 Bcl-2 之影響………… 100 圖 31、觀察 salvianolic acid B 和 magnolol 誘導平滑肌細胞 DNA 斷裂 的情形……………………………………………… .… … ...… 101. 英文縮寫 SDF-1alpha: Stromal cell-derived factor-1alpha VSMCs: vascular smooth muscle cells Sal. B: salvianolic acid B Mag.: magnolol LDL: Low density lipoprotein ox-LDL: oxidization low density lipoprotein ROS: reactive oxygen species MCP-1: monocyte chemotactic protein ICAM-1: Intercellular adhesion molecule-1 VCAM-1: vascullar cell adhesion molecule-1 TNF: Tumor Necrosis Factor M-CSF: marophage colony-stimulating factor MAPK: mitogen-activated protein kinase 7.
(8) FAK: focal adhesion kinase ERK 1/2: extracellular-signal regulated kinases JAK: Janus kinase signal Bcl-2: B cell lymphoma protein 2. 第一章、前言 粥狀動脈硬化是脂質與發炎細胞的聚積，伴隨著平滑肌細胞 （smooth muscle cell, SMC ）增生與細胞外間質液分泌（extracellular matrix secretion）所引起的細胞內膜纖維變性（intimal fibrosis ）的 過程，最主要的特徵是動脈壁增厚、變硬或失去彈性的的病理變 化，在許多已開發的國家中因為引起高度的心肌梗塞、中風及周邊 動脈疾病的致病率而成為主要的致死原因。 依據行政院衛生署公佈民國九十二年十大死因，腦血管與心臟 疾病僅次於惡性腫瘤之後，分別位居於第二及第三名【1】，不但對 個人造成生命財產上損害，亦會耗費許多的醫療資源及社會成本。 因此，目前對於心血管疾病的預防與治療方法的改進和研發，是一 個急需解決及研究的議題。. 8.
(9) 第一節、粥狀動脈形成之介紹 ) 2,3】: 首先先介紹正常的動脈血管壁，其由內而外可分為(圖 1 【 (1). 血管內皮細胞層(endothelial cells): 由一層單層扁平細胞所構組成，主要與血液接觸的細胞層，能接 受 外界環境的刺激，亦容易受到細胞激素 (cytokines)的刺激而表現 黏著因子(adhesion moleculars) 。在單核球細胞(monocytes)進入血 管壁的過程扮演相當重要的調控角色。 (2). 血管壁內層 (intima): 含有豐富的膠原纖維與彈性纖維 (internal elastic lamina)，其中的 內皮細胞下腔間隙(subendothelial matrix) 是血管壁中反應最複雜的 一層空間。進入此空間的低密度脂蛋白 ( Low density lipoprotein, LDL)易受到活化態氧(reactive oxygen species ，ROS)攻擊而形成氧 化態的低密度脂蛋白；且進入內皮細胞下腔間隙的單核球在受到 細胞激素的刺激而轉形為巨噬細胞( macrophage) 。 (3). 血管壁中層 (media): 為平滑肌細胞 (smooth muscle cells ， SMC)層，主要負責動脈血管 的收縮與彈性，是血管管壁中體積比例最大的一層。 (4). 血管壁外層 (adventitia): 9.
(10) 由結締組織 (connective tissue) 所組成，包含了提供血管營養的滋 養管(vasa vasorumvi)。. 圖 1、正常動脈血管壁的構造 (Lusis Aldons J. 2000; Nature). 10.
(11) 而粥狀動脈硬化形成的機制，主要包括四個階段【2,4】，分別為 (1) 內皮細胞層的功能不良（endothelial dysfunction）【5,6,7】、(2) 脂肪 條的形成（fatty-streak fomation）、(3) 壞死中心與纖維帽（necrotic core and Fibrous-cap ）的形成以及(4) 不穩定的纖維斑塊（unstable fibrous plaques ）。此四個階段都是影響粥動脈硬化疾病嚴重度的重 要的因數。因此以下分別介紹各階段：(圖 2,圖 3) 1、內皮細胞層的功能不良（endothelial dysfunction） 為早期粥狀動脈硬化形成的原因，主要是因為血管分支或轉彎的地 方，較易為血流速度、壓力或是所產生的擾流影響，使內皮細胞物 理因素改變，發炎細胞【4,6】的黏著堆積而釋放出趨化因子，導致細 胞通透性增加；加上血液中過多的脂蛋白 ( 例如：低密度脂蛋白； LDL)，經由血液動力學的影響，被動的經由通透性增加的內皮細胞 間隙，穿過血管內皮細胞層，而進入到血管內膜中。這些進入血管 壁中的 LDL 會與結構性蛋白相黏合，且極易受到血管內皮細胞所釋 放之活性氧與 12-LO (12/15lipoxygenase) 攻擊，而氧化為氧化態的 低密度脂蛋白（ oxidization low density lipoprotein, ox-LDL）【8】。 2、脂肪條的形成（fatty-streak formation）. 11.
(12) 在動脈硬化的第二個階段中，被自由基攻擊的低密度脂蛋白氧化為 氧化態的低密度脂蛋白（ox-LDL ），而ox-LDL會刺激血管內皮細 胞產生許多的黏附趨化因數，例如MCP-1(monocyte chemotactic protein) 、 ICAM-1（Intercellular adhesion molecule-1），VCAM-1 （vascullar cell adhesion molecule-1）與E-selectin等，同時ox-LDL亦 會吸引血液中的單核球細胞 (monocyte)向內皮的表面黏附而進入血 管內皮細胞下層（subendothelial），一方面分泌細胞激素 (cytokines)，如Interlukin-1(IL-1)，Interlukin-4(IL-4) ，interfiron-? (干 擾素-?；IFN-?)，Tumor Necrosis Factor (TNF)進行發炎反應【6,9】； 另一方面則是接著受到血管內皮細胞所釋放的M-CSF（marophage colony-stimulating factor）分化為巨噬細胞。這些存在於血管壁中的 巨噬細胞表面具有清道夫受體（scavenger receptor），對於ox-LDL 具有極高的親合力，形成一含巨噬細胞之泡沫細胞(macrophage foam cell) 也稱為”泡沫細胞”。此時平滑肌細胞會受到泡沫細胞的 刺激，穿過彈性纖維層進入內膜增生，然後泡沫細胞及平滑細胞， 則由內層移位至內膜增生形成脂肪線（Fatty-streak ）【3,7】。 三、壞死中心及纖維帽的形成（necrotic core and Fibrous-cap） 第三階段是因為巨噬細胞不斷的吞噬 ox-LDL，產生大量的泡沫細 胞，極易堆積在血管壁並且死亡 【3,7】。並藉由 Interferon 的作用，使 12.
(13) 細胞走向凋亡，再與其他脂質碎片形成一個壞死中心（necrotic core）。血管壁中層膠原蛋白與平滑肌細胞過度增生，遷移至血管內 膜層形成纖維帽（Fibrous-cap ），其功能在於隔開血管腔以及受損 區域。 四、不穩定的纖維硬斑（unstable fibrous plaques） 動脈硬化最後一個階段中，血管壁會形成動脈硬化斑塊。動脈硬化 斑塊是由平滑肌、泡沫細胞、低密度脂蛋白及其他脂質所組成，也可 以稱為粥狀動脈腫(atheroma)。此時血管的管腔會因為硬化斑塊的產 生而狹窄，持續擠入活化的巨噬細胞會釋放出分解蛋白的酵素，這 些酵素會分解基質，使原本覆蓋於壞死中心上的平滑肌細胞亦受到 刺激進行凋亡之機制【3,7】。而此機制結果會導致斑塊不穩定，甚至 於破裂，增加粥狀動脈疾病之嚴重度。 Stage I. Endothelial dysfunction. Stage II. Fatty streak formation. Stage III. Formation of an advanced and complicated lesion. Stage IV. Unstable fibrous plaques. 13.
(14) 圖 2、粥狀動脈硬化形成圖(Ross R. 1999; N Engl J Med). 圖 3、粥狀動脈硬化形成過程圖(Peter Libby 2001; Circulation) 第二節、趨化因子( chemokines )介紹 第三節、趨 化 因 子 (chemokine) 是 由 一 群 小 子 分 量 的 蛋 白 質 (8-13KDa)所組成的，是屬於 cytokine 的一種，目前已有四 十幾種的趨化因子被發現。以下分幾個部分來討論： 第四節、一、結構分類上，最主要可以分為四組，分組的依據主要 是依其在成熟氨基酸序列上插入的 cysteine 殘基位置不同 而分為四類(Fig. 4) 【10,11 】： 第五節、1、CXC-chemokine( cysteine-X-cystine)或稱 a-chemokine ： 主要在兩個 cysteine 殘基上插入了一個未知的氨基酸序列。. 14.
