認識身旁的小傢伙(19)--探討昆蟲免疫系統之敵我辨識與記憶效應等性質的實驗方法

認識身旁的小傢伙(19)--探討昆蟲免疫系統

之敵我辨識與記憶效應等性質的實驗方法

吳季昀

蔡任圃*

臺 北 市 立 中 山 女 子 高 級 中 學

壹、前言

高 中 生 物 課 程 中 ， 關 於 「 免 疫 系 統 」 的 探 討 活 動 為「 抗 原 抗 體 反 應 」，運 用 採 集 血 液 與 抗 體 凝 集 等 步 驟 檢 測 血 型 ， 蔡 (2014)提 出 此 實 驗 的 若 干 缺 點 ， 並 開 發 觀 察 昆 蟲 包 囊 作 用 的 方 法 ， 以 銅 絲 作 為 入 侵 物 ， 探 討 電 荷 對 包 囊 程 度 的 效 應 。 但 若 能 利 用 「 包 囊 作 用 」 易 觀 察 、 量 化 的 特 性 ， 探 討 教 材 中 所 介 紹 的 人 體 免 疫 系 統 特 性 ， 則 更 具 成 效 與 價 值 。 昆 蟲 依 賴 「 先 天 性 免 疫 」 以 防 禦 入 侵 物(Hoffmann, 1995；Ottaviani, 2005)。當 異 物 入 侵 時 ， 可 引 起 昆 蟲 「 體 液 性 」 與 「 細 胞 性 」 的 免 疫 反 應 ， 前 者 例 如 ： 血 淋 巴 中 蛋 白 質 的 凝 固 和 黑 化 ； 後 者 例 如 ： 吞 噬 作 用 與 包 囊 作 用 等 。 昆 蟲 具 有 多 種 血 淋 巴 細 胞 ， 其 中 漿 血 細 胞 與 顆 粒 細 包 除 了 參 與 吞 噬 異 物 的 作 用 外 ， 也 可 透 過 細 胞 伸 展 、 扁 平 化 後 將 異 物 層 層 包 覆 ， 以 避 免 入 侵 物 擴 散 至 體 內 的 其 他 地 方 ， 或 使 其 被 去 活 化 (Hoffmann, 1995)， 此 過 程 稱 為 包 囊 作 用 (Pech and Strand, 1996； Ottaviani, 2005)。 包 囊 作 用 共 有 三 個 步 驟 ： 首 先 ， 顆 粒 細 胞 接 觸 到 外 來 物 質 ， 發 出 訊 息 。 接 著 ， 漿 血 *為本 文 通 訊 作 者

細 胞 會 附 著 在 外 來 物 上，發 出 訊 息。最 後， 顆 粒 細 胞 在 外 來 物 表 面 形 成 一 層 包 覆 的 膜 ， 包 囊 作 用 即 完 成(Pech and Strand, 1996)。 人 體 與 昆 蟲 的 免 疫 機 制 存 在 著 許 多 不 同 之 處(表 一 )， 一 般 認 為 昆 蟲 的 免 疫 系 統 不 具 有 記 憶 性 及 專 一 性 ， 是 一 種 與 生 俱 來 的 先 天 性 免 疫 反 應 。 但 科 學 界 已 發 現 許 多 昆 蟲 的 免 疫 特 性 ， 性 質 上 類 似 人 體 的 免 疫 作 用(見 下 述 )。包 囊 作 用 的 反應 明 顯、容 易 觀 察 、 量 化 ， 可 做 為 昆 蟲 免 疫 反 應 程 度 的 指 標 。 本 文 介 紹 如 何 以 蟑 螂 的 包 囊 作 用 作 為 免 疫 反 應 模 式 ， 來 操 作 、 探 討 其 相 關 因 子 。

一、性別因子

美 洲 蟑 螂 雄 蟲 與 雌 蟲 的 外 型 不 同 。 雄 蟲 成 蟲 體 重 較 輕 ， 體 型 一 般 較 為 細 長 、 扁 瘦 ， 前 翅 的 長 度 超 過 腹 部 末 端 ； 而 雌 性 成 蟲 體 重 較 重 ， 身 軀 較 為 短 胖 ， 前 翅 的 長 度 約 與 腹 部 末 端 切 齊 (蔡，2006)。尤 其 是，雌 蟲 的 脂 肪 體 較 多 ， 血 淋 巴 細 胞 較 多 ， 也 具 懷 孕 、 孕 育 下 一 代 的 任 務 。 我 們 推 測 ， 雌 蟲 的 免 疫 功 能 可 能 與 雄 蟲 不 同 。

