摘要
高山生物的分化及擴散是生物地理研究有趣且重要的領域。在本 章中以阿里山山椒魚為模式物種來研究山脈形成時的地理隔離事件 及山脈間的擴散。我使用粒腺體 DNA 的遺傳標記來追溯阿里山山椒 魚的演化歷史。以 AMOVA 分析顯示大部分的遺傳變異分配在山脈之 間，但山脈內族群及族群內的遺傳變異也佔相當的比例。以不相合分 布(mismatch distribution)分析顯示在阿里山山脈的族群呈現族群數量 增加的現象，其餘二個山脈是穩定但是有明顯的結構。以 Nested Clade Analysis 分析顯示幾乎所有的族群都是有限基因交流。最後我們以 Bayesian coalescent approach 來推論每一個主要 clade 的分歧時間，並 嚐試初步推測其親緣地理關係。
關鍵詞：阿里山山椒魚、遺傳結構、山脈、基因交流
Abstract
The vicariance and dispersal of alpine animals is an interesting and important area of biogeographical research. In this chapter I use Hynobius
arisanensis as a model species to investigate both the vicariant event that
occurred when the mountain ranges formed and the dispersal across the mountain. I used mitochondrial DNA markers to retrace the evolutionary history of H. arisanensis. AMOVA of three mountain ranges suggested significant genetic differentiation among mountain ranges, among populations within mountain ranges, and within populations. Mismatch distribution analysis showed that populations within Alishan range exhibited a pattern of demographic expansion. Nested clade analysis indicated that study populations showed restricted gene flow or allopartic fragmentation. We also used Bayesian coalescent approach to estimate the divergence time and to inference their phylogeographic relationships.Key words: Hynobius arisanensis; genetic structure; mountain ranges;
gene flow.
前言
從 1960 年代開始，當異構酶的研究應用後，對自然族群的遺傳 結構型式的研究開始大量增加(Avise 1974; Larson et al. 1984)。相關研 究後來以粒腺體 DNA(mtDNA)作為通用的工具來解構不同分類群在 其地理分布範圍中的種內遺傳分歧型式(Hare 2001; Zhang & Hewitt 2003)。因為大量數據的累積，為比較研究提供了發展舞台，最後興 起 了 新 學 門 如 比 較 親 緣 地 理 學 (comparative phylogeography, Bermingham & Moritz 1998; Avise 2000)。比較親緣地理學的目的是從 具有共同地理背景的許多分類群中，以互相獨立的基因樹的共通型式 來推論可能共有的生物地理事件。例如比較研究已經被用於辨認影響 許多生物的主要歷史事件(Schneider et al. 1998; Riddle et al. 2002)、推 論 Pleistocene 冰河期時避難所(refugium)的位置以及回暖期時可能的 再拓殖(recolonization)路徑(Hewitt 1999)，與提供有關於保存演化型式 及過程的管理政策的資訊(Moritz et al. 2001)。
過去十年來對於台灣生物的親緣地理學研究數量增加很多，以脊 椎 動 物 為 例 有 哺 乳 類 的 赤 腹 松 鼠 (Callosciurus erythraeus)(Oshida 2006) ； 兩 生 類 的 梭 德 氏 蛙 (Rana sauteri)( 陳 ， 1994) 、 莫 氏 樹 蛙 (Rhacophorus moletrechti)(葉，1997)、澤蛙(Rana limnocharis)(Toda et al.