(15) 最 主 要 表 現 的 細 胞 嗜 中 性 球 (neutrophils) 及 淋 巴 球 (lymphocyte)。 第六節、2、CC-chemokine( cysteine-cystine)或稱 ß-chemokine：兩個 cysteine 殘基是緊鄰在一起的。最主要表現的細胞為白血球 (leukocytes) 、 單 核 球 (monocytes) 、 T 淋 巴 球 細 胞 (Tlymphocytes)及 B 淋巴球細胞 (B-lymphocytes)等等。 第七節、3、C-chemokine( cysteine-cystine)：cysteine 殘基主要位於第 三和第四個位置上。最主要表現的細胞為白血球 (leukocytes)及自然殺手細胞(NK cell)上。 第八節、4 、 CX3C-chemokine( cysteine-XXX-cystine) 或 稱 dchemokine：主要在兩個 cysteine 殘基上插入了三個未知的 氨 基 酸 序 列 。 最 主 要 表 現 的 細 胞 為 T 淋 巴 球 細 胞 (Tlymphocytes)及嗜中性球(neutrophils)。 第九節、二、趨化因子(chemokine)的功能： 第十節、整體而言，趨化因子(chemokine)的作用是在白血球的 調節、聚集及活化，因此，認為趨化因子在病理生理 的過程中可能扮演了一個很重要的角色，例如：過敏 反應、發炎感染、自體免疫疾病、血管新生、傷口的癒 合 、腫瘤的生長及轉移或是造血發育 (hematopoietic development)系統上的疾病等等。此外，也發現有些化 學趨化因子不僅僅只會表現在造血前驅細胞 (hematopoietic progenitor cell) 上， 也會表現在一些非 造血前驅細胞中，例如：纖維母細胞 (fibroblast)、平滑 肌細胞(smooth muscle cell) 、骨髓癌細胞株骨髓癌細胞 株(melanoma cell line)、角質細胞(keratinocytes)等細胞 上，所 以，化學趨化因子的影響是非常廣泛且重要 的。. 15.
(16) 第十一節、. 第十二節、Fig 4. 趨 化 因 子 及 其 接 受 器 之 介 紹 (Luster, Andrew D. 1998; N Engl J 第十三節、Med ) 第十四節、 第十五節、趨化因子( chemokines )與粥狀動脈硬化及再阻塞之關係 化學趨化因子在許多病理生理的過程中扮演一個很重要的角色， 例如：發炎和免疫，而在某些發炎的部位，這些化學趨化因子發炎 前驅物可以提供血管的發育或新生(Angiogenesis)【12,13,14,15】，血 管新生是一個在原血管部位發展微血管成血管多重步驟的過程，這. 16.
(17) 些過程包幾個重要的步驟(圖 5)：在一開始受傷的部位會釋放出血 管生成因子(Angiogenesis factor)並與內皮細胞上的接受器結合活化 內皮細胞，使得內皮細胞增生並遷移並重塑細胞外基質(ECM)，發 展形成血管，血管新生對於許多病理生理的機制上來說是一個很重 要的步驟，包括：傷口的癒合、類風濕性關節炎、糖尿病、腫瘤的轉 移等等【16,17,18,19 】，而在有許多研究發現在CXC 這一個化學趨化 因子中的 stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)及其專一性的接受器 CXCR4 (CXCR4 receptor)與血管的新生和發育有著重要調控的角色，因為 當小鼠缺乏SDF-1或是CXCR4時，小鼠通常在胚胎發育時就會死 亡，最主要的原因是因為心血管系統、神經系統、造血功能上發育的 缺陷所造成。【12,20,21】因此，推論SDF-1 及CXCR4 receptor在血管 的生成中是一個非常重要因子。而在Marina Molino 等人研究中也證 實了CXCR4 receptor會表現在人類冠狀動脈血管壁中的內皮細胞上 並且可以當作一個生理性的調節者【22】，另外在許多癌症中發現由 於SDF-1 及CXCR4 receptor的血管生成作用，會造成許多癌症、腫瘤 的轉移，例如：黑色素癌、肺癌、乳癌等等腫瘤的轉移及惡化，而造 成治療困難及預後差的效果【23,24,25,26 】，而SDF-1 及CXCR4 receptor在血管的生成與粥狀動脈硬化及再阻塞之間的關係目前並不. 17.
(18) 是非常的清楚，但目前知道的是粥狀動脈硬化形成的過程與單核 球、淋巴球從血液中進入到血管內膜(intima)中有著密切的關係，而 單核球、淋巴球進入到內膜中主要是因為在損傷發炎的部位會釋放 出一些化學趨化因子、黏著因子的關係所影響（圖 6）而這個過程會 加重粥狀動脈硬化或是發炎處的反應【 10,27】，Paola Romagnan 等人 的研究中指出CXC chemokines 可以調節發炎及血管的新生【28】，而 另外在Andreas Schober等人的研究中也發現在Apolipoprotein E基因 有缺陷的小鼠在血管損傷後，SDF-1a 會使得損傷處因為平滑肌細胞 的增生而造成再阻塞的現象【29】，因此推論SDF-1a 及其專一性的接 受器CXCR4在粥狀動脈硬化過程及氣球擴張之後再阻塞的機制中扮 演著重要的角色。. 18.
(19) 圖5、血管新生之步驟(http://www.peregrineinc.com/content.php?id= 118). 圖 6、發炎反應中化學趨化因子扮演的角色 (Luster, Andrew D. 1998; N Engl J Med). 第十六節、 SDF-1 及 CXCR4 receptor 對細胞之影響 SDF-1a與CXCR4 receptor對細胞的影響機制結果並不是非常的清 楚，但是目前已知的是SDF-1a與CXCR4 receptor結合之後，最主要. 19.
(20) 造成G-protein 的活化，進而去影響細胞中下游的訊息因子，包括了 (圖 7 )：ERK/mitogen-activated protein kinase(MAPK)、focal adhesion kinase (FAK)、extracellular-signal regulated kinases 1 and 2 (ERK-1 and -2) 、protein kinase C (PKC)、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) 、 Janus kinase signal、transcription (JAK/STAT)和活化nuclear factor ?-B (NF?B)等等訊息因子【22,30,31,32 】。. 圖7、SDF-1a 與CXCR4 receptor訊息傳遞 在細胞內 MAPK (Mitogen activated protein kinase pathway)訊息 傳導路徑對於正常細胞功能的調控扮演非常重要的角色。主要是因 為參與了細胞的生長、發育、分化、發炎反應與細胞凋亡等細胞生理 反應。當細胞受到外界如生長因子、細胞激素或壓力(stress)的刺激 20.
(21) 下，會誘發特定訊息傳導路徑中的蛋白質磷酸化，而產生活化作 用，並將一系列訊號，依序的逐漸往細胞核內傳遞，進而產生相對 的細胞生理反應，一般而言 MAPK 路徑傳導可被歸納為三條(圖 8) ，第一條是活化 Erk 1/2 為主的傳導路徑，此路徑主要是負責和細 胞生長與分化相關的作用。而第二及第三條則分別為 p38 MAPK 路 徑和 SAPK/JNK 路徑，這兩條路徑則與發炎反應和細胞凋亡有較大 之關連性【6,33】。. 圖 8、MAPK 訊息傳遞途徑 增生除了與MAPK訊息傳遞途徑有關係外，也與細胞週期的進 行有著密切的關係。當細胞藉由生長與分裂間，週而復始的循環， 21.
(22) 形成細胞週期（cell cycle, 圖 9），而細胞週期依照其時間順序可分 為四期，依序分別為G1 期、S 期、G2 期及M期，其中S 期為DNA 合 成期(synthesis)，而M 期則為細胞有絲分裂期(mitosis)。一般狀態下 細胞多長期處在G0 期或稱為靜止期。但當細胞受到外界增生性刺激 因數的促進下，細胞就會進入到細胞週期之G1期。G1期為DNA 進行 合成前之準備期，此期有一檢查點(check point)或稱為限制點 (restriction point)的機制，對於細胞是否繼續進行DNA合成或細胞有 絲分裂，做有效控管的動作。當細胞不適合進行分裂時(例如周遭生 長環境不佳或細胞本身的DNA 受損等) ，此機制即會終止細胞週期 繼續進行。細胞在通過G1 和S 期間的限制點機制後，細胞即會進行 DNA 合成及接下來的有絲分裂期，使原來的細胞由一個分裂成兩 個細胞而完成一次完整的細胞週期。細胞週期的進行受大兩股力量 之間的調控，一股是促進細胞週期性的力量，例如來自生長因子、 致癌基(oncogenes)、CDKs 與Cyclins 等的作用，另一邊則來自例如 抑癌基因或CDK 抑制劑之抑制細胞週期進行的作用。當促進性的力 量大於抑制性的力量，則會促使細胞週期開始運轉，反之則抑制進 入細胞週期。細胞週期限制點的機制主要是以Rb 蛋白質為中心，經 由此蛋白質磷酸化程度來達到調控作用。正常未磷酸化狀態下的Rb 會與稱為 E2F 的轉錄因數結合，當Rb 蛋白質受到活化的cyclin D/ 22.