表 一 人 體 及 昆 蟲 免 疫作 用 與 性 質之 比 較 。 免 疫 作 用 或 相 關 性 質 人 體 昆 蟲 第 一 道 防 線 皮 膜 組 織(角 質 層)及 其 分 泌 物 (淚 液、 唾 液 、 消化 液) 皮 膜 組 織(幾 丁 質外 骨 骼) 及 其 分 泌 物(唾 液 、消 化 液 、 腺體 分 泌 物 ) 吞 噬 作 用 嗜 中 性 白 血 球 、 巨 噬 細 胞 、 樹 突 細 胞 等 漿 血 細 胞 、 顆 粒 細 胞 等(Ottaviani, 2005) 發 炎 反 應 受 傷 組 織 、 嗜 中 性 白 血 球 分 泌 組 織 胺 所 引 發 相 關 研 究 甚 少 包 囊 作 用 例 子 甚 少 ， 如 肺 結 核 的 結 節 漿 血 細 胞 、 顆 粒 細 胞 等 (Ottaviani, 2005) 組 織 黑 化 (malanization) 相 關 研 究 甚 少 類 絳 色 細 胞(oenocytoids)具 有酚 氧 化 酶 (phenoloxidase)的 活性 與 黑 化過 程 有 關 (Ottaviani, 2005) 排 斥 反 應 主 要 由 T 淋 巴 球執 行 可 (Carton, 1976、Ottaviani, 2005) 可 辨 識 敵 我 可 可

(Lackie, 1979、Lavine and Strand, 2002)

具 專 一 性 由 T 淋 巴球 與 B 淋 巴 球 的 受

體 或 抗 體 執 行

相 關 研 究 甚 少 (Faulhaber and Karp, 1992)

具 記 憶 性 由 記 憶 細 胞 執 行 相 關 研 究 甚 少

(Faulhaber and Karp, 1992)

二、敵我辨識(自我/非我的辨識)

若 將 美 洲 蟑 螂(Periplaneta americana)與 蝗 蟲(Schistocerca gregaria)的 組 織 作 異 種 間 移 植 ， 兩 者 的 包 囊 作 用 皆 展 示 具 辨 識 敵 我 (non-self or self) 的 免 疫 特 性 (Lackie, 1979) 。 蟑 螂 具 有 排 斥 異 體 移 植 組 織 的 現 象 ， 而 對 自 體 組 織 則 無(Carton, 1976)。 蟑 螂 已 知 可 辨 識 異 種 生 物 的 組 織 植 入 物 ， 但 對 同 種 異 體 的 組 織 植 入 物 的 反 應 為 何 ？ 可 否 展 現 自 我/非 我的 辨 識 能 力？

三、入侵物表面蛋白

免 疫 細 胞 常 是 透 過 受 體 偵 測 入 侵 物 的 表 面 醣 蛋 白 ， 以 作 為 入 侵 物 是 否 為 「 非 我 組 織 」 的 依 據 。 生 活 中 常 見 的 酒 精 ， 具 有 使 蛋 白 質 變 性 的 作 用 。 若 將 上 述 敵 我 辨 識 的 實 驗 操 作 ， 事 先 以 酒 精 處 理 ， 使 植 入 物 表 面 蛋 白 變 性 ， 是 否 有 會 影 響 敵 我 辨 識 的 免 疫 效 應 ？ 此 實 驗 可 驗 證 表 面 蛋 白 在 免 疫 辨 識 過 程 中 的 角 色 。

四、記憶效應

無 脊 椎 動 物 個 體 先 前 的 免 疫 經 驗 ， 可 增 加 之 後 對 同 樣 病 原 體 的 免 疫 反 應(具 有

預 防 性 ) ， 此 現 象 被 稱 為 免 疫 誘 發 (immunological priming)(Little and Kraaijeveld, 2004)；Faulhaber and Karp(1992)發現 ， 若 事 先 於 蟑 螂 體 內 注 射 殺 死 的 細 菌 ， 可 有 效 提 高 之 後 再 注 射 活 菌 之 個 體 的 存 活 率 ， 而 在 昆 蟲 免 疫 的 研 究 領 域 中 ， 鮮 少 探 討 昆 蟲 的 免 疫 系 統 是 否 具 記 憶 效 應 。 利 用 包 囊 作 用 的 模 式 ， 亦 可 探 討 記 憶 效 應 的 相 關 性 質 。

五、包囊作用是否具可逆性？

包 囊 形 成 後 ， 包 覆 於 入 侵 物 表 面 的 細 胞 還 會 散 出 嗎 ？ 也 就 是 包 囊 作 用 是 否 具 可 逆 性 ？ 這 些 問 題 可 利 用 電 荷 對 包 囊 作 用 的 影 響(蔡 ，2014)作為 研 究 基 礎進 行 探 討 。

貳、研究方法或過程

一、研究設備及器材

如 表 二 。

二、實驗動物

美 洲 蟑 螂(Periplaneta americana) 成 蟲 ， 為 本 校 自 行 飼 養 繁 殖 。 飼 養 方 式 與 實 驗 動 物 篩 選 參 考 自 蔡(2014)。

