Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌 細胞遷移( Migration )的情形

以傷口分析( Wound assay )觀察 Salvianolic acid B及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑肌細胞遷移的影響

血管平滑肌細胞培養在 24 well 的 culture dish 上在經過 24 小時細胞 週期同步化後，使用 tip 在 culture dish 上劃一道傷口，並加入含 0.5

%胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的 SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml的 Salvianolic acid B 及含有 0.075 mg/ml 、0.01、0.005、

0.00 1mg/ml的 Magnololl，培養 24、48 小時後，加入 Lysis buffer 粹 取蛋使用光學顯微鏡觀察血管平滑肌細胞遷移的情形，結果顯示 (圖 24)，SDF-1a10ng/m 劑量刺激下顯著的使細胞遷移增加，而在加 入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及含有 0.075 mg/ml 、0.01、

0.005、0.00 1mg/ml 的 Magnololl 後，可以有效的抑制由 SDF-1a 所引 起的血管平滑肌細胞遷移的情形。

第十一節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑 肌細胞中 MEKK 路徑的影響

以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 MEKK 路徑的影響

血管平滑肌細胞培養在 6 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 %胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的

SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理 30分鐘後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後進行西方墨點轉 漬法，結果顯示(圖 25、26)，SDF-1a10ng/m 劑量刺激下 JNK、pJNK 蛋白質的表現量顯著比控制組高，而在加入含有 0.075 mg/ml 的

Salvianolic acid B 及 Magnolol時，可以有效的抑制由 SDF-1a 所引 起的血管平滑肌細胞中 JNK、pJNK 蛋白質表現。

第十二節、Salvianolic acid B、Magnolol 及 SDF-1a 對 NF?B promoter 轉殖至血管平滑肌細胞的表現情形

評估 Salvianolic acid B、Magnolol 及 SDF-1a 對 NF?B promoter 轉 殖至血管平滑肌細胞的表現情形

血管平滑肌細胞培養在 6 well culture dish 上 ，將 NF-?B promoter-Luciferase Construct和 ß-galactosidase Construct 轉殖進入血管平滑肌 細胞中，經過 24 小時細胞週期同步化後，在含 0.5 %胎牛血清的刺 激 下 ， 同 步 給 予 含 有 10ng/ml 的 SDF-1a 及 含 有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B及 Magnololl， 處 理 24 小時後 ， 加入 1x reporter lysis buffer將細胞的蛋白質抽出來測定 ß-galactosidase 的量以確定轉 殖的效率並當作 internal control。 另 外 ， 在 測 量 NF-?B promoter-Luciferase表現量方面，結果顯示(圖 27)，SDF-1a10ng/m 劑量刺激 下可以促使 NF-?B promoter 大量表現，而在加入含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl 時，可以有效的抑制由 SDF-1a 所 引起的 NF-?B promoter 表現的情形。

第十三節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑

肌細胞中 caspase3 蛋白質的影響

以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 caspase3 蛋白質的影響

血管平滑肌細胞培養在 6 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 %胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的

SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理 24小時後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後進行西方墨點轉 漬法，結果顯示(圖 28)，Salvianolic acid B 可以促使 caspase3 蛋白 質的表現量增加。

第十四節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑 肌細胞中 Bax 蛋白質的影響

以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 Bax 蛋白質的影響

血管平滑肌細胞培養在 6 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 %胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的

SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理 24小時後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後進行西方墨點轉 漬法，結果顯示(圖 29)，Salvianolic acid B 和 magnolol 對於 Bax 並

不會造成任何的改變及影響。

第十五節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑 肌細胞中 Bcl-2 蛋白質的影響

以西方墨點轉漬法觀察 Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺 激血管平滑肌細胞中 Bcl-2 蛋白質的影響

血管平滑肌細胞培養在 6 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 %胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的

SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理 24小時後，加入 Lysis buffer 粹取蛋白質並定量後進行西方墨點轉 漬法，結果顯示(圖 30)，Salvianolic acid B 和 magnolol 會使 Bcl-2 的 含量減少，尤其以 magnolol的效果更加顯著。

