行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
抗 methicillin 金黃葡萄球菌之 SCCmec 基因分型
Genetic polymorphism of SCC
mec in methicillin-resistant Staphylococcus
aureus
計畫編號：NSC 90-2320-B-002-107
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日
主持人：鄧麗珍 國立台灣大學醫學院 醫事技術學系
計畫參與人員：陳佳慧 國立台灣大學醫學院 醫事技術學系
一、中英文摘要MRSA ( Methicillin resistant
Staphylococcus aureus )為重要的院內感染
致病菌，本計劃主要分析臺灣地區 MRSA 菌株的 SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome)結構及與抗藥之間的關係。 菌株來源主要為臺大醫院臨床鑑定之 MRSA。分析 SCCmec 結構前均前測定菌 株是否含 mecA 基因，以確定為 MRSA。 之後分三部分探討，第一部分是將近五年 (1998~2002)分離出來的 MRSA 做 strain typing (菌株分型)，做為流行病學上的參 考。利用 M13、ERICⅡ等隨機引子以及利 用 insertion sequence--IS256 做 AP-PCR，再 以脈衝式電泳做更精確的分型。第二部分 是分析不同抗藥表現型及菌株 SCCmec 上 游基因型上的相關性。發現具有 mutated
mecI 及 完 整 mecR 的 MRSA ， 通 常 對
oxacillin 產 生 高 抗 藥 性 以 及 表 現 多 抗藥 性，mecI 被 deletion 以及具有不完整 mecR 的菌株，通常對 oxacillin 表現較低的抗藥 性。而由 mecR 部分 deletion，抗藥表現就 會明顯下降，可推測 mecR 對抗藥表現似乎 較 mecI 重要。第三部分則是利用 southern blot 觀察 SCCmec 下游基因型與抗藥上的 相關。 關鍵詞：金黃葡萄球菌、methicillin 抗藥、 SCCmec 基因結構 Abstract
Staphylococcus aureus is recognized as
one of the most important nosocomial
pathogens. Methicillin-resistant S. aureus
(MRSA) has been a serious problem since 1980s in Taiwan. The resistance to methicillin is mostly due to an additional large DNA cassette (the staphylococcal cassette chromosome mec, or SCCmec)
inserted in the chromosome. We collected 147 MRSA isolates (1998 to 2002) which were isolated from National Taiwan University Hospital. Three major parts were studied. The first part is strain typing by AP-PCR and pulsed field gel electrophoresis. The primers used in AP-PCR include M13, ERIC II and IS256. The second part is to determine the molecular polymorphism of upstream region of SCCmec element
including mecR1 and mecI genes. The third
part is to analyze the polymorphism of downstream region by ClaI-digested
hybridization patterns with mecA gene as probe. The results revealed that the presence or absence of mecRI was correlated with
levels of resistance. Molecular typing of MRSA isolates by AP-PCR and PFGE showed that the clonal spread was observed for some high-level resistant MRSA isolates.