三、研究過程及方法

(一 ) 以 蟑 螂 觸 角 為 作 為 植 入 物 ， 觀 察 包 囊 作 用 的 方 法 蟑 螂 以 二 氧 化 碳 麻 醉 後 ， 將 觸 角 自 基 部(梗 節 與 鞭 節 之 間 )剪 下 ， 置 於 載 玻 片 上(不 覆 蓋 蓋 玻 片 以 避 免 觸 角 因 壓 迫 變 形)，利 用 顯微 測 微 器 測量 觸 角 鞭 節 基 部 區 域 的 直 徑(單 位 為 μm)。以 觸 角 作 為 植 入 物，以 觸 角 基 部 做 為 前 端， 由 蟑 螂 腹 部 背 側 第 5 與 第 6 片 背 板 骨 片 之 間 的 縫 隙 薄 膜 穿 入(蟑 螂 腹 部 背 板 骨 片 共 有 8 片)，使 觸 角 進入 蟲 體 體 腔 內(圖 一) 。 表 二 實 驗 裝 置 與 器 材 編 號 名 稱 型 號 或 規 格 備 註 1 複 式 顯 微 鏡

2 照 相 機 Super Steady Shot DR-SR11 Sony

3 75%乙 醇溶 液 4 蟑 螂 屋 貼 紙 與 膠 帶 上 黏 蟑 螂 屋 5 錐 形 瓶 6 解 剖 器 材 解 剖 刀(小 剪 )、 鑷子 7 蟲 針 8 二 氧 化 碳 鋼 瓶 麻 醉 用 二 氧 化 碳 9 載 玻 片 、 蓋 玻 片 76*26mm 1.2-1.5mm

若 因 觸 角 過 軟 難 以 插 入，可 先 用 00 號 蟲 針 先 穿 出 孔 洞 ， 觸 角 再 順 著 孔 洞 插 入。待 觸 角 植 入 蟲 體 引 發 包 囊 作 用(約 15 分 鐘 )後 ， 以 鑷 子 將 骨 片 翻 開 並 小 心 取 出 觸 角(避 免 觸 角 上 所 形 成 的 包 囊 組 織 剝 落)，再 由目 鏡 測 微器 測 量 觸 角 上 最 大 的 包 囊 直 徑(單 位為 μm) (圖 二)，以比 較 包 囊作 用 的 程 度。由 於 本 實 驗 中 鞭 節 直 徑 在 各 組 蟑 螂(雄 蟲 )間 不 具 差 異(單 尾 t 檢 定 ，p > 0.05)， 故 可 直 接 以 最 大 包 囊 直 徑(包 囊 ＋ 觸 角 的 直 徑)作 為 免 疫反 應 程 度 的指 標 。 我 們 已 證 實 二 氧 化 碳 麻 醉 時 ， 對 植 入 的 自 體 觸 角 所 產 生 的 最 大 包 囊 直 徑(平均 ± 標 準差)為 568.75 ± 51.23 μm，與 未 麻 醉 時 的 609.38 ± 111.01μm 未 達 統 計 上 的 顯 著 差 異(單 尾 t 檢 定 ， n = 16)； 對 植 入的 異 體 觸 角所 產 生 的 最 大 包 囊 直 徑 為 771.86 ± 129.38 μm， 與 未 麻 醉 時 的 860.94 ± 207.16 也 未 達 統 計 上 的 顯 著 差 異(單 尾 t 檢 定 ，p >0.05，n = 16)， 代 表二 氧 化 碳 麻 醉 過 程 ， 不 會 影 響 包 囊 作 用 。 圖 一 探 討 蟑 螂 包 囊 作用 時 ， 植 入物 所 植 入 的位 置 。 圖 二 測 量 包 囊 的 最 大直 徑 ， 實 線為 觸 角 的 直徑 ， 虛 線 為包 覆 於 觸 角 的 最 大 包 囊 直 徑 。

 

