行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
仿生奈米化之生醫材料表面對於骨母細胞的行為之影響評
估
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2214-E-002-035- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學化學工程學系暨研究所 計畫主持人： 蔡偉博 計畫參與人員： 鄭育慧、周軒弘 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 11 月 30 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
■ 成 果 報 告
□期中進度報告
仿生奈米化之生醫材料表面對於骨母細胞的行為之影響評估
計畫類別：■個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC 93－ 2214 － E － 002 － 035 － 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 計畫主持人：蔡偉博 計畫參與人員： 鄭育慧、周軒弘 成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告 本成果報告包括以下應繳交之附件： □赴國外出差或研習心得報告一份 □赴大陸地區出差或研習心得報告一份 □出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 □國際合作研究計畫國外研究報告書一份 處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫及下列情 形者外，得立即公開查詢 □涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢 執行單位：台灣大學化工系 中 華 民 國 94 年 10 月 31 日中、英文摘要及關鍵字
中文摘要
膠原蛋白(Collagen)，是多細胞動物體內含量最多的蛋白質，幾乎存在於所有組織中。 膠原蛋白被廣泛應用在醫學上之生醫材料，如組織生長、燒燙傷敷料、傷口癒合等。本研 究的目標在於探討膠原蛋白的型態，和 glycosaminoglycan（GAG）對於硬骨細胞貼附、生 長與功能的影響。我們在材料（TCPS）表面上，塗佈膠原蛋白(soluble collagen)、纖維狀膠 原蛋白(fibrous collagen)、在高溫下變性膠原蛋白（denatured collagen），再將硬骨細胞接種 在上面，觀察細胞在不同表面上的貼附量、細胞型態、生長情況，以及功能表現。我們發 現，一般膠原蛋白對於促進細胞貼附及生長效果比纖維狀膠原蛋白和變性膠原蛋白好，同 時其鹼性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）活性比較大。此外，我們也發現將膠原蛋白與肝素 （heparin；HE）同時塗佈在材料上時，當肝素濃度為 0.02 mg/ml 時，對於細胞貼附的促進 效果最佳。英文摘要
Collagen is the most abundant protein in mammals, and exists in almost all the tissue types. Collagen is widely used in biomedical applications, e.g., tissue growth, wound dressings. This study is focused on the effects of the conformation of collagen and glycosaminoglycan on osteoblast adhesion, growth, morphology and functions. We found that soluble collagen is better than fibrillar collagen and denatured collagen on cell growth and alkaline phosphatase activity. Furthermore, we found that when collagen was coated on a surface with heparin, cell adhesion was best when heparin concentration was 0.02 mg/ml.