Keywords: Methicillin-resistant S. aureus,
SCCmec 二、緣由與目的 金 黃 色 葡萄球菌為人體常見的致病 菌，會引起心內膜炎、皮膚炎、尿道炎等 疾病，為重要的院內感染致病菌 (1-3)。早 期常用青黴素(Penecillin)來治療，但近幾十 年 來 發 現 有 許 多 金 黃 色 葡 萄 球 菌 已 對 Penecillin 抗藥，甚至產生多抗藥性，在臨
床診治上增加了許多困難度。這類型的細 菌，通稱為 MRSA ( Methicillin resistant
Staphylococcus aureus )。 MRSA 抗藥主要機轉為細菌獲得一段 外 來 基 因 Staphylococcal Cassette Chromosome (SCCmec) ， 其 中 最 主 要 為 mecA 基因 (4-7)，當細菌與β-lactams 接觸 時，就會促使 mecA 基因表現，而 encode 出 PBP2a，與其他青黴素結合蛋白相較， PBP2a 與青黴素(β-lactam 抗生素)的親和 力(affinity)極低，抗生素無法與細菌細胞膜 上的 transpeptidase 結合，抑制細菌細胞壁 的合成而產生抗藥性。在 mecA 上游基因之
mecR1 及 mecI 具有調控 mecA 的作用。mecI
會 encode 出 強 烈 的 抑 制 物 (strong repressor)，抑制mecA 基因表現，故通常抗 藥 菌 株 mecI 基 因 是 具 有 點 突 變 (point mutation)或被刪除(deleted)，使得 mecA 基 因不再被 mecI 基因抑制表現。而 mecR1 具 有 transducer 的作用，當抗 mecthicillin 金 黃色葡萄球菌接觸到 Penicillin 等β-lactam 類抗生素時，mecR1 會將此訊息傳遞給 mecA，促使 mecA 基因表現 (8-14)。由於 mecI 與 blaI 相似，mecR1 與 blaR1 相似，
近幾年來，發現 mecI、mecR1、mecA 與
blaI、blaR1、blaZ 兩抗藥系統彼此間似乎
可相互調控。SCCmec 的下游結構更是複 雜，含有 IS431、dcs、HVR、linear plasmid 等。有學者利用 ClaI 切割，mecA 當 probe， 進行 hybridization 做初步測試，可得到分 型結果。
三、結果與討論
第一部分是將近五年(1998~2002)分離 出來的 MRSA 做 strain typing (菌株分型)， 做為流行病學上的參考。利用 M13、ERIC Ⅱ 等 隨 機 引 子 以 及 利 用 insertion sequence--IS256 做 AP-PCR，再利用脈衝式 電泳做更精確的分型。第二部分實驗是從 抗藥表現型及菌株基因型上觀察二者之間 的 相 關 性 。 從 抗 藥 表 現 方 面 來 看 ， 做 oxacillin MIC (0.12μg~256μg/ml)將菌株 分為高抗藥(>128μg/ml)及低抗藥(4~64μ g/ml)，從菌株基因型方面，則是分析 MRSA 上 的 SCCmec(Staphylococcal Cassette Chromosome)，利用 PCR、PCR-RFLP 及 Southern blot 分析 SCCmec。二者相比較
後，發現具有 mutated mecI 及完整 mecR 的 MRSA，通常對 oxacillin 產生高抗藥性以 及表現多抗藥性，mecI 被 deletion 以及具 有不完整 mecR 的菌株，通常對 oxacillin 表現較低的抗藥性(詳如 Table 1)。而由 mecR 部分 deletion，抗藥表現就會明顯下 降，可推測 mecR 對抗藥表現似乎較 mecI 重要。第三部分實驗則是觀察 SCCmec 的 下游結構，利用 ClaI 切割，mecA 當 probe， 進行 hybridization，進一步了解菌株基因體 差異與菌株抗藥表現之關係。利用南方墨 漬法，發現高抗藥菌株，在 mecA 下游區 域似乎會被 ClaⅠ切出約 4.3kb 大小的片 段，為 typeⅢ(DUARTE C. OLIVEIRA etc, AAC, 2000 年)，而低抗藥菌株則通常會被 切出約 16kb 大小的片段，為 typeⅠ。這二 片段之內容物的差異可能影響到抗藥表 現 ， 二 者 的 差 異 性 很 可 能 在 pT181 和 pUB110 所 包 含 的 基 因 (DUARTE C. OLIVEIRA etc, AAC, 2000 年)，此部份結果 需進一步的實驗來證實。
(I) Pulsed field gel electrophoresis
(III) ClaI restriction pattern using mecA as
probe
Table1. Correlation of MecI, MecR1, and
oxacillin MIC MIC(μ g/ml) No. of isolates MecI type 1 MecI type 2 MecR1 MecR1 deletion 256 89 81 3 84 4 128 11 8 0 8 3 64 7 3 0 3 4 32 7 0 0 0 7 16 15 0 0 0 15 8 10 0 0 0 10 4 8 0 0 0 8 四、成果自評 (1) Strain typing: 已完成。
(2) Upstream region of SCCmec: 已完成。 (3) Downstram region of SCCmec: 已完成
ClaI hybridization 初步分型。
五、參考文獻
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