(二 ) 以 蟑 螂 觸 角 為 作 為 植 入 物 ， 觀 察 包 囊 作 用 的 方 法 分 別 以 雄 性 與 雌 性 成 蟲 作 為 實 驗 動 物，以 探 討 性 別 因 子 的 效 應。由 於 雌、 雄 蟲 的 觸 角 直 徑 不 同 ， 雄 蟲 為449.22 ± 82.18 μ m (平 均 ±標 準 差，n = 16)， 雌 蟲 為387.50 ± 27.51μ m (n = 10)， 故 比 較 其 包 囊 作 用 的 免 疫 反 應 程 度 時 ， 需 以 包 囊 本 身 的 截 面 積 作 為 比 較 的 指 標 ， 其 計 算 方 式 為 ： 包 囊 本 身 的 截 面 積 ＝ π(包 囊 外 徑 2_{－ 觸 角 外 徑} 2₎ (三 ) 敵 我 辨 識 性 質 的 探 討 操 作 步 驟 如 上 述 ， 將 自 體 與 異 體 觸 角 植 入 同 一 蟲 體 腹 部 背 側 體 內，15 分 鐘 後 以 鑷 子 將 骨 片 翻 開 並 取 出 觸 角 ， 以 目 鏡 測 微 器 測 量 觸 角 最 大 包 囊 直 徑 。 (四 ) 入 侵 物 表 面 蛋 白 操 作 步 驟 如 上 述 ， 實 驗 組 將 觸 角 剪 下 後，放 入 75% 酒 精 溶液 靜 置 15 分 鐘 後 取 出 ， 再 靜 置 5 分 鐘 待 其乾 燥 後 測 量 直 徑 。 將 酒 經 處 理 後 的 自 體 與 異 體 觸 角 植 入 蟲 體 體 內，15 分 鐘後 取 出 測 量，最 後 與 對 照 組(觸 角 樣 本未 經 酒 精 處 理)的 數 據 比 較。 (五 ) 記 憶 效 應 將 實 驗 動 物 中 腳 之 腿 節 與 脛 節 交 界 處 剪 斷，形 成 一 個 傷 口，將 自 體、異 體、 或 自 體 與 異 體 之 觸 角 末 端(鞭 節 末 端 較 細 之 處，長 度 約 0.5 至 1 公 分)樣 本 植 入 中 腳 剪 開 的 傷 口 中(圖 三 )， 使 蟲 體 預 先 接 觸 植 入 物 。 將 餘 下 的 觸 角 ， 以 目 鏡 測 微 器 測 量 觸 角 直 徑 後 妥 善 保 存 。 待 蟑 螂 清 醒 後 放 回 錐 形 瓶 ， 並 給 予 妥 善 照 顧 。 三 日 後 ， 依 上 述 包 囊 作 用 的 觀 察 步 驟 ， 將 自 體 與 異 體 觸 角 植 入 腹 腔，15 分 鐘取 出 觀 察、測 量。本 實 驗 的 各 組 設 計 操 作 如 圖 四 ， 探 討 接 觸 自 體 、 接 觸 異 體 或 同 時 接 觸 自 體 與 異 體 觸 角 三 日 後 的 個 體 ， 其 對 自 體 與 異 體 觸 角 包 囊 作 用 的 反 應 程 度 ， 並 與 對 照 組(步 足 中 腳剪 開 傷 口，但未 接 觸 觸 角 組 織)相 比 。 圖 三 植 入 物 (觸 角 前 端組 織 )植 入 蟑螂 中 腳 內 的實 驗 照 片 (左)與 手 繪 圖 (右 )。

圖 四 探 討 免 疫 系 統 之記 憶 效 應 的各 組 設 計 與操 作 ， 以 對照 組 、 接 觸自 體 、 接 觸異 體 、 接 觸 自 體 與 異 體 觸 角 四 組 ， 探 討 預 先 暴 露 的 免 疫 記 憶 性 質 。 白 色 長 條 物 代 表 自 體 觸 角 ， 黑 色 長 條 物 代 表 異 體 觸 角 ， 灰 色 橢 圓 物 代 表 包 囊 。

 

(六 ) 包 囊 作 用 是 否 具 可 逆 性 ？ 經我 們的 前 測， 發現 植 入蟑 螂體 內 的銅 絲連 接 電池 的正 極 ，可 增加 包 囊作 用的 程 度。 反之，若銅絲連接電池的負極，則會抑制包囊作用(與未接電極的銅絲相比)(圖五)。我 們利用此性質探討免疫細胞進行包囊作用時是否具有可逆性。實驗設計與操作如圖六。 圖 五 不 通電 與 正 、 負極 銅 絲 植 入蟲 體 10 分 鐘 後 所 引 發 包囊 作 用 的 最大 包 囊 直 徑 (平 均 ± 標 準 誤 ， n = 20, 10, 10)。 與 不 通 電 相 比 (單 尾 t 檢 定 )： **： p < 0.01 與 負 極 相 比(單 尾 配 對 t 檢 定 )： ●●： p < 0.01 自體 異體 預先接觸 異體植入物 對照組 3日後 15 分鐘後 預先接觸 自體植入物 預先接觸 自體與異體 植入物 預先暴露植入物 觀察自體與異體觸角 植入後引發的包囊作用 實驗結果 自體 異體 預先接觸 異體植入物 對照組 3日後 15 分鐘後 預先接觸 自體植入物 預先接觸 自體與異體 植入物 預先暴露植入物 觀察自體與異體觸角 植入後引發的包囊作用 實驗結果 100 200 300 400 500 600 不通電 負極 正極 包囊 最寬 直徑 (μ m )

