蛋白質概論

135  Download (0)

全文

(1)蛋白質.

(2) 《緒論》 1. 蛋白質是細胞的主要有機成份,擔任多種功能,是 最重要的生物大分子 2. 蛋白質是遺傳訊息的表現者 蛋白質體學 (proteomics) - 研究蛋白質的種類、含量變化與分佈等,唯有了解 蛋白質的特性與功能才可能回答有關生命奧秘的問題 - 但未知功能的蛋白質仍佔多數.

(3) 蛋白質的功能. 催化 (~20%) 調節 (14%) 運輸 (5%) 儲存 收縮運動 結構 (5%) 訊息傳遞 保護 其他 (5%) 未知功能 (>40%).

(4) 3. 蛋白質是由胺基酸組成的大分子 組成的胺基酸有20種(目前一說為22種),每種胺基酸 的側鏈構造不同 - 極性或親水的(如帶電荷或不帶電具極性的) - 非極性或疏水的 - 有些胺基酸併入蛋白質後可經轉譯後修飾作用*加上 其他官能基,此修飾作用與蛋白質的功能有關,如 凝血因子與膠原蛋白等 蛋白質的大小 - 蛋白質分子量的範圍廣,如胰島素含51個胺基酸, 細胞色素c含104個胺基酸,血紅素含574個 胺基酸,肌聯蛋白(titin)則含26,926個胺基酸.

(5) 側鏈為疏水, 非極性. 側鏈為芳香族, 疏水 側鏈帶負電荷 側鏈帶正電荷 側鏈不帶電但具極性. 組成蛋白質的20種胺基酸構造.

(6) 特殊胺基酸- 轉譯後修飾作用.

(7) 4. 蛋白質的分類 依外觀形狀與溶解度 - 球狀蛋白,擔任功能性角色,以酵素最為重要 - 纖維狀蛋白,擔任結構支撐或保護性角色,如皮膚、 韌帶、軟骨等構造的膠原蛋白,蠶絲的絲蛋白與頭髮 的角蛋白等 - 膜蛋白(多為球狀蛋白),可形成通道控制物質進出 (如運輸蛋白與離子通道),可參與外界訊號的傳遞 (如激素的受體蛋白),可參與能量的產生(如細胞 呼吸鏈與ATP合成酶) 依組成 - 簡單蛋白只含胺基酸 - 複合蛋白*除含胺基酸外尚有其他成份.

(8) 複合蛋白. 脂蛋白 醣蛋白 血基質蛋白 核黃蛋白 金屬蛋白.

(9) 《蛋白質的分離與純化》 1. 當分析特定蛋白質的結構與功能時,需將此蛋白質由 其存在的環境(如細胞抽取液)中分離出,此即蛋白質 的純化 蛋白質純化是利用一系列步驟保留樣品中的特定 蛋白質而同時將其他蛋白質移除的過程 2. 純化蛋白質的用途 純化所得的蛋白質組成均一,可用於進行活性分析的 生理生化研究、析出晶體的結構研究、工業上固定化 酵素的應用等.

(10) 3. 蛋白質分離與純化的原理 分離的原理 - 可利用蛋白質的分子量大小、帶電特性、溶解度或 蛋白質與特定物質間的吸附作用等 利用分子量大小的方法 - 透析* - 超過濾* - 分子篩或膠體過濾管柱層析*.

(11) 超過濾(ultrafiltration). 透析(dialysis) (半透膜).

(12) 分子篩(molecular sieve)或膠體過濾(gel filtration)管柱層析(column chromatography).

(13) 利用帶電特性的方法 - 離子交換管柱層析法* - 等電點焦集* 在特定pH值時,蛋白質所帶的正、負電荷相等, 蛋白質分子的淨電荷為零,在電場中不移動,此pH值 稱為等電點(pI) - 電泳 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)* 二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2D電泳)* 毛細管電泳.

(14) 離子交換(ion exchange) 管柱層析.

(15) 等電點交集(isoelectric focusing).

(16) SDS的構造. ← 蛋白質. 膠體電泳(gel electrophoresis). SDS-PAGE可用於估測蛋白質分子量.

(17) 依等電點分離. 2D電泳. 依分子量分離.

(18) 利用溶解度的方法 - 鹽析法* 利用非專一性吸附作用的方法 - 活性碳 - 磷酸鈣 利用專一性吸附作用的方法 - 如抗體與抗原或酵素與受質間的專一性接合特性 - 親和力管柱層析*.