關鍵字
前言
膠原蛋白是多細胞動物體內含量最多的蛋白質，幾乎存在於所有組織中。膠原蛋白被 廣泛應用在醫學上之生醫材料，如組織生長、燒燙傷敷料、傷口癒合等。不過膠原蛋白的 形態對於細胞的影響之研究並不是非常多，因此本研究將探討膠原蛋白的奈米級結構對於 骨母細胞的功能之影響。研究目的
本研究計畫的目的是研究仿生奈米材料表面結構，對於細胞貼附、生長以及基因表現 的影響。利用膠原蛋白在不同的環境下，會形成不同的型態，探討對於骨母細胞的貼附、 生長以及基因表現的影響。文獻探討
生醫材料，顧名思義，是指會與生物系統相接觸的材料。在生物系統中，生醫材料主 要接觸的對象為蛋白質和細胞。細胞與生醫材料之間的交互作用，對於醫療植入物 （implants）、組織工程（tissue engineering）和以細胞為基礎的生物感應器（cell-based biosensors）等方面應用，是非常重要的(Castner and Ratner, 2002; Hubbell, 1995; Kasemo, 2002)。在醫療植入物方面，一般廣泛接受，就是組織和生醫材料之間的交互作用，攸關 醫療植入物是否能夠維持長期的表現。舉例來說，許多作為重建用的髖關節或是牙科的醫 療植入物，必須和周圍的組織緊密地結合在一起，才能夠發揮應有的機械功能，細胞在其 中扮演極重要的角色。此外，組織工程必須經由細胞在人工支架（scaffolds）上的生長， 才能產生具有功能的新生組織。細胞接觸到材料後，可能會有貼附、生長、分泌生物分子、 移動和計畫性死亡（apoptosis）等行為，如果要達成功能，細胞必須依照其在自然組織中 的情況，執行該有的功能，但是人造材料的表面，對於細胞往往是陌生的，因此細胞做出 了與其在自然組織內大不相同的行為，而造成醫療器材的功能損害，甚至於危及病患的生 命。所以無庸置疑地，欲發展成功的醫療器材，控制細胞和生醫材料之間的交互作用是非 常重要的。 人體的細胞並不是生來就是為了適應人造的世界，細胞在歷經了億萬年的演化，得以在自然界生存，知道如何依據周圍自然環境的改變，做出適當的反應。但是當細胞首次遇 到人造的材料，它仍然使用自然的反應系統，來處理這一個不熟悉的非自然世界。因此， 細胞往往會不知所措，做出了錯誤的反應。所以當一個人造的醫療植入物放進人的身體 內，可能會引起身體產生不良的反應，造成醫療器材的失效，甚至會危害到患者的生命。 為了發展理想的生醫材料或是醫療器材，全球的研究者，所採取的策略，常常是朝向模擬 自然的世界。因此瞭解細胞和細胞外的環境之間的交互作用的機制，是發展理想的生醫材 料的第一步。 在這個機制中，有一點特徵是，細胞和自然界的溝通，所使用的信號分子，都是奈米 級的大小。人類細胞的大小，依照其種類不同，約在 10-30 m 左右，雖然有些例外，如 受精卵細胞約為 100 m。不過細胞似乎能夠感應尺寸比之小許多的信號，甚至於是幾個 奈米大小的信號。從圍繞在細胞周圍的世界，其尺寸是以奈米來計算，就可以推測。例如 葡萄糖（glucose, M.W. 180 Da）的大小大約是 1 nm，白蛋白（albumin, M. W. 65,000 Da） 的大小約為 6 nm，細胞外基質蛋白質的大小也是奈米級的。此外細胞膜表面與外界接觸的 受器（receptors）的大小，也是奈米級的，因此可以推斷細胞和自然界的交互作用，是在 奈米層次的。因此生醫材料的仿生化和奈米化，或許是一個正確的發展方向。 我們先來瞭解在人類組織中，細胞與細胞外環境的作用機制。在多細胞生物中（包括 人類），大多數的細胞都是特殊分化的（differentiated），並且有計畫地結合在一起，形成 組織或是器官，一同合作來完成特定的工作。這些細胞在組織中能夠結合在一起，是經過 一些細胞與細胞外物質間特殊的交互作用。在某些組織中，細胞是靠著細胞膜上的蛋白 質，和周圍細胞上的蛋白質相互作用，而彼此靠在一起。舉例來說，表皮組織（epithelium） 就是由表皮細胞一個個依偎著，形成一個多細胞的薄片狀（sheet）組織。不過，人體內大 多數的組織，是靠著另一個複雜的網絡，叫做「細胞外基質」（the extracellular matrix，
ECM），細胞藉由附著在細胞外基質上，相連形成組織，因此細胞外基質實際上作為細胞