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圖 六 利 用 電 荷 對 包 囊作 用 的 效 應，探 討 免 疫 細 胞 進 行 包囊 作 用 時 是否 具 有 可 逆性 的 實 驗 設 計 與 操 作 示 意 圖 。 將 銅 絲 植 入 蟲 體，各 自 連 接 正 負 電 極(1.5V)，分 別於 通 電 後 10 分 鐘 與 20 分 鐘 取 出 銅 絲 測 量 最 大 包 囊 直 徑 ， 作 為 對 照 組 。 實 驗 組 的 步 驟 如 上 ， 但 於 通 電 10 分 鐘 後， 在 不 取 出 銅 絲 的 狀 況 下 ， 交 換 正 負 極 電 源 ， 再 繼 續 通 電 10 分 鐘 ，最 後 取 出 銅絲 測 量 最 大 包 囊 直 徑 ， 與 對 照 組 比 較 。

參、研究結果

一、性別因子

無 論 是 異 體 或 自 體 觸 角 ， 最 大 包 囊 截 面 積 皆 是 雌 蟲 大 於 雄 蟲(圖七)。 圖 七 雄 性 (n = 16)與 雌 性 (n = 10)之 蟑 螂 成 蟲 對自 體 與 異 體觸 角 植 入 物， 引 發 最 大包 囊 作 用 的 包 囊 截 面 積(平 均 ± 標 準 誤 )。 與 自 體 觸 角 相 比(單 尾 配對 t 檢 定 )： *： p < 0.05； ** p < 0.01 與 雄 蟲 相 比(單 尾 配 對 t 檢 定 )：★：p = 0.087；●：p < 0.05 10 分鐘 0 分鐘 20 分鐘 ＋ － ＋ － ＋ － ＋ － ＋ － － ＋ 電極 互換 6 V 500_m A 對照組 實驗組 10 分鐘 0 分鐘 20 分鐘 ＋ － ＋ － ＋ － ＋ － ＋ － － ＋ 電極 互換 6 V 500_m A 6 V 500_m A 對照組 實驗組 0 1 2 3 4 5 自體 異體 觸角最大包囊面積(m m ^2 ) 雄蟲 雌蟲

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★

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二、敵我辨識

將 自 體 與 異 體 觸 角 植 入 蟑 螂 後，每 三 分 鐘 取 出 部 分 個 體 的 植 入 物 進 行 測 量(圖 八)，可 觀 察 到 包 囊 的 形 成 隨 時 間 越 來 越 大(圖 九)，其 中 異 體植 入 物 引 發的 包 囊 作 用強 度 大 於 自體 植 入 物，且 皆 於 第 15 分 鐘 時達 到 飽 和，故 後續 實 驗 以 15 分 鐘 作為 植 入 物 引發 包 囊 作 用的 反 應 時 間 。 圖 八 自 體 觸 角 (左 )與異 體 觸 角 (右)於 蟑 螂 體 內引 發 的 包 囊作 用 照 片 。 圖 九 自 體與 異 體 觸 角植 入 蟲 體 後隨 時 間 所 引發 的 最 大 包囊 直 徑 (平 均 ± 標準 誤 ， 每 個數 據 取 樣 數為 6， 共 使用 60 隻 蟲 體 )。 與 自 體 觸 角 相 比(單 尾 配對 t 檢 定 )： *： p < 0.05； **： p < 0.01 觀 察 自 體 組 織 與 異 體 組 織 所 以 引 發 的 包 囊 作 用 ， 我 們 發 現 異 體 觸 角 所 引 發 的 包 囊 作 用 大 於 自 體 觸 角 ， 證 實 蟑 螂 的 免 疫 系 統 具 有 敵 我 辨 識 的 能 力 (圖 十 )。 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 時間(分鐘) 包囊最 寬直徑 (μm ) 自體觸角 異體觸角

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圖 十 自 體與 異 體 觸 角植 入 蟲 體 後引 發 的 最 大的 包 囊 直 徑 (平 均 ± 標準 誤，n = 16)。 與 自 體 觸 角 相 比(單 尾 配對 t 檢 定 )： **：p < 0.01

三、入侵物表面蛋白

自 體 與 異 體 觸 角 樣 本 經 酒 精 處 理(使 表 面蛋 白 變 性)，再 植入 蟲 體後 比 較 其 包囊 作 用 的 程 度，發 現 自 體 與 異 體 處 角 樣 本 所 引 發 的 包 囊 作 用 沒 有 差 異(圖十 一)，也 就是 若 植 入物 經 酒 精 處 理 後 ， 可 削 弱 甚 至 去 除 蟑 螂 免 疫 系 統 的 辨 識 敵 我 現 象 。 圖 十 一 自 體 與 異 體 觸角 經 酒 精 處理 後 ， 植 入蟲 體 後 引 發的 最 大 的 包囊 直 徑 (平 均 ± 標 準 誤 ， n = 12)。 與 自 體 觸 角 相 比(單 尾 配對 t 檢 定 )： 未 達 統 計 差異 500 600 700 800 900 1000 自體 異體 包囊 最寬 直徑 (μ m ) 500 600 700 800 900 自體 異體 包囊 最寬直徑( μm )