(19) 鹽析法(salting out).

(20) 親和力管柱層析 親和基.

(21) 蛋白質的純化結果. 溶解度 帶電特性 分子大小 專一性的吸附.

(22) 《蛋白質的結構》 1. 一級結構是(各)多肽中胺基酸的組成與排列次序* 2. 二級結構是多肽因連接各胺基酸的肽鍵(peptide bond)間產生氫鍵,而形成重複出現的特殊結構 如α-螺旋與β-褶片 肽鍵的構造與特性 - -Cα-Co-N- Cα- 具部份雙鍵特性*,為一平面構造(amide plane, peptide plane),自由旋轉角度為Φ與Ψ.

(23) N端. C端. 多肽的表示方式與方向性 - Serylglycyltyrosylalanylleucine, Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu, SGYAL.

(24) 血紅素 Hemoglobin. 蛋白質四個結構層次的關係.

(25) 兩胺基酸以肽鍵連接. 肽鍵因共振而無法自由旋轉, 具“ 部分雙鍵” 部分雙鍵 特性.

(26) 由Ramachandran plots預測的各種構造. 實例(兔的pyruvate kinase), 排除Gly.

(27) Ramachandran plot* - 甘胺酸(glycine)*與脯胺酸(proline)*為α-螺旋的 破壞者 典型的二級構造為α-螺旋與β-褶片 - 由Pauling與Corey提出*,Pauling因而獲得1954 年諾貝爾化學獎 - α-螺旋與β-褶片*的結構特性 - 特定蛋白質中特定二級構造的含量* - β-轉折*的結構特性.

(28) 側鏈為疏水, 非極性. 側鏈為芳香族, 疏水 側鏈帶負電荷 側鏈帶正電荷 側鏈不帶電但具極性. 組成蛋白質的20種胺基酸構造.

(29) α-螺旋構造(1). 胺基酸的側鏈 Linus Pauling (1901-1994) - 1954年諾貝爾化學獎. Hydrogen bond. Robert Corey (1897-1971) Hydrogen bond.

(30) α-螺旋構造(2). R group (側鏈) R group ↓. ↙.

(31) 逆向平行. β-褶片構造. 同向平行. R group (側鏈). ↑. ↓.

(32)

(33) β-轉折構造. (較普遍).

(34) 蛋白質中常見的摺疊模式. 結構模組 結構模組 → 功能區域. 兔的pyruvate kinase的特定功能區域是由數個結構模組組成的.

(35) 超二級構造(supersecondary structures)為二級 構造的組合 - 結構模組(motif, fold)或結構區域* - 功能區域(domain)*為具功能性的特定二級構造的 組合 Random coil or unorganized structures -“ Random coil is not random!”.

(36) 球形蛋白具有緊密的構形 - 以人類血清白蛋白(human serum albumin)為例 Mr 64.500 kDa, 585胺基酸residues in a single chain.

(37) 3. 三級結構是指已具有二級構造的多肽,因胺基酸側鏈 間的交互作用而折疊扭轉成特有的緊密立體形狀(球狀) 4. 四級結構是當具有生物功能的蛋白質*是由兩條或兩條 以上的多肽(次單元)組成時,次單元在立體空間的相互 關係 蛋白質具有四級構造的優點 - 可增加結構安定性,遺傳物質能更有效利用,可形成 功能或活性部位,有調節與協同的效應.

(38)

(39) 四級結構或超分子結構的優點.

(40) 5. 超分子結構(supermolecular organization)是細胞 內不同的蛋白質(具有三級或四級構造)因行使功能而 產生交互作用的實際狀態 超分子結構的例子 - DNA複製體(replisome) - 蛋白質降解體(proteasome) - 轉錄體(transcriptosome) - 凋亡體(apoptosome) - 發炎體(inflammasome) - ATP合成體(ATP synthasome) - 呼吸體(respirasome).

(41) 6. 維持蛋白質結構的作用力 共價鍵結 - 如一級構造中的肽鍵與三四級結構中的雙硫鍵* 非共價作用力 - 如二,三,四級結構中的氫鍵,離子鍵,凡得瓦爾力 與疏水作用 - 為弱的作用力,因此大部份蛋白質只能在溫和的環境 (溫度, pH值)中發揮功能 7. 蛋白質的變性(denaturation) 蛋白質變性即是蛋白質因維持結構的作用力受破壞而 失去特有的結構與活性 - 變性通常是蛋白質特有的構形遭受破壞,因此蛋白質 變性有時是可逆的.