(23) CDK4 、cyclinD/CDK6 或cyclin E/CDK2 複合體等的作用而磷酸化 後，會促使與Rb結合的E2F 釋放出來，緊接著E2F 會結合到與細胞 週期之S 其相關的基因之特定DNA 序列上，促進這些基因的轉錄作 用，進而使細胞週期由G1期進入S 期和有絲分裂期。這些促進Rb 磷 酸化的cyclin/CDK複合體活性受到兩類蛋白質族群的抑制，一個為 Cip/Kip 家族，另一個為Ink 4 家族，而這兩類蛋白質族群被統稱為 CDK 抑制劑(CDK inhibitor; CDKI) ，並分別對不同種類的cyclin/ CDK 複合體進行抑制的作用。其中 Ink 4 家族包含有p14、p15、p16 、 p18 和p19 等蛋白質，Cip/Kip 家族則包含p21、p27 和p57 等蛋白質。 因此如果為了要抑制細胞過度的增生，則可藉由提升CDK 抑制劑 的活性或降低cyclin/CDK 複合體之表現量或活性，即可進進一步抑 制Rb 蛋白質的磷酸化，使得E2F 這類促進S 期進行所需的轉錄因數 無法釋放出來而發揮作用，最後達到抑制細胞增生的作用 【34,35,36 】。. 23.
(24) 圖 9、細胞週期及其控制蛋白(cell cycle and control protein). 第十七節、細胞凋亡 在正常情況下，生物體內細胞的繁殖(proliferation)及死亡(death) 視為持著一定的平衡（homeostasis ）。生理性的死亡是細胞經由程 序性的細胞死亡(programmed cell death)，稱之為細胞凋亡 (apoptosis)，而細胞凋亡一詞，最早是由1972 年病理學家 John Kerr 所提出來的，意思是樹葉凋亡或是掉落，在生理上扮演了非常重要 的角色，在胚胎發育的過程、免疫的調節或是精子的形程過程中都. 24.
(25) 會發生細胞凋亡的情形，另外，當正常細胞受到傷害時，也會利用 細胞凋亡的機制將嚴重受傷的細胞除去，以便維持新的細胞增生， 或當細胞 DNA受傷而發生基因突變時細胞凋亡的機制誘使突變的細 胞死亡，而避免突變的遺傳【37,38,39】。 細胞凋亡主要發生在單一細胞中，可以分為早期(early phase)和晚 期(later phase)兩個時期，在早期中會出現染色質濃縮(chromatin condensation) 、細胞質濃縮(condensation of cytoplasm)及細胞皺縮(cell shrinkage) 等特徵；在晚期則是會出現，細胞開始發生裂解，進而形 成凋亡小體(apoptosis bodies)，這些凋亡小體仍具有胞膜，因此不會 引起發炎反應或危害周圍的組織【40,41 】。 當細胞接受不同的刺激引起細胞凋亡的路徑，主要可以分為兩類： 粒腺體路徑( mitochondrial pathway) ，主要是因為粒腺體的通透性改 變、 Bcl2 家族的參與引起粒腺體釋放出 cytochrome c，並與 Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) 及 活 化 的 caspase-9 結 合 形 成 Apoptosome造成細胞的凋亡【42】。另一個路徑是由死亡接受體(cell death receptor pathway) 所引起的路徑，主要是藉由細胞膜的死亡接 受體 (death receptor)而引發 caspase8 的活化所導致。這個路徑最主要 與caspase的活化有關，故進一步探討caspase誘發細胞凋亡的分子作 用機制。 25.
(26) 一、caspase 有一群含有cysteine 蛋白質分解? (proteases)在細胞凋亡進行時，會 作 用 於 受 質 (substrate) 的 aspartate 部 位 ， 被 稱 為 cysteine aspartatespecific protease，簡稱為caspase。Caspase平時以酵素原(zymogens)這 種不具活性的方式存在， 當受到刺激後， 被活化成具有活性的 caspase，會去裂解其他細胞內的? ，造成細胞型態的改變【43,44】， 目前研究至少以經有 14種的caspase存在，根據其同源性。大致可以 分為三類【45】：第一類為The ICE subfamily of cytokine processors ， 此類的caspase有caspase-1、-4 、-5 、-11、-13 及-14 ，其功能與發炎反應 比 較 有 相 關 。 第 二 類 為 The ICH-1/Nedd-2 subfamily of apoptotic initiators ，此類的caspase有caspase-2、-8、-9 、 -10及-12，主要是負責活 化apoptotic executioners 使其能執行apoptosis ，此類的caspases 在結構 上， N端具有較長的 prodomain ，如：caspase-8 和10，其 N端具有兩 個 death effector domain (DED)，與下游的 adaptor molecue C 端的 DD domain 相連，以傳遞來自 death receptor pathway的死亡訊息。而在 caspase-9 上 具 有 CARD (caspase recruitment domain) 位 於 prodomain 上 ， 此 CARD domain 可 與 Apaf-1 上 的 N 端 結 合 ， 傳 遞 來 自 mitochondria pathway 的 死 亡 訊 息 。 第 三 類 為 The Ced3/CPP32 subfamily of apoptotic executioners ，此 類 的 caspase 有 caspase-3 、 -6 26.
(27) 及-7 ，主要的功能是負責執行細胞凋亡，這類的caspase在其結構的 N端上的prodomain 較短，裂解其下游的protein 如：poly( ADP-ribose) polymerase (PARP)，此蛋白質為caspase-3的受質，而 PARP其原本的 作用為修復受損的DNA調空細胞的增生和死亡的平衡以及維持基因 體 的 穩 定 性 。 但 當 PARP 受 caspase-3 裂 解 ， 會 由 116kDa 裂 解 成 85kDa，進而失去原本的作用 。caspase-3 也會受到 ICAD/DFF45(DNA fragmentation factor 45) 導致 其鍵結的 CAD 能脫離 ICAD 的束縛，進而 CAD 可轉移到細胞核內 分解 DNA ，將 DNA180-200 bp 切程大約長度的片段【45,46】。 二、Death receptor 與細胞凋亡 死亡接受體是一組膜表面接受體，與細胞質內之 death domain 結 合後，可以引起受體下游分子訊息傳遞而造成細胞凋亡(圖 10 )【47】，死亡接受體包括：TNFR Ⅰ 及 TNFR Ⅱ( Tumor necrosis factor receptor Ⅰ 、Ⅱ)、Fas (Apo-1 and CD95)、DR3 ( death receptor 3)、DR4 ( TNF Related Aoptosis Inducing Ligand Ⅰ ；TRAILⅠ )、DR5 (TRAILⅡ)、 CAR Ⅰ等皆屬於腫瘤壞死因子接受體(TNFR)超級家族其共同特徵是 在細胞質中都有一段 60~80 的氨基酸組成的 death domain，包括了 TRADD( TNFRⅠassociated death domain protein) ，它可以和 TNFR Ⅰ 特異性的結合，TRADD 在多種細胞中過度表達可以導致細胞凋亡 及啟動轉錄因子 NF-?B(nuclear factor-?B)、TRADD 誘導細胞凋亡的 作用；FADD( Fas associated death domain protein)，其在 C 端含有一 個死亡結構區域可以和 Fas/Apo1 結 合 ，N 端含有死亡效應結構 ( death effector domain ，DED) ，通過他可以和 caspase-8 結合，而誘 導細胞凋亡。另外，RIP(receptor-interacting protein)，它可以和 Fas 及 TNFR Ⅰ結 合， 且在細胞中過度表達也會引起細胞凋亡 。 Daxx ( death associated protein 6) 可以和 Fas 作特異性的結合，Daxx 本身 不具有死亡結構區域，但是在 C 端具有可以和 Fas 的死亡結構區域 結合的區域，在 N 端具有誘導細胞凋亡和啟動 JNK 途徑的作用。這 27.
(28) 些死亡受體與細胞質中的 death domain 結合後，會誘導細胞凋亡的 信號，啟動細胞內部的凋亡程式，造成細胞凋亡【47,48,49,50】。. 圖 10、由 death receptor 活化細胞凋亡的路徑(http:// www.anticancer.net/resan/basis.html) 三、Bcl-2 家族與細胞凋亡 Bcl-2( B cell lymphoma protein 2) 是 一 個 原 致 癌 基 因 ( protooncogene)，最初是在 B 細胞淋巴瘤中的染色體轉位發現的，此種轉 位會去抑制 B 細胞死亡，導致細胞瘤的生長。Bcl-2 家族可以分為兩 類：一為抑制細胞凋亡的分子( Antiapototic member)，包括了 Bcl-2、 Bcl-X L、Bcl-w 、Mcl-1 及 A-1 ，另一類為促進細胞凋亡的分子( Proapototic member)包括有 Bax、Bad、Bid 、Bcl-X s、Bik、Bim、Blk 及 Hrk. 28.
(29) 【47,51,52,53】。所有的 Bcl-2 家族成員結構相似，都具有 BH(Bcl-2 homology domains)結構。BH4 domains 幾乎只存在 anti-apoptotic 分子 中，Bcl-2 的 BH4 domains 還可以和 Raf-1 以及 p53 binding protein 結 合。 Bcl-2 及 Bcl-X L 位於 BH3 和 BH4 domains 之間有一個 loop 的結 構，如果失去 loop 的結構 Bcl-2 就無法被磷酸化【51, 54,55】。Bcl-2 的家則成員大部分在 C-terminal 含有 transmembrane domain ( TM )， 使得他們可以存在於粒腺體、內質網(endoplasmic reticulum)或是在核 膜 上 ； 而 促 進 細 胞 凋 亡 的 分 子 Bad 及 Bid 在 C-terminal 缺 乏 transmembrane domain ，平時存在於細胞質中，一旦接受到死亡訊 息，例如： caspase-8，則會轉位 (translocation) 到膜上，尤其是粒腺 體膜上，使的 Bax 大量表現在粒腺體膜上，在 Bax 結構中的 BH1 及 BH2 domain 會在粒腺體膜上形成通道 ( channel)，而促使粒腺體釋放 出 cytochrome c，使細胞進行凋亡，另一方面，一般 Bcl-2 蛋白是表 現在粒腺體膜上粒腺體膜上，而與 Apaf-1 蛋白結合在一起，當細胞 內部受到刺激時，會導致 Bcl-2 釋放 Apaf-1 ，而 Bax 轉位到粒腺體 膜上，促進 cytochrome c 釋放，進而使 caspase-9 活化，引發細胞凋 亡【56,57】。 第六節、藥物簡介. 29.