**

四、記憶效應

若 只 去 除 中 腳 步 足，則 三 日 後 除 了 略 為 減 弱 自 體 觸 角 的 包 囊 作 用 外，對 觸 角 引 發 包 囊 作 用 的 相 關 性 質 影 響 不 大(圖十 二)。接 觸 異 體 組 織三 天 後 可 增加 自 體 與 異體 觸 角 所 引發 的 包 囊 作 用；接 觸 自 體 組 織 三 天 後 可 增 加 自 體 觸 角 所 引 發 的 包 囊 作 用，但 不 影 響 異 體 觸 角 的 包 囊 作 用。若 同 時 接 觸 自 體 與 異 體 組 織 三 天 後，則 可 減 弱 自 體 與 異 體 觸 角 所 引 發 的 包 囊 作 用(圖十 三)。若 以未 預 先 接觸 入 侵 物 之蟲 體 的 包 囊作 用 作 為 對照 組，將 實驗 數 據 轉 變成 改 變 百 分 比(表 三)，則可 比 較 出各 種 預 先 暴露 入 侵 物 的處 理，對 包囊 作 用 的 效應。其 中，若 預 先 接 觸 異 體 組 織，則 三 天 後 該 蟲 體 對 異 體 入 侵 物 的 包 囊 作 用 增 加(增 加 21.09%)，但 對自 體 入 侵 物 的 包 囊 則 無 影 響；若 預 先 接 觸 自 體 組 織，則 三 天 後 該 蟲 體 對 自 體 入 侵 物 的 包 囊 作 用 增 加(增 加 33.15%)，但 對異 體 入 侵 物的 包 囊 作 用卻 減 少(減 少 13.41%)；若 預 先 接 觸 自體 與 異 體 組 織 ， 則 三 天 後 該 蟲 體 對 自 體 與 異 體 入 侵 物 的 包 囊 作 用 皆 減 少(各 減 少 13.24%與 28.23%)。 由 以 上 數 據 可 知 ， 美 洲 蟑 螂 不 但 具 有 類 似 人 體 免 疫 系 統 的 記 憶 性 質 ， 且 其 免 疫 的 記 憶 機 制 可 能 會 表 現 抑 制 性 的 調 節。換 句 話 說，昆 蟲 免 疫 系 統 可 能 包 含 活 化 性 與 抑 制 性 兩 種 不 同 的 記 憶 性 質 。 圖 十 二 正 常 蟑 螂 (n = 16)與 去 除 中 腳 蟑 螂 (n = 9)對 自 體 或異 體 觸 角 引發 包 囊 作 用的 最 寬 包 囊 直 徑(平均 ± 標 準 誤 )。 與 自 體 觸 角 相 比(單 尾 配對 t 檢 定 )： **： p < 0.01 與 正 常 蟑 螂 相 比(單 尾 t 檢 定 )：★：p = 0.065

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

自體

異體

包囊最寬直徑(μm

)

正常蟑螂

去除中腳

★

**

**

圖 十 三 體 內 細 胞 接 觸自 體 或 異 體觸 角 三 天 後，對 自 體 或 異 體 觸 角 引發 包 囊 作 用的 最 寬 包 囊 直 徑(平 均 ± 標 準 誤 ， n = 取 樣 數 )。 a、 b、 c、 d： 自 體 觸 角引 發 包 囊 作用 之 各 組 間達 統 計 之 顯著 水 準 (α = 0.05) a’、 b’、 c’： 異 體 觸 角 引發 包 囊 作 用之 各 組 間 達統 計 之 顯 著水 準 (α = 0.05) 與 自 體 觸 角 相 比(單 尾 配對 t 檢 定 )： **： p < 0.01 表 三 對 自 體 或 異 體 組織 的 記 憶 性質 對 蟑 螂 包囊 作 用 的 效應 。 預 先 接 觸 的 組 織 記 憶 效 應 對 自 體 組 織 的 免 疫 反 應 對 異 體 組 織 的 免 疫 反 應 去 除 前 肢 －12.44● _－9.73 接 觸 異 體 組 織 ＋8.22 c _＋21.09** b 接 觸 自 體 組 織 ＋33.15** a _－13.41** d 接 觸 自 體+異 體組 織 －13.24* －28.23** 註 ： 本 表 為 與 無 記 憶 效 應(蟲 體 未 預先 接 觸 入 侵物 )的 組 別 相比 ， 所 增 加或 減 少 的 百分 比 。 記 憶 效 應 與 無 記 憶 時 相 比(單 尾 t 檢 定 )：●：p = 0.08； *： p < 0.05； **： p < 0.01 「 接 觸 自 體 組 織 後 對 自 體 觸 角 a_{」 與 「 接 觸 異 體 組 織 後 對 異 體 觸 角} b_{」 的 免 疫 反 應 相} 比(單 尾 t 檢 定 )： p < 0.05 「 接 觸 異 體 組 織 後 對 自 體 觸 角 c_{」 與 「 接 觸 自 體 組 織 後 對 異 體 觸 角} d_{」 的 免 疫 反 應 相} 比(單 尾 t 檢 定 )： p < 0.01