(42) 牛胰臟分泌的RNase由124個胺基酸組成, 含有4個雙硫鍵. 雙硫鍵. 雙硫鍵的形成.

(43) 8. 蛋白質結構與功能的密切關係是由Anfinsen等人以 核糖核酸水解酶(RNase)所進行的一系列實驗證明 RNase*含有124個胺基酸,有4個雙硫鍵 - 當以還原劑及尿素處理RNase*時,雙硫鍵被還原, 非共價作用力被破壞,RNase發生“ 變性”,喪失 水解RNA的活性 - 當以適當條件移除還原劑及尿素時,RNase的活性 可完全恢復,而重新折疊的RNase,所測得的物理 或化學特性均和原來的酵素相同.

(44) Anfinsen等人的實驗. 雙硫鍵的正確配對.

(45) Anfinsen等人的實驗中 - 所有的處理皆不會破壞連接各胺基酸之間的共價鍵 結(肽鍵),即蛋白質的一級構造不受影響 - Anfinsen因此提出“ 蛋白質的一級構造決定蛋白質 特定的立體構形” 與“ 蛋白質的功能與其特有的構形 有關” 的論點 - 此論點確立蛋白質結構與功能的關係,促進以生物 分子為基礎探討演化過程的研究 - Anfinsen等人獲得1972年諾貝爾化學獎.

(46) 9. 蛋白質立體構造的摺疊 Anfinsen等人的研究結果提出“ All of the information necessary for folding the peptide chain into its “ native”structure is contained in the amino acid sequence of the peptide” 蛋白質特有構形的形成* - Levinthal’ s paradox (1968年) - 假設蛋白質A含有100個胺基酸,若每一個胺基酸只 有兩種可能的空間分佈情形,則此蛋白質的構形可有 2100個可能性,如測試每一種可能性需10-13秒,則 需4 × 109年才能達到特有構形,但生理狀況(in vivo) 下蛋白質A卻只需約5秒即可摺疊成特有的構形.

(47) 自然構形, 原始構形 (native conformation) - dynamic, flexible. 蛋白質的摺疊. 胰凝乳蛋白酶與甘胺酸.

(48) 蛋白質摺疊的過程 - 以overall energy minimum為準則* - 摺疊的驅動力(driving force)為亂度(entropy) 因素,即疏水的胺基酸側鏈的分佈 - 漏斗模式(funnel model)*中,漏斗為energy landscape (能量圖景,位能鳥瞰),蛋白質的特有 構形所含能量最低,因此最穩定 - 二級構造 →結構區域 →功能區域 →特有立體構形.

(49) 模擬的蛋白質摺疊過程 - 蛋白質villin片段(36個胺基酸), 存於小腸的 microvillin lining, 模擬的摺疊過程耗時1 msec. 漏斗模式.

(50) 疏水效應. 蛋白質摺疊的油滴模式.

(51) 10. 參與摺疊的蛋白質 蛋白質在合成後,並非所有蛋白質皆能及時自發地 摺疊成正確的構形,其快速正確的摺疊需許多其他 蛋白質的協助 分子伴護蛋白(molecular chaperones) - 伴隨蛋白或伴從蛋白(chaperones)*扮演被動 角色,如Hsp70s (熱休克蛋白70)會與未摺疊或部份 摺疊的蛋白質接合,避免未摺疊或部份摺疊的蛋白質 黏集而被降解,而in vivo 的實驗也顯示伴隨蛋白是 蛋白質正確摺疊及形成四級構造所必需的 - 伴護蛋白(chaperonins)*扮演主動角色,如Hsp60 會直接促進蛋白質的摺疊.

(52) 伴隨蛋白協助的摺疊. 伴護蛋白協助的摺疊.

(53) 其他蛋白 - Protein disulfide isomerase (PDI)負責雙硫鍵的 正確配對 - Peptide proyl cis-trans isomerase (PPI)負責 脯胺酸參與肽鍵時的異構化反應. 多肽中含Pro時, 其肽鍵具有trans與cis異構形式 - Pro為cis異構形式的機率為5 ~ 30% , 其他胺基酸則少於0.1%.