(30) 1、丹參( Salvia miltiorrhiza )【58,59,60】。 丹參，學名為川丹參，始記載於《本經》。為唇形科植物丹參 Salvia miltiorrhiza Bge.的乾燥根及根莖。主產於安徽、山西、河北、四 川、江蘇等地。 《本草綱目·卷十二·丹參》：“五參五色配五臟，故人 參入脾曰黃參，沙參入肺曰白參，玄參入腎曰黑參，牡蒙入肝曰 紫參，丹參入心曰赤參。”臨床處方時，則以丹參色紫紅而常用紫 丹參名。性味：苦，微寒。屬於活血化瘀類中藥，功效主治如下 表： 功效. 主. 治. 活血化瘀. 月經不調；血滯經閉；產後腹痛；心腹痛；跌打損傷.. 涼血消癰. 溫病熱入營血；瘡癰腫毒. 養血安神. 心悸；失眠. 其所含的成分包括有：丹參主含丹參酮（tanshinone）Ⅰ、Ⅱ A、 Ⅱ B ， 異 丹 參 酮 （ isotanshinone ） Ⅰ 、 Ⅱ ， 隱 丹 參 酮 （dryptotanshinone）、異隱丹參酮（isocryptotanshinone）、羥基丹參 酮（hydroxytanshinone）Ⅱ A、丹參新酮（miltirone）、左旋二氫丹參 酮（dihydrotanshinone）Ⅰ、丹參酚（salviol）等。此外，尚有原兒茶 醛、原兒茶酸、乳酸、維生素 E 等。. 30.
(31) 現代藥理及對心血管系統的藥理作用： (1) 對心臟及冠狀血管的影響：丹參注射液能增加狗冠狀血流量 60 ％，降低冠狀循環阻力。丹參素對離體豬冠狀動脈有擴張並增 加血流的作用，心肌收縮力先抑制後增強，心律有一定程度減 慢。但丹參酮Ⅱ A 磺酸鈉，原兒茶醛顯著收縮豬冠狀動脈。丹參 可減輕缺血再灌注的心肌損傷，並增加 SOD 及 GSH-Px 的活性 有效清除缺血再灌注產生的氧自由基【58,59 】。 (2) 對心肌缺血及心肌梗塞的影響：丹參酮能明顯抑制心肌壞死導致 的嗜中性白血球溶小體釋放、吞噬和黏附，減少血清及心肌 MDA，升高心肌 SOD 的活性，抑制白血球向心肌缺血區的浸 潤及心肌中 PGE2 的合成。由此可知，丹參酮有防治心肌梗死的 作用。用丹參治療心肌梗塞的狗，可見到梗塞區壞死心肌清除 較快，巨噬細胞活躍，纖維母細胞分化和膠原纖維形成較明 顯，肉芽形成較成熟，說明丹參調節組織的修復與再生【59】。. 31.
(32) (3) 對血液流變性的影響：丹參注射液有增加紅血球電泳率、降低血 小板黏附性、 降低血球壓積、 抑制血小板凝集、 抑制血栓形成等作 用。降低冠心病患者的血漿粘滯性作用。丹參對老年大鼠能降低 全血比粘度纖維蛋白源及增加紅血球電泳時間【59】。 (4) 改善微循環作用：丹參有加快微循環血流速度，增加毛細血管 網而改善冠心病病人的外周微循環，另外，可以保護老鼠腦部 因缺血損傷所造成的傷害【59,62】。 (5) 降血脂及抗動脈粥樣硬化，提高耐缺氧：對動脈粥狀硬化的家 兔，可降低血和肝中的三酸甘油酯。在細胞模型中丹參素具有 降低細胞內膽固醇合成及抗脂蛋白氧化作用，氧化脂蛋白中的 MDA 明顯減少，氧化脂蛋白對細胞的毒性作用明顯減弱，也 可以減少在 TNF-a 處理後 VCAM-1 與 ICAM-1 的表現【59,64 】。 (6) 抗菌作用：高濃度丹參煎劑的體外實驗對綠膿、大腸、傷寒、痢 疾桿菌均有抑菌作用【65】。 (7) 丹參注射液及其多種水溶成分（原兒茶醛、丹參素、Sod A 等）， 顯著抑制肝臟脂質過氧化。其機制可能為透過自由基的清除作用 【59,63】。 (8) 鎮靜、鎮痛作用：丹參素靜脈注射對大小鼠、狗均產生明顯的鎮 靜作用。使狗腦電波型由低波轉變為高慢波【65】。 32.
(33) (9) 可抑制或減輕肝細胞變性、壞死及炎癥反應，促進肝細胞再生， 並有抗纖維化作用【65】。 2、厚朴 ( Magnolia officinals ) 【61】。 厚朴，學名為川厚朴始載於《本經》。為木蘭科(Magnoliaceae) 落葉喬木植物厚朴 Magnolia officinalis Rehd﹒et Wils﹒或凹葉厚朴 Magnolia officinalis Rehd﹒et Wils ﹒var blioba Rehd﹒et Wils﹒ 的樹 皮、根皮或枝皮。生長於四川、湖北、湖南、浙江、陜西、貴州。以四川、 湖北所產質量最佳。其性狀為卷成單筒狀或雙筒狀，長約 35cm， 厚約 2~5cm，表面灰暗棕色，外表粗糙不平為鱗片狀，質堅硬， 折斷面不平整，成纖維狀，氣芳香，味苦澀。 《本草綱目·卷三十五· 厚朴》云：“其木質朴而皮厚，味辛烈而色紫赤，故有厚朴、烈、赤 諸名。”依本草備要解析所述，其性味為苦辛溫，具有厚腸胃，行 結水，破宿血的功能。屬芳香化濕類，功效主治如下表： 【功效主治】 功效. 主治. 行氣、消積. 脾胃氣滯證；積滯. 行氣燥濕. 濕阻中焦證；泄瀉. 下氣、消痰平喘. 咳嗽氣喘. 33.
(34) 其所含的成分有：厚朴酚、異厚朴酚、四氫厚朴酚及一種水溶性 生物鹼，稱為厚朴鹼。. 現代藥理及對新血管系統的藥理作用【61,65】 (1?. 本品煎劑在試管中，對金黃色葡萄球菌有很強的抑制作用。. (2?. 厚朴鹼和厚朴酚有鬆弛骨骼肌作用。. (3?. 厚朴酚對實驗性胃潰瘍有防治作用，並對組織胺所致十二指 腸痙攣有一定的抑制作用。. (4?. 厚朴鹼和厚朴花有降壓作用。. 在粥狀動脈的形成過程中，大量的脂肪尤其是氧化的脂肪酸，正 常時就會進入平滑肌層，有高膽固醇的人可能會因為平滑肌細胞 受到改變或傷害促使平滑肌增生，所有這些不正常的情形皆被認 為與脂質的過氧化有關，而氧化還原最主要的場所是在粒線體。 有研究指出 magnolol 及 honokiol（厚朴成分中兩種最主要的抗氧 化成分）能保護大白鼠心臟的粒線體以防止脂質過氧化，抑制缺. 34.
(35) 血再灌注引起的心室心律不整並增加一氧化氮合成，對於 Mac-1 及 neutrophil 附著也有抑制作用，這些都可能和 magnolol 的抗氧 化作用有關【67-72 】。 （5）對心率和血壓的作用 厚朴煎液對蟾蜍离体心臟有抑制作用，低於肌鬆劑量的厚朴鹼 注射給藥即有明顯降壓作用，這一作用不能被抗組織胺藥物所 對抗，說明並非由於組織胺釋放引起，靜脈注射者降壓時程約 維持 10-15 分鐘，肌內注射者可維持 1 小時以上，麻醉兔、貓靜 注或肌注厚朴花的酊劑水溶物都具降壓作用，並使心率加快 【61,5】。 （6）對血小板聚集的抑制作用 厚朴酚抑制膠原和花生四烯酸誘導的兔富血小板血漿的聚集和 ATP 釋放，洗過的血小板聚集比富血小板血漿的聚集更明顯被 抑制。全血的聚集較少被這抑制劑影響。厚朴酚在各種情況下抑 制血栓烷 B2 形成，由花生四烯酸或膠原引起的細胞內 Ca2+升高 也被抑制。厚朴酚的抗血小板作用是由於對血栓烷 B2 和細胞內 Ca2+流動的抑制【61,65 】。 （7）在研究中指出在大白鼠進行氣球擴張後厚朴具有誘導血管平 滑肌細胞進行 apoptosis 的作用，而降低血管 intima 之增厚作用. 35.