1998)及拉都希氏蛙(Sylvirana latouchii)(Jang-Liaw et al. 2008)；爬蟲類
的斯文豪攀蜥(Japalura swinhonis)(劉，1994)、台灣草蜥複合種群 (Takydromus formosanus species complex)(Lin 2003)；淡水魚類的高體 鰟 鮍 (Rhodeus ocellatus) 、 革 條 副 鱊 (Tanakia himantegus) 、 羅 漢 魚 (Pseudorasbora parva)、菊池氏細鯽(Aphyocypris kikuchii)、何氏棘魚八 (Spinibarbus hollandi) 與台 灣白 甲魚 (Onychostoma barbatulus)( 繁，
2001)。這些研究多以廣泛分布於台灣全島的物種作為模式生物，探 討中央山脈形成如何造成生物在台灣東西部的分化。至於生活在高山 中的生物如何受到山脈阻隔的影響的研究仍是相當缺乏，脊椎動物中 僅見高山白腹鼠(Niviventer culturatus)(Hsu et al. 2000)、台灣森鼠 (Apodemus semotus)(Hsu et al. 2001) 、 台 灣 蜓 蜥 (Sphenomorphus
taiwanensis)(郭，2002)、短尾鼩（Anourosorex squamipes）(袁，2003)
及標蛇(Achalinus niger)(謝，2006)。有尾類(Caudata)提供了檢測生物地理障礙對生物的影響一個很 好的系統(Martinez-Solano et al. 2007)，其理由如下：(1)古老的類群，
例如在北美洲已經存在了 4000 萬年；(2)他們定棲性很強，一般的活 動範圍是脊椎動物中已知最小的(小於 10 m)；(3)某些種類分布非常侷 限，對於找出特有性區域是非常有價值的，而一些種類的地理分布非 常廣，提供測試大範圍地理區的生物地理故事。例如 Carranza &
Arnold (2004) 以 環 繞 地 中 海 地 區 分 布 的 波 氏 肋 突 螈 (Pleurodeles
poireti)及瓦氏肋突螈(P. waltl)來探討整個地中海區的地質歷史對物種
分化的影響。而 Martinez-Solano et al. (2007)則以蜥尾螈(Batrachosepsattenuates)來探討北美洲西部的生物分布的主要障礙。
台灣的山椒魚分布在高山，受到其本身對低溫與潮溼森林環境的 需求，加以其有限的行動能力，往往山脈之間較低海拔的地區成其分 布的障礙。台灣的山椒魚大致符合前段的特徵，特別是悠久演化歷史 (第二章)及極度的低活動性(賴和呂，2007)，我們預期山椒魚的 mtDNA 變異的型式可以反應他們居住地理區的複雜地理事件。
台灣有五個主要的山脈，分別由西向東分別為阿里山山脈、玉山 山脈、中央山脈、雪山山脈及海岸山脈，而前四者有時合稱為中央山 脈(廣義)或脊樑山脈。阿里山山脈北起南投縣集集鎮的濁水溪南岸，
南抵高雄縣燕巢鄉的雞冠山。稜脊大致呈現北北東──南南西的走向，
長約 250 公里，平均高度 2500 公尺。玉山山脈則北起玉山山塊，南 抵高雄縣的六龜鄉十八羅漢山附近，是台灣五大山脈中最短者。玉山 山脈的東側為中央山脈南端，兩者隔老濃溪為界；西側則隔著楠梓仙 溪，與阿里山山脈為鄰。中央山脈(狹義)北起宜蘭縣北方澳，南抵台 灣本島最南端的鵝鑾鼻，呈北北東至南南西走向，縱貫全島，為全島 最長的山脈。在本研究中，我們以跨中央山脈、阿里山山脈及玉山山
圖 5-1、阿里山山椒魚取樣地點圖。
表 5-1、阿里山山椒魚取樣地點的資訊及樣本數表。
簡碼 樣本數 地點 縣市 緯度 經度 海拔(m) 山脈
AL 20 姐妹潭 嘉義縣 23°31’ 120°48’ 2,260 阿里山
DP 6 大埔林班 嘉義縣 2600830 230609 2320 阿里山
ZZ 8 自忠 嘉義縣 23°28’ 120°50’ 2,310 阿里山
SM 12 神木林道 南投縣 23°29’ 120°52’ 2,580 玉山
LL 4 鹿林山 南投縣 23°28’ 120°52’ 2,680 玉山
YF 8 圓峰 高雄縣 23°27’ 120°56’ 3,620 玉山
YK 8 埡口 台東縣 23°16’ 120°58’ 2,640 中央
SY 2 向陽 台東縣 23°15’ 120°59’ 2,950 中央
WL 1 霧鹿 台東縣 23°08’ 121°01’ 2,122 中央
脈分布的阿里山山椒魚(Hynobius arisanensis)為對象，主要的目的在 重建阿里山山椒魚族群演化的歷史，同時對主要分歧事件定年。