五、包囊作用是否具可逆性？

若 先 通 電 10 分 鐘後 交 換 正 負電 極，再 繼續 通 電 10 分 鐘 後，則 此兩 銅 絲 的 包囊 程 度 不 具 差 異，且 大 於 通 電10 分 鐘的 正 電 銅 絲，小 於 通 電 20 分 鐘 的 正電 銅 絲(圖 十四)，顯 示 包 囊 細 胞 形 成 包 囊 後 不 會 散 去 。 也 就 是 說 ， 包 囊 作 用 不 具 可 逆 性 。 400 500 600 700 800 900 1000 1100 去除前肢(對照組) 接觸異體組織 接觸自體組織 接觸異體+自體組織 包 囊最寬直徑(μ m ) 自體 異體

a

**

a'

b

**

b'

c

a'

d

** 

c'

n= 9 9 8 9

圖 十 四 負極 與 正 極 銅絲 植 入 蟲 體 10 分 鐘 、 10 分 鐘 後 轉換 10 分 鐘、 20 分 鐘 所引 發 包 囊 作 用 的 最 大 的 包 囊 直 徑(平 均 ± 標準 誤 ， n = 10, 10, 10)。 與 10 分 鐘 組 相 比 (單 尾 t 檢 定 )： **：p < 0.01 與 負 極 相 比(單 尾 配 對 t 檢 定 )：●●： p < 0.01

肆、討論

本 文 介 紹 一 個 觀 察 、 量 化 蟑 螂 包 囊 作 用 的 模 式 ， 可 用 於 探 討 昆 蟲 免 疫 系 統 的 各 項 性 質 。 證 實 了 美 洲 蟑 螂 的 免 疫 系 統 具 有 辨 識 敵 我 與 記 憶 性 等 特 性 ， 且 辨 識 敵 我 的 特 性 與 植 入 物 的 表 面 蛋 白 有 關 。 此 外 ， 免 疫 反 應 也 具 有 性 別 差 異 。 我 們 發 現 雄 蟲 的 觸 角 較 雌 蟲 粗 ， 這 可 能 是 因 為 雄 蟲 的 觸 角 需 用 來 偵 測 性 費 洛 蒙 ， 所 以 有 較 發 達 的 觸 角 。 我 們 也 發 現 雌 蟲 的 包 囊 作 用 較 雄 蟲 來 的 強 烈 ， 可 能 因 雌 蟲 體 型 較 大 ， 具 有 較 多 血 淋 巴 細 胞 ， 因 此 對 於 外 來 物 的 免 疫 反 應 較 為 顯 著 。 透 過 這 個 模 式 ， 可 觀 察 到 自 體 和 異 體 觸 角 所 引 發 的 包 囊 作 用 具 有 明 顯 差 異 ： 異 體 觸 角 引 發 的 包 囊 作 用 明 顯 大 於 自 體 觸 角 (圖 十)，且雄 蟲 與雌 蟲 皆 然(圖七)。代 表 蟑 螂 的 免 疫 系 統 具 有 辨 識 自 體 與 異 體 入 侵 物 的 能 力 。 在 探 討 免 疫 記 憶 特 性 方 面 ， 研 究 初 期 我 們 將 蟑 螂 前 腳 剪 下 ， 植 入 蟲 體 腹 部 ， 作 為 預 先 暴 露 的 植 入 物，但 死 亡 率 過 高(死亡 率 達 90 %)。我 們認 為 是 因 植入 物 過 大，植 入 過 程 所 造 成 的 傷 口 易 致 死 或 影 響 正 常 生 理 功 能，因 此 改 用 觸 角 作 為 植 入 物 樣 本(體 積 小 、 植 入 過 程 造 成 的 傷 口 較 小)進 行 研 究 ， 實 驗 過 程 中 死 亡 率 小 於 1 %。 我 們也 曾 嘗 試 將 自 體 、 異 體 觸 角 重 複 插 入 同 一 個 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10 分 鐘 10 分 鐘 → 轉 換 10 分 鐘 20 分 鐘 包囊 最寬直徑 (μ m) 負 極 正 極