膠（cellular glue），將細胞和組織連在一起，同時又提供一個有組織的格狀結構（lattice）， 讓細胞可以在其間移動，或是和其他的細胞互動。細胞外基質的基本成分包括膠原蛋白, 醣 蛋白（glycoproteins）、彈性蛋白（elastin）、玻尿酸（hyaluronic acid）、proteoglycans 和 glycoaminoglycans (Olsen, 2000)。細胞外基質也有聚集生長因子（growth factors）和細胞 素（cytokines）的功能，可以調控周圍細胞的生長。因此細胞外基質的主要功能，包括提
供固定細胞的機械性支持、細胞移動時的導引、控制細胞繁殖和計畫性死亡、維持細胞分 化、提供組織重建的支架和建立組織內的微環境（microenvironment）等等。
細胞外基質有兩種形式： interstitial matrix（例如在結締組織中）和 basement membrane
（例如在表皮組織和內皮組織），細胞外基質的成分和結構，會依組織的型態而有所不同。
在結締組織中，例如軟骨和韌帶，細胞外基質是組織的主要成分，細胞只佔少許的體積， 散居在細胞外基質內。細胞外基質中有豐富的纖維狀生物巨分子（fibrous
biomacromolecules），特別是膠原蛋白（collagens）和彈性蛋白。在結締組織內，細胞就直 接和細胞外基質中的生物巨分子結合，而很少互相連結。相對地，在表皮組織中，表皮細 胞層是附著於一種特殊的細胞外基質上，叫做基膜（basement membranes 或 basal lamina）， 這是一層柔韌的、如薄毯狀的結構（大約 40-120 nm 厚）。大多數的基膜中含有一些特殊 的細胞外基質巨分子，例如第四型膠原蛋白、基膜素（laminin）、entactin，和大的 heparin sulfate proteoglycan perlecan。其中基膜素（laminin）連接上皮細胞或是內皮細胞到基膜上 (Gospodarowicz et al., 1981)。研究顯示，眼角膜的基膜之巨分子成分，可以影響上皮細胞 的形狀和附著(Ohji et al., 1993; Olivero and Furcht, 1993)、繁殖 (Trinkaus-Randall et al., 1988)、移動(Nakamura and Nishida, 1999; Olivero and Furcht, 1993)、分化和合成組織特定 之蛋白質(Trinkaus-Randall et al., 1988)、以及內皮細胞的繁殖(Blake et al., 1997)。
細胞附著在其周圍的細胞外基質，對於調節細胞的型態、移動、生長、計畫性死亡和 分化，是非常重要的。細胞膜表面有一種蛋白質受器，integrins，對於細胞固定在細胞外 基質上，扮演重要的地位(Hynes, 1992)。Integrins 可以結合細胞外基質的附著性蛋白質 （adhesive proteins），例如 fibronectin 和 vitronectin，透過這些蛋白質上特殊的氨基酸序列 Arg-Gly-Asp（RGD），integrins 可以和這些蛋白質的結合，在細胞生理中扮演重要的角色， 例如胚胎發育、免疫反應、白血球移動和腫瘤轉移。另外在體外細胞培養時，細胞能夠附 著在塑膠培養皿上，也是透過血清中的附著性蛋白質先吸附在材料表面上，再經過細胞膜 上的 integrins 來媒介細胞貼附(Underwood and Bennett, 1989)。
先來看看在結締組織中，細胞所看到的是怎樣的環境。膠原蛋白是哺乳動物體內組織 中的主要成分，也是結締組織中的主要成分。它是一個包含許多成員的家族，功能從提供 骨頭、皮膚、韌帶和筋等組織中，所需要的生物機械性能，到控制細胞在組織發展時的基 因表現。一個典型的膠原蛋白分子是由三條胜肽鏈（polypeptide）所組成，每一條胜肽鏈
都有一個共通的氨基酸序列―(-Gly-X-Y-)n，其中 X 代表任何氨基酸，通常是 proline；而
Y 代表任何氨基酸，通常是 hydroxyproline。三條膠原蛋白胜肽鏈互相糾纏在一起，形成 一個右旋的超螺旋結構（superhelix），其直徑大約是 1.5 nm，長度為 280 nm。當膠原蛋白 從細胞分泌出來，到細胞外的空間時，膠原蛋白分子會在組合成 fibrils，其直徑為 50-300 nm (Li, 1995)。此時膠原蛋白分子的排列，造成膠原蛋白纖絲（fibrils）特有 banding pattern， 從穿透式電子顯微鏡的影像，可以觀察到 67 nm 長的重複條紋。膠原蛋白纖絲會在進一步 組成更大，像電纜狀的的膠原蛋白纖維（fibers），此時直徑大約是 1-4 。從以上的描m 述我們可以瞭解，細胞在結締組織中看到景象，多是奈米結構的膠原蛋白分子。.