第十六節、Salvianolic acid B 及 Magnolol 對 SDF-1a 刺激血管平滑 肌細胞引起細胞凋亡的情形

利用 DNA 電泳法來檢測 salivanolic acid B、Magnolol 對 SDF-1a 處 理後的血管平滑肌細胞引起細胞凋亡的情形

血管平滑肌細胞培養在 10 cm dish 上在經過 24 小時細胞週期同步化 後，在含 0.5 %胎牛血清的刺激下，同步給予含有 10ng/ml 的

SDF-1a 及含有 0.075 mg/ml 的 Salvianolic acid B 及 Magnololl，處理

48小時後，抽出 DNA 跑電泳觀察其引起細胞凋亡的情形，結果顯 示(圖 31)，Salvianolic acid B 及 magnolol 在加入細胞後培養 48 小時 後，發現其皆具有可以促使血管平滑肌細胞 DNA 斷裂的現象。

第四章、討論

對於粥狀動脈硬化疾病，一般而言最常見的治療是為病患施行 經皮穿腔內冠狀動脈血管形成術（PTCA），俗稱氣球擴張的介入 性療法，主要目的在使病患的症狀、運動量以及生活品質作大幅度

的改善。且近年來台灣從事氣球擴張的醫院、心臟科專家，以及病例 都快速增加，但是病人在施行完氣球擴張後會約有 30~50％的機率 具有再阻塞的現象，因此需要在進一步的作處置，這樣的結果不但 會對個人造成生命財產上損害，同時也會耗費許多的醫療資源及社 會成本。因此，目前對於心血管疾病的預防與治療方法的改進和研 發，是目前大家所共同努力的目標【74,75】。

在此篇實驗中首先使用 SDF-1a 這一個化學趨化因子來作為刺

激血管平滑肌細胞增生的因子，並使用物 salvianolic acid B 以及厚 朴萃取物 magnolol 來作為研究，丹參本身具有活血化瘀的效用，其 在中國傳統醫學中對於治療冠心病有著相當重要的地位，且現代的 藥理研究也證實了治療冠心病的效果，另外，salvianolic acid B 具 有抗脂質氧化並清除自由基的能力且能降低人的主動脈內皮細胞上 的 VCAM-1 和 ICAM-1 的表達【76,77】，因此，選用此藥物來探討化 學趨化因子對於平滑肌細胞增生的影響。在許多文獻中指 magnolol 具有很強的抗氧化能力其效果是維他命 C 的一千倍，也可以減少大 白鼠粒線體中的脂質過氧 化【69,78】，另外，也可以抑制 neutrophil 附著於細胞外間質效果及抑制心肌經缺血再灌流後所造成的心室心 律不整來保護心肌，且也有許多文獻皆證實了 magnolol 可以抑制在 氣球擴張後所引起的再阻塞現象【69,70,72,78,79】；另外從本實驗室

的蔡百榮及陳厚志學長研究結果得知厚朴及丹參的確能減少內膜增 生幅度，因此我們繼續探討 salvianolic acid B、magnolol 對於減少由 化學趨化因子造成平滑肌細胞增生的分子機轉及途徑，在此部分分 別以下幾個部分來討論：

第一部份 二維電泳觀察氣球擴張後老鼠血液中蛋白質的變化情形 以二維電泳觀察以老鼠為動物模式氣球擴張後，血液中蛋白質 的變化情形，由圖 17 可以觀察到在氣球擴張前後血液中蛋白質具 有顯著的變化情形。而這些蛋白質將於日後以 MALDI-Tof-Tof 進一 步定序確認。