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體 三 次，每 組 相 隔15 分 鐘 並測 量 每 次 包囊 作 用 的 程 度 。 結 果 發 現 其 引 發 的 包 囊 作 用 強 度 一 次 比 一 次 弱(表 四 )， 不 過 異 體 觸 角 引 發 的 包 囊 作 用 仍 然 明 顯 大 於 自 體 。Pech and Strand(1996)認為 在 包 囊作 用 過 程 中 ， 血 球 細 胞 通 常 容 易 被 消 耗 且 無 法 在 短 時 間 內 恢 復 。 本 實 驗 的 植 入 物 也 會 消 耗 了 體 內 的 免 疫 細 胞 ， 故 於 第 二 、 三 次 植 入 時 沒 有 足 夠 的 免 疫 細 胞 進 行 包 囊 作 用 ， 導 致 第 二 與 第 三 次 的 包 囊 作 用 程 度 逐 漸 下 降 。 為 了 克 服 接 觸 外 來 物 時( 以 建 立 記 憶 性)可能過渡消耗免疫細胞的問題，我們將 實 驗 設 計 改 良 成 將 觸 角 末 稍(體 積 較 小 )植 入步足肌肉內。由於免疫細胞較不易大量進 入肌肉組織內形成包囊，故此設計不但可達 到使蟲體接觸外來物的目的，亦能避免免疫 細胞的過渡消耗。透過這個改良後的實驗方 法，發現美洲蟑螂的免疫系統確實具有記憶 性，但對自體與異體組織的記憶效應不同： 預 先 接 觸 異 體 組 織 可 增 加 對 自 體 與 異 體 觸 角的免疫程度；預先接觸自體組織只增加對 自體觸角的免疫程度。若預先同時接觸自體 與異體組織，則可減弱對自體與異體觸角的 免疫程度(圖十三、表三)。 為 了 探 討 植 入 物(觸 角 )表 面 的 蛋 白 質 結 構 ， 是 否 為 包 囊 作 用 所 辨 識 的 對 象 ， 我 們 利 用 酒 精 可 使 蛋 白 質 變 性 的 性 質 ， 同 時 處 理 異 體 與 自 體 觸 角 ， 結 果 發 現 兩 者 所 引 發 包 囊 作 用 程 度 沒 有 差 異(圖 十 一 )。 這 意 味 著 在 酒 精 處 理 植 入 物 後 ， 包 囊 作 用 的 敵 我 辨 識 性 質 消 失 ， 。 我 們 推 論 作 為 敵 我 辨 識 的 分 子 可 能 是 觸 角 表 面 的 蛋 白 質 ， 而 不 同 個 體 的 觸 角 表 面 蛋 白 具 有 差 異 ， 但 經 酒 精 處 理 後(使 蛋 白 質 變 性 )， 個 體 間 的 蛋 白 質 結 構 差 異 即 消 失 了 。 蔡(2014)曾 發 現 美 洲 蟑 螂 對 帶 正 電 之 銅 絲 ， 所 引 發 的 包 囊 作 用 明 顯 大 於 帶 負 電 的 銅 絲 。 本 實 驗 更 進 一 步 發 現 ， 帶 正 電 之 銅 絲 可 增 加 包 囊 作 用( 大 於 不 通 電 的 銅 絲)， 而 帶 負 電 的 銅 絲 可 抑 制 包 囊 作 用 (小 於 不 通 電 的 銅 絲)。我們 好 奇參 與 包 囊 作用 的 細 胞 是 否 可 轉 移 ， 即 是 否 具 有 可 逆 性 ？ 於 是 我 們 在「 帶 正 電 銅 絲 可 增 加 包 囊 作 用， 而 帶 負 電 銅 絲 可 抑 制 包 囊 作 用 」的 基 礎 下， 將 正 極 與 負 極 互 換 ， 結 果 發 現 先 通 正 電 之 銅 絲 所 包 覆 的 包 囊 細 胞 並 沒 有 因 為 改 變 成 負 極 銅 絲 而 離 散 ， 而 連 接 負 極 而 後 改 變 成 正 極 的 銅 絲 ， 其 包 囊 作 用 強 度 與 先 通 正 極 銅 絲 的 包 囊 作 用，也 沒 有 差 異(圖 十 四)，因 此 推 測 蟑 螂 的 包 囊 作 用 不 具 有 可 逆 性 。 表 四 入 侵 物 於 短 時 間內 連 續 植 入所 引 發 的 包囊 大 小 比 較。 (以 自 體 觸 角 第 一次 植 入 引 發的 包 囊 最 大直 徑 定 義 為 100%， n = 14)。 植 入 順 序 自 體 植 入 異 體 植 入 第 一 次 100.0 ± 2.3% 124.6 ± 6.5% 第 二 次 *91.1 ± 3.6% 117.1 ± 7.2% 第 三 次 **84.0 ± 3.5% **92.9 ± 2.9% 與 第 一 次 相 比(單 尾 配對 t 檢 定 )： *： p < 0.05； **： p < 0.01。

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