另外，在外皮或是內皮組織中，細胞看到基膜的地形特徵（topographic feature）也是 在奈米等級。眼角膜基膜的結構曾經被利用掃瞄式電子顯微鏡、穿透式電子顯微鏡和原子 力顯微鏡（atomic force microscopy）觀察過(Abrams et al., 2002; Abrams et al., 2000; Abrams et al., 2000)。基膜的外表看起來像是網狀的結構，其中纖維交織出許多奈米級孔洞以及高 低起伏。在恒河喉的眼角膜的基膜之纖維大小，約從 24 nm 到 183 nm，平均值為 77 nm； 孔洞大小從 22 nm 到 216 nm，平均值為 71 nm；表面平均起伏為 149±60 nm (Abrams et al., 2000)。這樣奈米的表面可以將上皮細胞和基膜接觸面積增加 60%。我們可以合理的推測， 這樣的奈米表面會影響上皮細胞的行為，至少在表面積上的增加，可以提高細胞和基膜表 面接觸的程度。 到目前為止，研究細胞和細胞外基質的交互作用機轉，大多集中在細胞外基質巨分子 所提供的化學信號，特別是細胞膜表面的受器 integrins，和細胞外基質蛋白質中的某些具 有特殊辨識的胜肽鏈序列（例如 RGD）之間的結合，所產生對於細胞的影響。相對地， 很少有文獻探討細胞外基質或是其中巨分子的奈米結構，例如基膜的地形對於細胞所產生 的影響。許多人可能會懷疑，細胞是否會對小到奈米等級的表面地形產生反應，可是從細 胞的生存環境皆是奈米大小的分子，沒有理由忽略這種可能性，事實上，從細胞在一些人 造材料上的研究中，可以看出奈米表面結構，對於細胞的行為，例如貼附、定向 （orientation）、移動、繁殖以及蛋白質的表現都有影響，因此可以推論，細胞外基質的天 然地形（topography）對於細胞的行為會有一定的影響。 生醫材料表面的奈米粗糙度對於細胞的影響
生醫材料在加工時，其表面很難達到在分子的層次上的平坦度，因此細胞和生醫材料 接觸時，無可避免地會接觸到一個具有高低起伏的表面，以一般實驗室中常用的聚丙烯細 胞培養皿（tissue culture polystyrene）為例，其表面就有深約 10 nm 的刻痕(Curtis and Wilkinson, 2001)。由於細胞在組織內，已經習慣了奈米結構的粗糙環境，因此如果說細胞 會對生醫材料表面的粗糙程度產生反應，這也不足為奇了。最簡單的研究，是利用腐蝕性 的溶液來改變生醫材料表面的粗糙程度，再來研究細胞對於不同粗糙度的表面之反應。例 如，使用傳統溶劑鑄造（solvent casting）法而成的 PLGA 膜（poly lactic-co-glycolic acid membrane），其表面粗糙度約為 21.81 nm，經過氫氧化鈉（NaOH）溶液浸泡一段時間後， 其粗糙度會增加，例如增加到 70.30 nm 或 206.14 nm，這樣的改變就顯著地增加了膀胱平 滑肌細胞（bladder smooth muscle cells）貼附在上面的數目(Thapa et al., 2003)。在另一個實 驗中，Miller 等人也發現膀胱或是主動脈平滑肌細胞的貼附程度，在經過化學處理的 PLGA 膜上（粗糙度為 206.14 nm），也比沒有處理過的 PLGA 膜（粗糙度為 21.80 nm）為高(Miller et al., 2002)。但是不同的細胞種類，對於表面粗糙度的反應可能會不同，例如主動脈的內 皮細胞在經過化學處理的 PLGA 膜上的貼附，就比沒有處理過的 PLGA 膜（粗糙度為 21.80 nm）為差(Miller et al., 2002)。Fan 等人也發現，神經細胞在矽晶片上的貼附情形，以粗糙 度為 20 到 50 nm 為最好(Fan et al., 2002)，增加或是減少奈米粗糙度，都會減少神經細胞 的貼附。因此細胞對於材料表面的奈米粗糙度的反應，會隨著細胞的種類而有所不同。 細胞在材料表面上的伸展（spreading），也受到材料表面的奈米粗糙度之影響。Dalby 等人將聚苯乙烯（polystyrene）和聚溴苯乙烯（poly-bromo-styrene）混合，塗佈在材料表 面上，製造出一些高低不等的島狀結構。他們發現，纖維母細胞（fibroblasts）在具有 13-nm 高的島狀結構材料表面上的伸展，比在平坦的表面上更大(Dalby et al., 2002)。從以往細胞 生理學的研究中也發現，細胞在材料表面上的伸展程度和細胞的繁殖能力是有正向關聯性 的，當內皮細胞在材料表面上的伸展受到抑制時（在平坦的表面上），其繁殖能力也受到