第二部份 SDF-1a 對平滑肌細胞的影響

在許多研究皆指出CXC這一個化學趨化因子中的stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)及其專一性的接受器CXCR4與血管的新生和 發育有著重要調控的角色，且在Apolipoprotein E基因有缺陷的小鼠 在血管損傷後，SDF-1a會使得損傷處因為平滑肌細胞的增生而造成 造阻塞的現象【29】，因此認為SDF-1a及其專一性的接受器CXCR4 在粥狀動脈硬化過程及氣球擴張之後再阻塞的機制中扮演著重要的 角色，所以由MTT的實驗結果得知SDF-1a具有顯著的刺激血管平滑 肌細胞增生的現象，另外，在許多的研究皆發現SDF-1a 與CXCR4 receptor結合之後，最主要造成G-protein的活化，進而去影響細胞中

下 游 的 訊 息 因 子 ， 包 括 ： ERK/mitogen-activated protein kinase (MAPK)、 focal adhesion kinase (FAK) 、 extracellular-signal regulated kinases 1 and 2 (ERK-1 and -2) 、 protein kinase C (PKC) 、 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K)、Janus kinase signal、transcription (JAK/STAT) 和 活 化 nuclear factor ?-B (NF?B) 等 等 訊 息 因 子

【22,30,31,32】，而在Ayako Arai等人的研究中發現用IL-3及SDF-1a可 以共同刺激造血細胞及促進化學趨化的作用最主要是透過活化 Raf-1/MEK/Erk的路徑所引起的【85】，與本研究結果相類似，在西 方墨點轉漬法的結果發現，當細胞中加入SDF-1a後會使CXCR4蛋 白質表現量增加，進而接著影響1.MAPK pathway主要與細胞的曾生 和分化相關；2. focal adhesion kinase (FAK) pathway與細胞的遷移相 關；3.MEKK pathway與發炎反應相關這三個相關的訊息傳遞路徑

【22,30,31,32】。

在影響MAPK pathway的訊息傳遞上由圖19,120,21,22中可觀察到 Raf、MEK、 Erk及 p-Erk蛋白質的表現都是顯著增加的， 因此 ， SDF-1a調節細胞的增生或分化也許是經由MAPK pathway而調控 的；而FAK最主要決定了細胞的遷移，因此當SDF-1a增多時也許會 使細胞遷移的速度加快，所以由圖24中細胞遷移的實驗中也證實了 在加入SDF-1a 刺激之後，細胞遷移的速度確實會加速，且效果與用

高血清刺激的情況相似；在MEKK pathway的部分，主要是與發炎 反應有相關，而其相關蛋白質活化的順序為JNK、p-JNK、NF-?B，而 在許多研究中皆發現在施行氣球擴張術後NF-?B會活化，而且當以 抑制劑減弱NF-?B/Rel的活性及抑制NF-?B promoter transactivation情 況下可以有效減少血管平滑肌細胞的增生並具有預防新生內膜形 成，另外也發現由當protein kinase C signaling及NF-?B結合活性的減 少時可以促使NO的釋放而引起的細胞凋亡【80,81,82】。因此NF-?B對 於restenosis的形成來說是相當重要。由圖25、26發現使用SDF-1a刺激 平滑肌細胞可以使JNK、p-JNK蛋白質的表現量增加，而由Luciferase assay的結果看來，SDF-1a 可以促使NF-?B promoter活性的表現，因 此，由這些結果推論認為在加入SDF-1a後會促使細胞發炎因此而導 致不正常的增生或是遷移現象，促使動脈週狀硬化或是氣球擴張後 的再阻塞現象發生。

第三部分 salivanolic acid B及magnolol對由SDF-1a刺激平滑肌細胞 增生抑制的影響

首先在以 MTT 的實驗方式來篩選藥物劑量，發現 salivanolic acid B及 magnolol 具有顯著抑制平滑肌細胞增生的效果，且具有 dose-dependent的現象，因此，接著使用 SDF-1a 刺激細胞的增生並且同

時給予 salivanolic acid B 及 magnolol 後，發現此兩種中草物粹取物 可以顯著的抑制由 SDF-1a 所以起細胞增生的現象， 而在 MEKK

時給予 salivanolic acid B 及 magnolol 後，發現此兩種中草物粹取物 可以顯著的抑制由 SDF-1a 所以起細胞增生的現象， 而在 MEKK