(36) 【73】。. 第二章、材料與方法 第一節、實驗材料 A 儀器 1.無菌操作臺（造鑫, Taiwan） 2.細胞培養箱 (Nuaire, USA) 3.細胞計數器 (Haemocytometer; Boeco, Germany) 4.光學顯微鏡 (Motic, Japan) 5.離心機 (Beckman) 6.酸鹼值測定計 (C831; Consort, UK) 7.乾浴槽 (Model 110001; 購自Boekel) 8.微量天平 (GR-200; A&D, Japan) 9.去離子水製造機 (Minipore, USA) 10.超高速離心機（himac CS 120GX） 11.Shaker bath (BT-350; 購自YIH DER, Taiwan) 12.Power supply ( Hoefer,San Francisco, CA, U.S.A) 13.PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD, Hercules,California,USA) 14.ELISA reader（ANTHOS-2020,Salzbrug,Austria）. 36.
(37) 15.Vortex-genie 2 (SCIENTIFIC INDUSTRIES,NY,USA) 16.SDS-PAGE 電泳槽套組 (Amersham, UK) 17. 蛋白質轉漬電泳套組 (Bio-Rad, USA) 18.DNA 電泳槽套組（Easy-CastTM B1A, USA） 19.水浴槽 Water bath (TKS,Taipei,Taiwan ) 20.影像分析儀器（AlphaImagerTM 2200,USA） B 材料 1.細胞培養皿 (騰達行, Taiwan) 2.細胞培養盤 (騰達行, Taiwan) 3.PVDF 轉漬膜 (Minipore, USA) 4.蓋玻片 (Kimble, USA) 5.載玻片 (Marriefeld, Germany) 6.冷凍管 ( 騰達行, Taiwan) 7.微量離心管 (季勗, Taiwan) 8.離心管 ( 季勗, Taiwan) 9.X-film ( Kodak,USA) 10.Paraffin (購自 American national can) C 試劑 1.40% Acrylamide/Bis (康芙貿易行, Taiwan) 2APS (Ammonium persulfate; USB) 3.Bradford reagent (BIO-RAD, Hercules,California,USA) 4.BSA（Bovine serum albumin）（SIGMA, ST.Louis,MO,USA）. 37.
(38) 5.Bromophenol blue (USB) 6.DMSO (Dimethyl Sulfoxide; Sigma, USA) 7.DTT (1,4-Dithio-D,L-threitol; GERBU, Germany) 8.DMEM (Dulbeccco’s Modified Eagle’s Medium; GIBCO, USA) 9.Dual-Luciferase reporter assay system （Promega ） 10.ECL kit (Amersham, UK) 11.Ethanol (景明化工,Taiwan ) 12. Eithidium bromide ( Amersham, USB ) 13.FBS (Fetal Bovine serum; GIBCO, USA；捷陞科技（股）公司, Taiwan) 14.Glycine (AppliChem, Germany) 15.Hydrochloric acid (Merck, USA) 16.Methanol (景明化工,Taiwan) 17.MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-terazolium bromide; 購自Sigma, USA) 18.NF?B promoter 19.Paraformaldehyde (景明化工, Taiwan) 20.Penicillin-Streptomycin (GIBCO, USA) 21.Potassium dihydrogen phosphate (Merck, USA) 22.Potassium chloride (Scharlau, Spain) 23.Protein assay-Dye reagent concentrate (Bio-Rad, USA) 24.Protein maker (Amersham, UK). 38.
(39) 25.RT kit（Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A） 26.SDS (Sodium dodecyl sulfate; USB) 27.Recombination mouse SDF-1a/CXCL12(生工, Taiwan) 28.Sodium bicarbonate (Merck, USA) 29.Sodium chloride (Scharlau, Spain) 30.Sodium hydroxide (SHOWA, Japan) 31.Sodium pyruvate (GIBCO, USA) 32.Ponceu S （Sigma） 33.TransFastTM transfection reagent （Promega） 34.TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine; Pharmacia, Sweden) 35.Tris (Tris(hydroxymethly)-aminomethane; Pharmacia,Sweden) 36.Triton X-100 (USB) 37.Trysin-EDTA (GIBCO, USA) 38.Trypan blue （GIBCO） 39.Tween 20 (Pharmacia, Sweden) 40.ß-galactosidase promoter 41.ß-galactosidase Enzyme assay system （Promega） 42. 脫脂奶粉(安佳, New Zealand) 43. 顯影劑(Kodak, USA) 44. 定影劑(Kodak, USA) 45. 血管平滑肌細胞(CCRC 60127: smooth muscle, thoracic aorta, Rat；. 39.
(40) 購自新竹食品工業研究所) 46. 一級抗體： (a) anti-CXCR4 (生工, Taiwan) (b) anti-Erk1/2 (Santa Cruz, USA) (d) anti-p-Erk1/2 (Santa Cruz, USA) (e) anti-Jnk (Santa Cruz, USA) (f) anti-p-Jnk (Santa Cruz, USA) (g) anti-FAK (Santa Cruz, USA) (h) anti-MEK (Santa Cruz, USA) (I) anti-Raf-1 (Santa Cruz, USA) (J) anti-VEGF ( 生工, Taiwan) (K) anti-caspase3 (Santa Cruz, USA) (L) anti-p21(Santa Cruz, USA) (M) anti-bata actin(Santa Cruz, USA) 47. 二級抗體 anti-mouse IgG (horseradish peroxidase conjugated; Santa Cruz, USA) anti-rabbit IgG (horseradish peroxidase conjugated; Santa Cruz, CA) 48.30% Glycerol solution (BIO-RAD, Hercules,California,USA ) 49.Equilibration buffer I(BIO-RAD, Hercules,California,USA) 50.Equilibration buffer II(BIO-RAD, Hercules,California,USA ) 51.Overlay Agarose(BIO-RAD, Hercules,California,USA ) 52.IPG Strip(BIO-RAD, Hercules,California,USA ) 53.E-Coli- standard(BIO-RAD, Hercules,California,USA ) 54.Sample buffer(BIO-RAD, Hercules,California,USA ). 40.
(41) 第二節、實驗方法 1. 厚朴抽取物的製備及配製 將木蘭科(Magnoliaceae)植物 Magnolia officinalis REHD. et WIL 之乾燥根皮溶於 methanol，經迴流萃取， 過濾，濃縮，再以 chloroform 溶解，以 chloroform 可溶部分以水萃取，再取 chloroform 溶解以 n-hexane 萃取，將 n-hexane 層經濃縮，再結晶即可得厚朴之 抽取物。經由本方法所抽取的抽取物大部分為厚朴中之 magnolol ( 經 TLC 定性的結果得知 90%為 magnolol) 。而丹參酚酸 B (salivanolic acid B) 是由台北榮民總醫院蕭明熙教授提供。 將 magnolol 及 salivanolic acid B 粉末 10mg 加入細胞培養等級之 DMSO 溶解，配製成濃度為 0.075mg/ml 備用。. 41.
(42) Salvianolic acid B 及 Magnolol 的化學結構. 2. Recombination mouse SDF-1a/CXCL12 配製方法 將 Recombination mouse SDF-1a/CXCL12( 生工, Taiwan)加入含 有 0.1% BSA 的 PBS 中配製濃度為 1ng/µl 備用。. 3、平滑肌細胞的培養 血管平滑肌細胞株（購自食品工業發展研究所，Cell no .: 60127，代號 A10）來自胎鼠胸主動脈(the thoracic aorta of DB1X embryonic rat) ，多應用於血管平滑肌(vascular smooth muscle cells; VSMCs) 實驗模型。 將含有10% FBS 的DMEM培養基（含3.7g/ l NaHCO 3, 4.5g/l DGlucose, 1.028g/l N-Acetyl L-alanyl-L-glutamine, 1% Na-Pyruvate, 100 units/ml penicillin G及100 ug/ml streptomycin sulfate, 1%HEPES Buffer Solution）在37℃ 之水浴恆溫槽中加溫。將儲存在液態氮桶中大鼠主 42.
(43) 動脈平滑肌細胞取出，檢查蓋子是否旋緊，因為熱脹冷縮過程中， 蓋子容易鬆脫，並插入浮板迅速放入37℃水浴中使其快速解凍，將 解凍後之冷凍小管用70%酒精擦拭， 移入無菌操作台內，以1 ml pipette將解凍之細胞懸浮液吸出放入10公分培養皿，並加入約10 ml 含10 % 胎牛血清之培養基，混合均勻後放入細胞培養箱(37 ℃、95％ O2、5 ％CO2) 中進行培養，每二天換一次培養基。 次培養 當細胞長約九成滿時，用 9 吋滴管接抽氣幫浦移除培養皿中的 培養基，用 10 ml pipette 吸取 7 ml 1X PBS 緩衝液(pH:7.4)至培養皿 中並稍微搖晃後再以 9 吋滴管抽去，重複此步驟二次以維持培養皿 中為中性環境，接著以 1 ml pipette 吸取 1 ml Trypsin- EDTA ( 吸取的 量以蓋過培養皿表面為原則 ) 加到培養皿中，再放入細胞培養箱 3 分鐘，之後加入 1 ml 10% FBS- DMEM 2 ml 中和 Trypsin-EDTA 作 用,以抽吸方式將細胞沖散，盡量使細胞呈單顆懸浮，將培養皿液體 吸換至離心管後加入 10 % FBS- DMEM 共 10 ml ，離心 1500 rpm， 5 分鐘，以 haemocytometer 計算細胞數後進行日常分盤或實驗用分 盤。. 4、利用 haemocytometer 來計數細胞數目. 43.