了抑制(Nelson and Chen, 2003)。此外在纖維母細胞(Dalby et al., 2002)和類內皮細胞(Dalby et al., 2002)上也發現同樣的現象。
材料表面的奈米粗糙度對於細胞的基因表現也有影響。曾經有研究，利用 DNA 微陣 列（DNA microarrays），針對纖維母細胞在平坦的表面和有 13-nm 高的島狀結構之表面 上，生長時的基因表現作一比較(Dalby et al., 2002)，發現許多和細胞貼附相關的蛋白質，
包括 integrin subunits、G-protein receptor elements、tyrosine kinases 等，在具有 13-nm 高的 島狀結構之表面上，活化的程度較高，和使用免疫螢光染色的結果相同。另外和細胞形狀 改變、移動相關的基因，例如 Rho、Rac 和 Ras，在具有 13-nm 高的島狀結構之表面上也 都被活化；此外許多細胞外基質的蛋白質，如膠原蛋白（II、IV 和 V）、基膜素和 fibronectin 也被活化。提高細胞外基質蛋白質的表現，在新組織的再生上是非常重要的。 許多研究顯示奈米結構對於細胞會產生影響。本研究將針對膠原蛋白的奈米結構對於 骨母細胞的功能影響作探討。
研究方法
本實驗中將使用類骨母細胞株（MG-63）來作為實驗的對象。由食品工業發展研究菌 種中心購買細胞株 (MG-63) 1 ml，濃度為 2.1 × 106 cells / ml。取 10 ml 培養液置於 T75 flask 中，將冷凍管在 37℃水浴中迅速解凍，以 70％酒精擦拭管壁及管口，移入無菌操作台內， 並將細胞緩慢地加入 T75 flask 中，混合均勻，放入 37℃，5％ CO2培養箱，每二至三天 換一次細胞培養液或繼代培養。 細胞佈殖 (seeding) 從細胞培養箱中取出 T75，把細胞培養液抽掉，使用 10 ml PBS 潤洗兩次，加入 1× Trypsin-EDTA 1 ml，移置細胞培養箱，10 分鐘後取出，先使用顯微鏡觀察細胞是否已經脫 離 T75 表面，然後加入 9 ml PBS，將細胞液收集到 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 10 分鐘，移除上清液，使用適量的細胞培養液讓細胞重新懸浮，取出少量的細胞液放到 eppendorf 裏，利用血球計數板(Hemacytometer)在顯微鏡下計算細胞密度，再使用細胞培養 液將細胞密度稀釋成 2×104 cells/ml，取出 1 ml 加到已經塗佈蛋白質薄膜的培養基中，放至 37℃培養箱中培養。佈殖密度：1×104cells / cm2。 細胞數測定以 BCA Protein Assay Kit 測定 24-well 中細胞溶解後之吸光值。將 24-well 中的細胞以 1％ Triton 溶解，從 24-well 中各取出 25μl 溶解液移至 microplate。各加入 200μl working reagent。在 37℃下，反應 1 小時。測波長 570 nm 之吸光值。利用已知細胞個數與其相對
應吸收度關係作為標準曲線。
鹼性磷酸酶(alkaline phosphate)測定
測量方法是利用鹼性磷酸酵素對 p-nitrophenyl phosphate 作用，產生的顯色反應：
4-nitrophenylphosphate + H2O → phosphate + 4-nitrophenolate
將 24-well 中的細胞以 1％ Triton 溶解。從 24-well 中各取出 50μl 溶解液移至 microplate。避光環境中，加入 100μlAMP(2-amino-2-methyl-1-propanol) buffer，pH 值為 10。 在 37℃下，反應 1 小時。避光環境中，加入 100μl 0.5N NaOH 使反應停止。測波長 405 nm 之吸光值。利用已知 p-nitrophenol 濃度與其相對應吸光值作為標準曲線。
細胞基因表現的分析
培養一段時間後，將細胞內的 mRNA 分離出來，利用 RT-PCR 的方法來分析其基因 表現的情況。所分析的基因包括第一型膠原蛋白、bone morphogenetic proteins（BMP-1, 2, 3, 4）、Smads proteins 等。其中第一型膠原蛋白是是骨頭組織中的重要細胞外基質的蛋白 質成分，其餘的和細胞之 osteoinduction 的功能有關。