為了瞭解山脈是否有效的阻隔了族群間的基因交流，我們使用傳 統的 F statistic approach (Wright, 1951)來瞭解分化的情形。再者，我 們檢視阿里山山椒魚的 demography 歷史，使用 mismatch distribution
及 neutrality tests (Fu, 1997; Tajima, 1989)。並且以 Bayesian coalescent approach 來推論每一個主要 clade 的分歧時間。
材料及方法 取樣地點(Sampling sites)
我們總共收集 9 個族群 65 個體的阿里山山椒魚的尾部肌肉組織 (圖 5-1 及表 5-1)。由於山椒魚個體量相當稀少，所以我們儘量收集所 能採到的個體，以增加樣本量。但是無可避免的在幾個族群如向陽山 屋及霧鹿的數量很少，雖然數量少在計算遺傳多樣性時會有偏差，但 是對地理親緣關係的推論應該還是可以提供有用的資訊，特別是考量 不連續族群之間的連結時。
DNA 萃取、放大及定序(DNA extraction, amplification and sequencing)
我們從酒精保存的肌肉組織中抽取 total genomic DNA 利用 Proteinase K 消化及氯仿-酒精抽取法(Hillis et al., 1996)。我使用引子 MVZ15L 及 MVZ16H (Moritz et al., 1992)來放大並定序 784 鹼基對的 粒腺體 cytochrome b (cyt-b)基因的部分序列，以及使用引子 LCO1490 及 HCO2198(Herbert et al. 2003)來放大並定序 658 鹼基對的粒腺體 cytochrome oxidae subunit I(coi)基因。PCR 的反應溶液組成如下：0.5-1
μl dilute DNA、0.1 μM each primer、40 μM dNTPs、standard Taq polymerase buffer (1.5 mM MgCl2)及 1U Taq polymerase，總體積為 20 μl。 反應狀況在 cyt-b 為 94℃3 分鐘；40 個循環的 94 ℃ 30 秒、48 ℃1 分鐘及 72℃1 分鐘，最後一個循環是 72℃10 分鐘。而 coi 的黏合溫 度為 5248 ℃。PCR 產物接著用作直接 DNA 定序反應的模板。產物 的 兩 股 皆 以 Big-Dye Terminator Sequencing Kit (PE Applied Biosystems)用 PCR 反應同樣的引子來定序。定序產物在 ABI 377 自 動定序分析儀(PE Corp.)中進行分析。
遺傳多樣性(Genetic diversity)
基 因 型 多 樣 性 (haplotype (Hd) (Nei 1987)) 及 序 列 多 樣 性 (nucleotidediversity (π)(Nei1987))使用 DnaSP ver.4.5 軟體(Rozas et al.
2003)來計算。我們也用 ARLEQUIN ver.3.11 軟體(Excoffier et al. 2005) 由 分 離 位 點 (segregating sites, S) 估 算 了 序 列 歧 異 指 數 (index of nucleotide divergence (θ))。Θ是有效族群量(effective population size (Ne))及突變率(mutation rate(μ))的函數，在二倍體生物的胞器基因中 等於 2Neμ。為了決定阿里山山椒魚的族群歷史(demographic history)，
我們計算了 Tajima's D (Tajima 1989)及 Fu's F (Fu 1997)，這些指數被 認為對偵測族群增加相當敏銳。此外，三個山脈族群兩兩序列間核苷 酸數差異不相合分布(mismatch distributions)用來評估阿里山山椒魚
的族群統計歷史。不相合分布若呈現單峰分布(unimodal distribution) 表 示 族 群 在 最 近 有 族 群 量 或 者 地 理 上 的 擴 張 事 件 (expansion event)(Excoffier 2004; Ray et al. 2003)。若是族群在 deme 數目固定時 曾進行過族群量或地理上的擴張將會有單峰分布，而多峰分布表示一 個處於平衡狀態下的族群的隨機狀態。Tajima's D、Fu's F 及不相合分 布皆在 ARLEQUIN ver.3.11 (Excoffier et al. 2005)中計算。
族群遺傳結構(Population genetic structure)