(54) 11. 與蛋白質摺疊缺失有關的疾病 普昂疾病(the prion disease) - Prion (proteinaceous infectious only) - Prusiner因此獲得1997年諾貝爾生醫獎 纖維囊腫(cystic fibrosis) - Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)因發生胺基酸(F508)刪除突變, 導致摺疊過程的中間產物無法自伴隨蛋白脫離, CFTR無法抵達其最終作用場所 肺氣腫(emphysema) - α1-Antitrypsin發生缺失,無法抑制彈力蛋白酶 (elastase),彈力蛋白受損.

(55) Stained section of cerebral cortex from autopsy of a patient with CC-J disease shows spongiform degeneration. 正常. 異常. The propagation of infectious prion protein Occurs via conversion of normal prion protein (left) to a diseasedisease-causing form (right). 人類PrP蛋白單體(左)與雙聚體(右)形式.

(56) 《蛋白質結構與功能關係的研究實例》 1. 肌紅蛋白與血紅素 肌紅蛋白(myoglobin, Mb) - 肌紅蛋白負責肌肉細胞內O2的輸送與儲存,屬功能 性蛋白質,含153個胺基酸與血基質* 肌紅蛋白的結構* - 由X光晶體繞射的結果研判得知,整個肌紅蛋白分子 為球狀,摺疊十分緊密,其中75%為α-螺旋構造, 血基質約位於蛋白分子的中心並以所含的Fe+2與O2 接合進行輸送及儲存O2 - Kendrew因解出結構的貢獻而獲得1962年諾貝爾 化學獎.

(57) 肌紅蛋白(抹香鯨)的三級構造. Perutz (左, 血紅素)與Kendrew(右, 肌紅蛋白) - 同獲1962年諾貝爾化學獎. 血基質, 鐵紫素 (heme).

(58) 血紅素(hemoglobin, Hb) - 血紅素在肺與組織細胞間擔任O2的輸送* - 血紅素具有四級構造*,由兩個α次單元與兩個 β次單元構成一個四面體的立體排列,組成的α次單元 (含有141個胺基酸)與β次單元(含有146個胺基酸)的 分子中心,分別含有血基質可與O2接合 - Perutz因解出構造而與Kendrew同獲諾貝爾獎 - α次單元與β次單元的結構雖非完全相同但極為類似, 且其個別的立體構造也分別與肌紅蛋白類似*,顯示 高度相似的立體結構與其同為攜氧蛋白的功能有關 (結構與功能高度相關).

(59) 肌紅蛋白與血紅素β次單元的三級結構比較.

(60) 鯨魚肌紅蛋白與人類血紅素α次單元與β次單元的胺基酸序列比對.

(61) 血紅素具有四級構造對其功能的影響 - 在不同的O2濃度(O2分壓, pO2)下,O2和血紅素的 接合關係呈現“ S” 型曲線*,而O2和肌紅蛋白間的 接合關係則呈現“ 雙曲線” 型關係 - 血紅素的4個次單元與O2的接合具有正的協同作用, 即O2與任何一個次單元的接合會加速O2與其他次單元 的接合 - 波爾效應描述pO2與pH值對血紅素與O2接合的影響, pO2愈高,pH值愈高,血紅素被O2飽和(接合)的程度 愈高,如在肺部,pO2與pH值均高,大部分血紅素均 被O2飽和,而在組織,pO2低且pH值因代謝產物及 CO2而降低時,血紅素與O2的接合減弱,因而可因應 組織的需求而釋出O2供利用,但相同的條件下,.

(62) 雙曲線 “ S” 型曲線. _________.

(63) →. pH值對血紅素與O2接合的影響.

(64) 肌紅蛋白不具有四級構造,其對O2的接合不具協同 作用,也不受pO2或pH值的影響 - 血紅素與O2的接合尚可受到2,3-BPG (2,3-bisphosphoglycerate)的調控,此調控對胎兒的發育 極為重要,成人的血紅素(HbA)的組成為α2β2, 2,3-BPG可接合至β次單元,使得成人血紅素對O2的 親和性降低,而胎兒血紅素(HbF)的組成為α2γ2,無 β次單元可與2,3-BPG可接合,不受2,3-BPG影響, 對O2的親和性較成人血紅素高.

(65) 正常人類血液中BPG的濃度 - ~ 5 mM at sea level - ~ 8 mM at high altitude. →. →. 相同pH值與2,3-BPG濃度下, HbA與HbF對氧分壓的飽和曲線 2,3-BPG對血紅素與O2接合的影響.