膠原蛋白製備
膠原蛋白(collagen)自牛皮純化，利用 50 mM 醋酸稀釋膠原蛋白使其濃度為 0.1 mg/ml。以 8：1：1 的比例混合 0.1 mg/ml collagen、10× PBS、0.4N NaOH，在 37℃下， 反應 6 小時，使其生成 fibrous collagen。取適量的 0.1 mg/ml collagen，在 65℃下，反應 1 小時，使其生成 denatured collagen。
膠原蛋白結構分析
在雲母(mica)片上加入 400μl 樣品溶液，5 分鐘後移除溶液，使其自然乾燥。利用原 子力顯微鏡(atomic force microscopy；AFM)分析材料表面。
討論
從 AFM 的圖可以看出，膠原蛋白在不同的條件下，可以形成不同的結構。溶解態的 膠原蛋白，吸附在雲母上，從 AFM 的圖（圖一 A）看來為細絲狀，高度約為 2.6 nm，平均 粗糙度為 0.646 nm。吸附在雲母上的纖維狀膠原蛋白，其型態（圖一 B）為較粗的長條狀， 由於生成的纖維粗細不等，因此在 AFM 上呈現各種半徑的膠原蛋白纖維，當反應時間達到 六小時，甚至肉眼可以看到纖維。所以當使用 AFM 來作分析時，只能針對較小的纖維，平 均粗糙度為 8.862 nm。至於吸附在雲母上的 denatured 膠原蛋白，平均粗糙度為 0.848 nm（圖 一 C），和溶解態的膠原蛋白差不多，最大高度差為 28.405 nm。從 AFM 的高度圖來看，我 們已經在材料表面上製作出不同奈米等級的膠原蛋白分子結構。 圖一 A、溶解態膠原蛋白之 AFM 圖 圖一 B、纖維態膠原蛋白之 AFM 圖圖一 C、Denatured 膠原蛋白之 AFM 圖 接下來，將骨母細胞接種於這些材料表面上，觀察細胞貼附、生長的情況。如圖二 所示，在有血清的環境中，TCPS 表面塗佈上 fibrous collagen，其細胞數較其他處理過的表 面為多。且培養時間越長，細胞數目亦越多。圖三則是在無血清的環境中，細胞貼附的情 況。TCPS 表面塗佈上 fibrous collagen，其細胞數較其他處理過的表面為多。從圖二、圖三 中得知骨母細胞在有血清的環境下，其細胞貼附量較多，由此推測，骨母細胞似乎比較喜 歡在有血清的環境中生長。不過在短時間的貼附情況，不同型態的膠原蛋白似乎沒有太大 的區別。 在 不 同 時 間 有 血 清 之 細 胞 數 0 5000 10000 15000 20000 25000
TCPS soluble fibrous denatured
ce ll s / cm 2 1hr 2hr 4hr 24hr
*
*
*
** *** * *** 圖二、TCPS 表面塗佈上溶解態膠原蛋白、纖維狀膠原蛋白與變性膠原蛋白，讓骨母細胞在 有血清的環境中，經過 1、2、4、24 小時培養後，測得之細胞數。( *表示與 TCPS 做比較； * < 0.05；** < 0.01；*** < 0.001。)在 不 同 時 間 無 血 清 之 細 胞 數 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
TCPS soluble fibrous denatured
ce ll s / cm 2 1hr 2hr 4hr 24hr ** * ** 圖三、TCPS 表面塗佈上溶解態膠原蛋白、纖維狀膠原蛋白與變性膠原蛋白，讓骨母細胞在 無血清的環境中，經過 1、2、4、24 小時培養後，測得之細胞數。 細胞的型態在有血清和無血清的情況下會有不同。圖四 A 顯示大多數貼附在吸附溶解 態膠原蛋白的表面，經過四小時後，其型態多為紡錘狀，而在無血清的環境下，細胞多為 不規則的形狀，並且有許多偽足（圖四 B）。但是過了 24 小時候，型態的差距就消失了（圖 四 C、D）。
圖四、骨母細胞在吸附溶解態膠原蛋白表面的型態。A. 四小時、有血清；B. 四小時、無 血清；C. 24 小時、有血清；D. 24 小時、無血清。
圖五顯示骨母細胞在這些表面上生長的狀態。在七天後，所有吸附膠原蛋白的材料 表面，細胞數都比在 TCPS 上為高，尤其在溶解態膠原蛋白的表面上，不過差異並不大。
0 50000 100000 150000 200000 250000
TCPS Soluble Fibrillar Denatured
C el ls / cm 2