(44) 將10 公分培養皿內之培養液吸去，以約7 ml 的1x PBS 緩衝液 (pH=7.4)清洗細胞兩次後加入約1 ml 的1x trypsin-EDTA 置入培養箱 內，待3分鐘後取出。加入2 ml 的培養液中和 trypsin-EDTA 活性，並 用1 ml 的pipette 以緩慢來回抽吸方式將細胞打散，將培養皿液體吸 換至15ml離心管後加入10 % FBS-DMEM共10 ml ，取出100 µl 細胞 懸浮液和 10 µl typan-blue，在96-well 內混合均勻，共取2次。分別從 混合液中各取出10 µl 的細胞懸浮液放在細胞計數盤 (haemocytometer) 上下兩個凹槽上，利用蓋上蓋玻片時的虹吸作用將 細胞均勻平均分散於細胞計數區域。在顯微鏡放大100倍下以計數器 計算在haemocytometer 九大格中的左上，左下，右上，右下及中間 格的細胞數總合，除以5 （等於每一大格的平均細胞數），再乘以 104（haemocytometer 中的一大格體積是1×10-4 ml），再乘上1.1（稀 釋倍數） x10（細胞懸浮液總量）x 104 即可得 10 ml細胞總數目 (cells/10ml) 。. 1 3 4. 細胞計數盤與細胞計數區域放大簡圖。 44. 5.
(45) 5、細胞週期同步化(synchronize) 將細胞分到實驗適合之dish或plates後( 例如：6cm dish 細胞數目 約3.5 x105 cells/ well) ，加入含10 % 胎牛血清的培養液2 ml培養細 胞，並於放入培養箱前稍微搖晃使細胞分佈均勻。待12∼24 小時細 胞適應環境並貼覆上 plates 穩定後吸去培養廢液，再以1XPBS 緩衝 液2 ml/well 小心清洗2 次，最後加入2 ml/well 的0 % 胎牛血清培養 液，經24小時後即完成細胞同步化步驟。. 6、細胞蛋白質抽取 將培養於 6 cm dish 的細胞取出，加入 5 ml 1x PBS 緩衝液沖洗 2 次，加入 200 µl 的 Lysis buffer 反應 3 分鐘，使用細胞刮杓將細胞 刮下並將細胞液體收集至微量離心管放入乾浴加溫器內加溫 （95℃ 、5 分鐘），隨即放置於冰上 30 秒以上， 4℃離心（13000 rpm、10 分鐘），取上清液，進行蛋白質定量或冰存於-20℃。 ◎ Lysis buffer 配製方法 組成 Tris-Hcl（PH:6.8） SDS. 最終濃度 6.25M 2%. 最初濃度 0.5M 10%. 體積 / 重量 6.25ml 10ml. DTT. 50mM. 0.3M. 8.34ml. －. 25.41ml 50ml. DDW. － 總體積. * Lysis buffer 需4℃避光存放，並且在使用前需待完全溶解。. 45.
(46) (SDS在低溫時會結晶析出). 7、蛋白質定量 (1) 原理 : 以胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin; BSA) 為蛋白質標 準品，確定蛋白質的體積濃度，並使其均一化，以利實驗之進行。 蛋白質檢量線製作，依照下面表格製作蛋白質標準品樣品： 蛋白質濃度 (ug/ml) 組成 0.1mg/ml BSA (µl) DDW(µl). 0. 5. 10. 15. 20. 25. 0. 50. 100. 150. 200. 250. 800. 750. 700. 650. 600. 550. Baradford（µl）. 200. 總體積（µ l）. 1000. Bradford 為蛋白質染劑，具有毒性，使用時需戴手套。加入染劑混 合均勻後需反應5分鐘後，利用酵素免疫分析儀(ELISA reader)在 O.D. 590nm 測定各蛋白質標準品吸光值之平均值。吸光值測定時每 個樣本數需3重複，使其數值穩定。以測定出來的標準品吸光質與蛋 白質濃度畫出檢量線，並求出趨勢線方程式即R2值。R2值需 >0.99以 上的準確度。 使用 Excel 軟體會出蛋白質檢量線算出趨勢線方程式，經帶入 測得之吸光值(y)，則可求出蛋白質濃度(µg/ml)。 (2)樣品蛋白質濃度測定. 46.
(47) 取10µl 的蛋白質樣品與790µl 的二次水混合，再加入200µl的 Bradford 染劑，混勻5 分鐘後以每個樣品放在3 個wells 的方式依序 放入96 孔細胞培養盤中，利用酵素免疫分析儀在O.D.590 nm 測定 其吸光值平均值。將樣品吸光值平均值代入趨勢線方程式，則可算 出稀釋後樣品之蛋白質濃度，最後再乘上稀釋倍數，則可求得實際 蛋白質樣品濃度。. 8、蛋白質電泳（SDS-PAGE） 依照下列配方先配製下層膠和上層膠：. 下層膠(10%Separation gel) 上層膠(5% Stacking gel) 組成 DDW. 一片量 4.75 ml. 兩片量 9.5 ml. 一片量 3.04 ml. 兩片量 6.08 ml. 1.5M Tris(PH:8.8). 2.5 ml. 5.0 ml. －. －. 0.5M Tris(PH:6.8). －. －. 1.25 ml. 2.5ml. 10%SDS. 100 µl. 200 µl. 50µl. 100 µl. 40%Acrylamide/bis (29:1). 2.5 ml. 5.0 ml. 610 µl. 1.22 ml. 10%APS. 50 µl. 100 µl. 50 µl. 100µl. TEMED. 10 µl. 20 µl. 6 µl. 12 µl. 下層膠注入造膠檯內約八分滿，剩餘的空間先用 75% 酒精填滿去除 上面的氣泡並壓平膠之上緣，等待凝固約 30 分鐘，造上層膠 ， TEMED 則須等下層膠凝固後將 75% 酒精倒出後加入，下層膠凝固 後，注入上層膠，插入 comb 等待凝固約 30 分鐘將 comb 取出後先 47.
(48) 用 DDW 清洗 well，將膠檯放入電泳槽內裝滿 Running buffer ，將 loading sample 先加熱（95℃、5 分鐘）立即放置於冰上冷卻 30 秒以 上， 將 Marker（ 5∼10µl） 和 sample（18∼24 µl）loading 到 well 內 ， 利 用 100V 跑 電 泳 約 2 個 半 小 時 ， 取 出 下 層 膠 放 入 0.1 % Commassie blue 進行蛋白質染色，或準備進行蛋白質轉漬至 PVDF 膜 Western Blot步驟。 9、西方墨點法（Western blot） 準備用物－PVDF membrane 需先用 Methanol 潤濕 30 秒，將下 層膠自水龍頭下取去下，並將膠體放至轉漬夾上其順序如下： 白底網夾 海綿 Filter paper PVDF membrane 膠體(gel) Filter paper 海綿 黑底網夾. 正極（＋）. 負極（－）. 將轉漬夾合上放入 Transfer box 蓋上蓋子放置冰桶中並加滿冰塊， 放入 4℃ 冰箱內，Transfer 條件設定 100 voltage ，轉印時間 1 小時， 將轉印後的 PVDF membrane 放入 5 % fat-free milk 室溫 blocking 1 小 時， 0.1 % PBST 搖盪 5 分鐘，共 3 次，把 membrane 放入含有一級 抗體的封口袋內， 4℃冰箱搖晃至隔天。接著取出 membrane 放入 0.1 % PBST 搖盪 10 分鐘，共 3 次，將 membrane 放入含有二級抗 體，室溫搖盪 1 小時， 取出 membrane 放入 0.1%PBST 搖盪 10 分 48.
(49) 鐘，共 3 次後進行暗房底片顯影。 ◎ 暗房底片顯影（壓片） 準備用物：1 ml Pipet 、1 ml tip 、cassette 、鑷子、感光底片、剪刀、 透明膠片、ECL、Developer、Fixer， 並將 membrane 浸泡於 ECL（比 例為 1:1）混合液中約 30 秒，將 membrane（正面朝上）放置於透明 膠固定好，剪適當大小的底片，進行曝光。（依 membrane 上冷光亮 度決定曝光時間，數秒至 1 小時），曝光後用顯影劑及定影劑洗底 片，後將底片風乾保存並進行分析。 ◎Membrane 保存 將壓片後的 membrane 以 0.1% PBST 10 分鐘 3 次，放入含 0.1% PBST 的密封袋 4℃保存。（可保存 2 星期） ◎ Commassie Blue 染色. gel 先以 DDW 清洗 15 分鐘，共 3 次，加入適當的 Commassie Blue 反應 20 分鐘，加入 destain buffer 搖盪至清楚呈現 band。. ◎ Comassie Brilliant Blue R-250 泡製方法 組成 Comassie Brilliant Blue Methanol Acetic acid DDW. 最終濃度 － － － － 總體積. 49. 最初濃度 － 100% 100% －. 體積 / 重量 0.25g 45ml 10ml 45ml 100ml.