我 們 使 用 分 子 變 方 分 析 (Analysis of molecular variance (AMOVA))來檢測 遺傳變異度在山脈內族群間及山脈間的分配量 (Excoffier et al. 1992)。這個分析以 Kimura's (1980) two-parameter distance 基因型矩陣為基礎。族群分組依據以下的山脈(表 5-1)：(1) 中央山脈；(2)玉山山脈；(3)阿里山山脈。族群間及山脈間的遺傳分 化以兩兩間計算的 FST值來估算。族群間的基因交流(Gene flow (Nm)) 以 FST 的倒數來估算。以上所有分析皆在軟體 ARLEQUIN ver.3.11 (Excoffier et al. 2005)中以 1000 次的 permutations 來運算以得到檢測統 計值。
分歧時間估算(Divergence time estimates)
我們使用 Bayesian coalescent approach 來估算每一個由 mtDNA
合併數據所找出的 subclade 的最近共祖時間(Time to the most recent common ancestor, TMRCA)。以 BEAST 1.4.7 (Drummond & Rambaut 2007)軟體來估算分歧時間。估算的條件為：relaxed clock model with uncorrelated lognormal distribution (Drummond et al. 2006)、mutation rate 依 據 Weirsrock (2001) 對 小 鯢 科 之 估 算 值 設 定 為 0.0128 mutations/site/Myr 、 序 列 演 化 模 式 為 GTR+G 、 Bayesian skyline coalescent model of population size with 10 groups。所有分析進行 1x107 代 ， 每 1000 代 取樣 。 最 後 再 以 軟體 TRACER 1.4 (Rambaut &
Drummond 2007)來觀察參數的聚斂性及穩定性後，決定 burn-in 的數 目。同時看整個物種的數量變化趨勢。
親緣關係分析(Phylogenetic analyses)
我們使用 Bayesian Inference (BI)及 Nested Clade Analysis (NCA) 來重間基因型間的親緣關係。BI 以 MrBayes ver.3.1 (Ronquist and Huelsenbeck 2003)來運算，其設定如下：位點間變異模型為‘invgamma'、 世 代數 (Ngen) 為 10 million 、 取 樣 頻 率 為 100 steps 、 heated chain temperature parameter 為 0.2、而 burn-in 為 1000 樣本。使用 MINSPNET (Excoffier and Smouse 1994)來進行 NCA。使用 GeoDis ver. 2.0 (Posada et al. 2000)來進行 permutation tests 以決定遺傳或地理分布間是否有顯
著相關。然後再使用 Templeton's (2004) inference key 到結果中以決定 NCA 的結果。
結果 遺傳多樣性
我們合併 cyt-b 及 coi 的變異來檢視遺傳多樣性估算及族群統計 歷史。在 9 個阿里山山椒魚的族群間，我們總共找到 30 個基因型 (haplotypes)，這 30 個基因型在族群間的分布見表 5-2，其中 H03、
H08 及 H12 為族群間共有。這 30 個基因型含有 48 個變異位點，基 因型歧異度(Hd)為 0.961 (S.D. = 0.010)(表 5-2)。全部研究族群的序列 多樣性(π)為 0.0071 (S.D. = 0.0004)，而整個族群的 θ為 21.230 (S.D. = 4.811)。我們將族群依山脈分組計算遺傳多樣性(表 5-2)。在山脈的層 級，三個山脈之間都有相似的高度遺傳多樣性。阿里山山脈的 Hd (0.911)最高，而中央山脈的 Hd (0.822)最低。在核苷酸多樣性的層級，
玉山山脈最高(π = 0.00494)而中央山脈最低(π = 0.0013)。以分離位點 估算的 θ值在阿里山山脈(4.112±1.642)及玉山山脈(6.077±2.454)顯著 高於中央山脈(2.363± 1.492)。阿里山山脈及玉山山脈與中央山脈之間 θ值的顯著差異代表他們的遺傳分布上是不平均的，而這反應了這些
表 5-2、阿里山山椒魚族群的遺傳分析所得到的基因型在取樣地點中的分布表，
表 5-3、阿里山山椒魚族群的遺傳多樣性指標、Tajima’sD與 Fu’sF tests。族群的
表 5-3、阿里山山椒魚族群的遺傳多樣性指標、Tajima’sD與 Fu’sF tests。族群的