1day 3day 7day * 圖五、骨母細胞在各種表面上生長的狀況。 接下來分析骨母細胞的功能。圖六顯示鹼性磷酸酶的活性先增加後減少。到了第三 天，在纖維狀膠原蛋白和 denatured 膠原蛋白的活性比較低。 0 2 4 6 8 10 12 14
TCPS Soluble Fibrillar Denatured
1 0 4 μ M /c el l/ h r
4hr 1 day 3 day 5 day
圖六、骨母細胞的鹼性磷酸酶的活性隨著材料和培養的時間長短而改變。 接下來，我們分析在膠原蛋白中加入肝素對於軟骨細胞的影響。由圖七得知在有血清 的環境中，TCPS 表面塗佈上 collagen 加上不同濃度的肝素(heparin；HE)混合液時，觀察到 塗佈 0.02mg/ml HE 表面，其細胞數較其他處理過的表面為高，且培養時間越長，其細胞貼 附量越多。由圖八得知在無血清的環境中，亦是塗佈上 0.02mg/ml HE 表面，其細胞數較高。 從圖七和八中得知 TCPS 表面塗佈上膠原蛋白加上不同濃度的肝素混合液時，當肝素的濃 度越高時，細胞貼附量卻減少，由此推測，在越高濃度肝素混合液時，較不利於骨母細胞 的貼附。
有血 清 之細 胞 數 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
TCPS collagen 0.02HE 0.1HE 0.5HE
ce ll s / cm 2 4hr 24hr ** 圖七、TCPS 表面塗佈上膠原蛋白，並將膠原蛋白與與不同濃度的肝素(0.02mg/ml、 0.1mg/ml、0.5mg/ml)相結合，讓骨母細胞在有血清的環境中，經過 4、24 小時培養後，測 得之細胞數。 無 血 清 之 細 胞 數 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
TCPS collagen 0.02HE 0.1HE 0.5HE
ce ll s / cm 2 4hr 24hr *** *** *** *** ****** *** *** 圖八、TCPS 表面塗佈上膠原蛋白，並將膠原蛋白與與不同濃度的肝素(0.02mg/ml、 0.1mg/ml、0.5mg/ml)相結合，讓骨母細胞在無血清的環境中，經過 4、24 小時培養後，測 得之細胞數。 由圖 九 得知在有血清的環境中 ，TCPS 表面塗佈上膠原蛋白與不同濃度的肝素 (0.02mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml)混合液時，其鹼性磷酸酶活性隨著培養時間的增加，活 性也相對的增加。細胞生長在無血清的環境中（圖十），亦有此現象發生。且經過蛋白質塗 佈後的材料表面，在有、無血清的環境中，骨母細胞分泌的鹼性磷酸酶含量，彼此間似乎 差異不大。
Alkaline phosphatase activity 0 5 10 15 20 25 30 35
TCPS collagen 0.02HE 0.1HE 0.5HE
1 0 4 μ M / ce lls h r 4hr 24hr 圖九、TCPS 表面塗佈上膠原蛋白，並將膠原蛋白與不同濃度的肝素(0.02mg/ml、0.1mg/ml、 0.5mg/ml)混合，讓骨母細胞在有血清的環境中，經過 4、24 小時培養後，測得之鹼性磷酸 酶活性。
Alkaline phosphatase activity
0 10 20 30 40 50 60 70
TCPS collagen 0.02HE 0.1HE 0.5HE
1 0 4 μ M / ce lls h r 4hr 24hr ** * * ** * * 圖十、TCPS 表面塗佈上膠原蛋白，並將膠原蛋白與不同濃度的肝素(0.02mg/ml、0.1mg/ml、 0.5mg/ml)混合，讓骨母細胞在無血清的環境中，經過 4、24 小時培養後，測得之鹼性磷酸 酶活性。 計畫成果自評 本研究發現膠原蛋白的型態會影響骨母細胞貼附、生長以及功能的表現。並且在混合 肝素後，對骨母細胞也有一定程度的影響。研究成果對於材料表面改質以增進細胞相容性， 有很大的幫助。研究的成果已經在第十屆生化工程研討會發表（摘要如附件），並且投稿 Journal of Chinese Institute of Chemical Engineers (SCI journal)，已經被接受，將於 94 年 12
月登出，另有一篇論文已經投稿，因此已經有成果產出。
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附件一