(50) ◎ Destain buffer 泡製方法 組成 最終濃度 Methanol 10% Acetic acid － DDW － 總體積. 最初濃度 100% 100% －. 體積 /重量 100ml 70ml 830ml 1000ml. 10、MTT assay 主 要 是 依 賴 粒 線 體 中 琥 珀 酸 去 氫 脢 的 作 用 將 MTT 3-(4,5dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 的 tetrazolium 轉變為藍色產物 MTT formazan。MTT 轉變僅在活細胞中進行，並堆 積在細胞內 ，且 formazan 形成量與細胞數目呈正比 ，加 入 10 % SDS-Hcl 溶解後，可以由波長約 590nm 知吸光測量並定量。由於細 胞還原 MTT 的能力代表細胞粒線體的活性，因此可以做為細胞存 活率的一個指標。【MTT 保存方法：避光，冷藏於 2∼8℃。】 ◎方法步驟 將細胞分盤至平面 96 well 培養，種植細胞數約 1×10 4/well，以 10% FBS-DMEM 100µl 飼養 24 小時後，以 1 x PBS（PH:7.4）100 µl 沖洗 1~2 次，加入 0﹪FBS-DMEM 100µl同步化 24 小時，加入含不 同濃度 SDF-1a 的 0.5% FBS-DMEM 100 µl及 salivanolic acid B、 magnolol 的 15% FBS-DMEM 100 µl 或是含 SDF-1a10µg、 及 0.075mg/. 50.
(51) ml 的 salivanolic acid B 和 magnolol 的 0.5% FBS-DMEM 100 µl 培養 至時間點加入濃度 5 mg /ml 的 MTT 佔 D100 µl MEM 量的 l/10，培 養 4 小時後再加入 100 µl 10 ﹪SDS-Hcl （終止反應）隔天測吸光值 OD590 nm 。 ◎MTT 溶液的配製 ﹙避光 4℃儲存﹚ 組成 MTT. 最終濃度 5 mg/ml. 初濃度 --. 體積/重量 250 mg. PBS(pH7.4). --. --. 50 ml. 總體積. 50 ml. Solubilization solution 配製﹙室溫儲存﹚ 組成. 最終濃度. 初濃度. 體積/重量. SDS. 10%. －. 10 g. Hcl. 0.01M. 1M. 1 ml 100 ml. 總體積. 11、Wound assay 將 2.5×104 的平滑肌細胞種至 24 well 培養盤的每一個 well 中， 培養 24 小時，加入 0% FBS-DMEM 同步化 24 小時，移去培養基， 以 1X PBS (pH7.4) 1ml 沖洗一次後，用 200µl tip 輕劃一道缺口於含 有平滑肌細胞貼附的 well 上，並用光學顯微鏡( Motic, Japan) 拍照， 加入 SDF-1a10 ng/ml 及 SDF-1a10 ng/ml 加丹參 Salvianolic acid B 抽. 51.
(52) 取物 0.075mg/ml 及厚朴 magnolol 抽取物 0.075mg/ml，培養不同時 間點，並於 24 小時、48 小時用光學顯微鏡拍下並觀察細胞遷移的情 形。. 12、評估丹參、厚朴抽取物對 NF?B promoter 轉殖至血管平滑肌細 胞的表現情形 採用 Promega 的 TransFastTM transfection reagent 試劑（屬於微脂 體）。將 3.5×105 的平滑肌細胞種至 6 well 培養盤的每一個 well，培 養 24 小時。準備 6 薄壁微量管，6 管包含 3µl TransFastTM transfection reagent ＋ 997µl 0% FBS-DMEM ， 另 外 12 管 含 3µl TransFastTM transfection reagent. ＋ 0.5µl (3.88µg) NF-?B promoter-Luciferase. Construc t ＋ 1.5µl(2.6µg) ß-galactosidase Construc t ＋ 995µ 0% FBSDMEM，個別混合均勻並於室溫下作用 15 分鐘即成 lipid-DNA 複合 物。 移去培養盤中的培養基，以 1 x PBS （pH:7.4）1ml 沖洗 2 次，加 入剛才的 lipid-DNA 複合物培養 1~3 小時後，加入 10％ FBS-DMEM 繼續培養 24 小時後，用 0% FBS-DMEM 同步化 24 小時。接著給予 SDF-1a10 ng/ml 及 SDF-1a10 ng/ml 加丹參 Salvianolic acid B 抽取物 0.075mg/ml 及厚朴 magnolol 抽取物 0.075mg/ml，培養 24 小時。用 1X reporter lysis buffer 將細胞的蛋白質抽出來。使用 Promega 的 ß-. 52.
(53) galactosidase Enzyme assay system 來測定 ß-galactosidase 的量來確定 轉殖的效率並當作 internal control。取 50µl 的蛋白質和 50µl 的 2X assay buffer 加入 96 well 孔盤中混和均勻，放入培養相中培養 4 小時 後加入 150µl 的 1M sodium bicarbonate 混勻，測吸光值 OD450 nm， 並 計 算 ß-galactosidase 的 含 量 。 使 用 Promega 的 Dual-Luciferase reporter assay system 來測定 luciferase 表現量，取 20µl 的蛋白質，在 上 冷 光 分 析 儀 前 才 加 入 100ul luciferase reagent （ 每 一 管 加 入 luciferase reagent 與上機的間隔時間盡量一致）測定 luciferase 的含 量。. 13、利用 DNA 電泳法來檢測 salivanolic acid B、Magnolol 對 SDF-1a 處理後的血管平滑肌細胞引起細胞凋亡的情形 將 8 ×10 6 的平滑肌細胞種至 10cm 培養盤，培養 24 小時後，加 入 0% FBS-DMEM 同步化 24 小時。接著給予 SDF-1a10 ng/ml 及 SDF-1a10 ng/ml 加丹參( Salvianolic acid B )抽取物 0.075mg/ml 及厚 朴( Magnolol )抽取物 0.075mg/ml，培養 48 小時後，使用冷泉港 （豐記）的 GINOME DNA kit 來進行 DNA 的抽取。將將細胞從培養 皿收到 15ml 試管中，加入 1.85 ml 的 cell suspension solution、50µl RNase MIX 、100µl cell lysis/denaturing solution 於 55℃水浴槽中加熱. 53.
(54) 30 分鐘，接著加入 25µl 的 protease Mix 於 55℃水浴槽中加熱 1 小時 後，加入 500µl 的 salt out mixture 輕輕混勻，10,000xg 離心 10 分鐘 後取上清液並加入 2ml 的 TE buffer 和 8 ml 的 ethanol absolute 1,000 離心 10 分鐘，倒掉上清液風乾後，加入 40~90µl 的 TE buffer( TE buffer 中所含即為 DNA)。 將抽與完的 DNA 與 6X loading dye 混合均勻，並配置含有 Eithidium bromide 的 2％ agarose gel，將 2％ agarose gel 放在含有 1X TAE buffer 中利用電泳展開器( Easy-Cast TM ) 50V 進行電泳，並使用 影像分析儀器（AlphaImagerTM 2200,USA）觀察並拍出電泳結果。. 14、大鼠頸動脈氣球擴張術 實驗動物選用350 ~ 450 g 雄性Sprague-Dawley (SD)大白鼠(購自財團 法人國家實驗動物中心)來進行氣球擴張術。首先將老鼠秤重後，以 腹腔注射方式給予3.6 % chloralhydrate (1 ml/100 g) ，待麻醉後，將 大白鼠腹面朝上置放於在解剖板，以麻繩固定四肢，並在手術過程 隨時觀察老鼠生命及呼吸狀態。取優碘適量擦拭大白鼠頸部後，用 手術剪刀沿著大白鼠頸部中線從胸部上緣到上顎的皮膚剪開，並以 彎嘴鑷子將大白鼠頸部左側皮膜及結締組織剝離乾淨，暴露出左總 頸動脈，並將左總頸動脈及內頸動脈和外頸動脈所在位置的結締組. 54.
(55) 織剝離乾淨之後，用縫線繞過總頸動脈並用止血鉗夾住縫線以阻絕 來自近心端的血流。再用縫線繞過外頸動脈並用止血鉗拉緊以阻絕 回流的血流，將內頸動脈用縫線綁上活結阻絕腦部回流的血流。用 眼剪在外頸動脈剪個小洞 (距血管分插處約0.2公分) 後，稍微鬆開總 頸動脈以確定剪破血管。以導引勾(introducer)從血管剪開處將血管壁 勾起形成開口後將 Forgaty直徑2 Fr. (3 Fr. = 1 mm) 之氣球導管自開口 插入並往總頸動脈處平推約 3 公分左右。利用注射針筒並配合壓力測 定器的使用下，打入約1.3 ~ 1.5 kg/cm2 的氣體壓力使導管的氣球撐 大，然後來回三次破壞總頸動脈的血管壁，使其血管內皮剝離。最 後將氣球導管洩氣後抽出，用1 ml 注射針筒前端接細軟管由血管洞 口打入 heparin (150 unit/kg) ，隨後在血管洞口兩端綁上死結( 不可阻 礙內頸動脈的血液流動 ) ，最後，鬆開總頸動脈與內頸動脈的縫 線，並確認血液有流動後在大白鼠頸部肌肉注射 ampicillin (20mg/ ml) ，接著將頸部剪開部分以縫線縫合回去，擦拭優碘後將大白鼠 放回籠中待其甦醒即完成手術。手術後隔一天，將動物犧牲並取出 血液和血管，進行實驗 15、二維電泳 ( Two-Dimensional Electrophoresis ) 取出 7 公分之膠片電泳槽 , 並取 20 µg/µl的血漿蛋白質樣品加. 55.
(56) 入總體積 125 µl 的 Rehydration buffer 中混合均勻後,加入至膠片電 泳槽並利用蛋白質酸鹼度分佈在 4~7 之膠片以膠面朝下之方式將膠 片置於電泳槽上，並加入 1 ml 礦物油以防止 E.coli 標準品在跑電泳 時被蒸乾，接著放入電泳槽（PROTEAN IEF Cell）並且通入 50V 電 流以利蛋白質吸附至膠片上, 最後將條件設定 12 小時並累積電流 至 20000V , 分離蛋白質之酸鹼度一整個晚上,第二天時, 先配製 平衡緩衝液以供蛋白質變性之用 ,接著放入製備好的 10﹪SDS page , 並以 100 V 之條件來跑電泳 ,跑完電泳之膠片以 commassie blue 染色 20 分鐘後加入去染緩衝液(destain buffer)退染, 最後以影像處 理以分析之差異。. 第三章、結果 第一節、SDF-1a 對血管平滑肌細胞的影響 以 MTT 的方式評估評估 SDF-1a 對血管平滑肌細胞的影響 血管平滑肌細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，在含 0.5%胎牛 血清的刺激下，同步給予含有不同濃度的 SDF-1a，處理 24 小時. 56.
(57) 後，加入 MTT 反應 4 小時後，加入 solubilization solution，經隔夜 後使用 ELISA 測定吸光值，結果顯示(圖 11)，濃度在 4 ng/ml 下即 具有刺激血管平滑肌胞生長的情形，在濃度 10 ng/ml 下達最大量。. 第二節、DMSO 對血管平滑肌細胞的影響 以 MTT 的方式評估評估 DMSO 對血管平滑肌細胞毒性之影響 血管平滑肌細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，在含 10 %胎牛 血清的刺激下，同步給予含有不同濃度的 DMSO，處理 24 小時 後，加入 MTT 反應 4 小時後，加入 solubilization solution，經隔夜 後使用 ELISA 測定吸光值，結果顯示(圖 12)，濃度在 2 %以上的 DMSO 會導致細胞的毒性，而 0.1 % ~ 1% 則不會對細胞造成影響。. 第三節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對血管平滑肌細胞的影響 以 MTT 的方式評估評估 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對血管平滑 肌細胞生長之影響 血管平滑肌細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，在含 15 %胎牛 血清的刺激下，同步給予含有不同濃度的 Salvianolic acid B 及 Magnolol，處理 24 小時後，加入 MTT 反應 4 小時後，加入 solubilization solution，經隔夜後使用 ELISA 測定吸光值，結果顯示 (圖 13、14)，Salvianolic acid B 在濃度 0.01 mg/ml 時即具有抑制平滑 57.
(58) 肌細胞生長的情形，且具有劑量依附性(dose dependent)的現象； Magnolol 則是在劑量 0.05 mg/ml 時具有抑制平滑肌細胞生長的情 形，且也同樣的具有劑量依附性的現象。. 第四節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌 細胞生長的影響 以 MTT 的方式評估 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激 血管平滑肌細胞生長抑制之影響 血管平滑肌細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，在含 0.5 % 胎牛 血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl ，處理 24 小時後，加入 MTT 反 應 4 小時後，加入 solubilization solution，經隔夜後使用 ELISA 測定 吸光值，結果顯示(圖 15)，Salvianolic acid B 及 Magnolol 具有抑制 由 SDF-1a 所引起的血管平滑肌細胞增生的情形。. 第五節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌 細胞型態之影響 血管平滑肌細胞在經過 24 小時細胞週期同步化後，在含 0.5 % 胎牛 血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl 處理 24 小時後，以光學顯微鏡 58.
(59) 觀察並拍下血管平滑肌細胞型態改變情形，結果顯示( 圖 16)在 SDF-1a10ng/m 劑量刺激下，細胞生長的型態及情形與在 15% FBS 刺激下的情況相類似，而在加入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl 時，具有顯著抑制由 SDF-1a 所引起的血管平滑肌細 胞增生且其型態有改變的情形。. 第六節、以二維電泳觀察氣球擴張後老鼠血液中蛋白質的變化情形 以老鼠為動物模式，施行氣球擴張術後，隔天，將動物犧牲， 並收集血液中的蛋白質，以二維電泳的方式氣球擴張後，老鼠血液 中蛋白質的變化情形，由圖 17 可以觀察到在氣球擴張前後血液中 蛋白質具有顯著的變化情形。而這些蛋白質將於日後以 NALDI-TofTof 進一步定序確認。. 第七節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌 細胞中 CXCR4 的影響 以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 CXCR4 的影響 血管平滑肌細胞培養在 6 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 % 胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理 59.
(60) 30 分鐘後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後進行西方墨點轉 漬法，結果顯示(圖 18)，SDF-1a10ng/m 劑量刺激下 CXCR4 蛋白質 表現量顯著比控制組高，而在加入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnolol 時，可以有效的抑制由 SDF-1a 所引起的血管平 滑肌細胞中 CXCR4 蛋白質表現。. 第八節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌 細胞中 MAPK 路徑的影響 以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 MAPK 路徑的影響 血管平滑肌細胞培養在 6 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 % 胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理 30 分鐘後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後進行西方墨點轉 漬法，結果顯示(圖 19、20、21、22)，SDF-1a10ng/m 劑量刺激下 Raf、 MEK、Erk、pErK 蛋白質的表現量顯著比控制組高，而在加入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnolol 時，可以有效的抑制由 SDF-1a 所引起的血管平滑肌細胞中 Raf、MEK、Erk、pErK 蛋白質表 現。. 60.
(61) 第九節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌 細胞中 FAK 的影響 以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 FAK 的影響 血管平滑肌細胞培養在 6 well 的 culture dish 上在經過 24 小時細胞 週期同步化後，在含 0.5 %胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl ，處理 30 分鐘後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後 進行西方墨點轉漬法，結果顯示( 圖 23)，SDF-1a10ng/m 劑量刺激下 FAK 蛋白質的表現量顯著比控制組高，而在加入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl 時，可以有效的抑制由 SDF-1a 所 引起的血管平滑肌細胞中 FAK 蛋白質表現。. 第十節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌 細胞遷移( Migration )的情形 以傷口分析( Wound assay )觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞遷移的影響 血管平滑肌細胞培養在 24 well 的 culture dish 上在經過 24 小時細胞 週期同步化後，使用 tip 在 culture dish 上劃一道傷口，並加入含 0.5. 61.
(62) %胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及含有 0.075 mg/ml 、0.01 、0.005 、 0.00 1mg/ml 的 Magnololl，培養 24、48 小時後，加入 Lysis buffer 粹 取蛋使用光學顯微鏡觀察血管平滑肌細胞遷移的情形，結果顯示 (圖 24)，SDF-1a10ng/m 劑量刺激下顯著的使細胞遷移增加，而在加 入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及含有 0.075 mg/ml 、0.01 、 0.005、0.00 1mg/ml 的 Magnololl 後，可以有效的抑制由 SDF-1a 所引 起的血管平滑肌細胞遷移的情形。. 第十一節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑 肌細胞中 MEKK 路徑的影響 以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 MEKK 路徑的影響 血管平滑肌細胞培養在 6 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 % 胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理 30 分鐘後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後進行西方墨點轉 漬法，結果顯示(圖 25、26) ，SDF-1a10ng/m 劑量刺激下 JNK、pJNK 蛋白質的表現量顯著比控制組高，而在加入含有 0.075 mg/ml 的. 62.
(63) Salvianolic acid B 及 Magnolol 時，可以有效的抑制由 SDF-1a 所引 起的血管平滑肌細胞中 JNK、pJNK 蛋白質表現。. 第十二節、Salvianolic acid B、Magnolol 及 SDF-1a 對 NF?B promoter 轉殖至血管平滑肌細胞的表現情形 評估 Salvianolic acid B、Magnolol 及 SDF-1a 對 NF?B promoter 轉 殖至血管平滑肌細胞的表現情形 血管平滑肌細胞培養在 6 well culture dish 上 ，將 NF-?B promoterLuciferase Construct 和 ß-galactosidase Construct 轉殖進入血管平滑肌 細胞中，經過 24 小時細胞週期同步化後，在含 0.5 % 胎牛血清的刺 激 下 ， 同 步 給 予 含 有 10ng/ml 的 SDF-1a 及 含 有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl ， 處 理 24 小時後 ， 加入 1x reporter lysis buffer 將細胞的蛋白質抽出來測定 ß-galactosidase 的量以確定轉 殖的效率並當作 internal control 。 另 外 ， 在 測 量 NF-?B promoterLuciferase 表現量方面，結果顯示 ( 圖 27) ， SDF-1a10ng/m 劑量刺激 下可以促使 NF-?B promoter 大量表現，而在加入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl 時，可以有效的抑制由 SDF-1a 所 引起的 NF-?B promoter 表現的情形。. 第十三節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑 63.
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