(66) T構形. Positively charged groups ∣ ∣ ↓. BPG與deoxy血紅素的接合 Binding pocket disappears. R構形.

(67) 2. 與血紅素相關的疾病 鐮形細胞貧血症(sickle-cell anemia)* - 此病症為一“ molecular disease” ,由Pauling於 1949年提出的 - Sickle-cell hemoglobin (HbS)分子,其β次單元的 Glu6(側鏈帶負電)因突變置換為Val6 (側鏈為疏水) 地中海型貧血症(thalassemias) - α-Thalassemias (甲型, β4或γ4),其α次單元有缺失 - β-Thalassemias (乙型),其β次單元有缺失.

(68) 表面疏水的區塊. 溶解度差. 正常與鐮形細胞貧血症患者的紅血球. 鐮形細胞貧血症患者紅血球內的血紅素.

(69) 3. 角蛋白,膠原蛋白與絲纖維蛋白 此三種蛋白質均為扮演結構功能的纖維狀蛋白,通常 由規則性的二級結構進一步組合形成特殊的構造 - 組成的構造具有強韌與穩定的特性,符合擔任保護與 支撐的功能 角蛋白 - 角蛋白由兩股α-螺旋相互纏繞形成coiled coils*, 其一級結構具有(a-b-c-d-e-f-g)n的序列,其中a與d 為非極性胺基酸 - 頭髮的構造*含有共價的cross-links (雙硫鍵) - 燙髮(permanent wave)的原理與所含的半胱胺酸 (具有-SH官能基)有關.

(70) 頭髮的構造. 頭髮的橫切面. 燙髮的生化基礎.

(71) 膠原蛋白 - 膠原蛋白的基本構造為特殊的三股螺旋狀構造* - 甘胺酸(Gly)含量佔1/3且富含脯胺酸(Pro) - 膠原蛋白的一級構造具有Gly-X-Y序列,其中X為 Pro,Y為Pro或Hyp (Gly佔35%,Pro或Hyp佔 21%) - Hyp為Pro經轉譯後修飾作用加上-OH,此修飾作用 有助於維持蛋白質結構的穩定,修飾酵素的活性仰賴 維生素C (抗壞血酸),維生素C嚴重缺乏會導致 壞血病(scurvy) - Ehlers-Danlos syndrome即因甘胺酸被置換成側鏈 較大的胺基酸,因此三股螺旋狀構造不穩定,與習慣 性脫臼有關.

(72) 甘胺酸. ↙. 膠原蛋白纖維的結構. 膠原蛋白的結構.

(73) 絲的構造. 絲纖維蛋白為層層β-褶片相疊的 構造, 富含甘胺酸Gly與甲胺酸Ala.

(74) 絲纖維蛋白 - 絲纖維蛋白形成β-褶片構造,且層層相疊* - 絲纖維蛋白富含甘胺酸與甲胺酸(Ala),且每兩個 胺基酸就有一個甘胺酸出現 纖維狀蛋白因具有特殊的一級結構(特定的胺基酸組成 與排列)而形成特殊的構造,再次驗證Anfinsen等人對 蛋白質結構的形成與結構功能關係的論點.

(75) 《蛋白質構形的變化》 1. 蛋白質的構形變化 蛋白質分子為dynamic分子 以球狀蛋白為例 - 分子的振動,如胺基酸側鏈的擺動*等,變化微小, 有如“ breathe” 般 - 構形的變化(conformational change)*,變化較 顯著,與蛋白質的活性或功能有關 2. 蛋白質構形變化的例子 酵素與受質,血紅素與O2與肌肉收縮時肌凝蛋白與 肌動蛋白(Ca+2的角色).

(76)

(77) 3. 氧的接合蛋白 肌紅蛋白(Mb)與血紅素(Hb) - O2的接合部位為鐵紫素或血基質(heme, Fe+2) - 血基質與O2接合的能力受蛋白質結構的影響,游離 的血基質,其CO的接合與O2的接合為25,000 : 1, 而肌紅蛋白與血紅素*,其CO的接合與O2的接合為 200 : 1 肌紅蛋白與血紅素的功能受其結構的影響 - 在生物功能上,肌紅蛋白負責O2的儲存,血紅素 負責O2的輸送* - 在結構上,肌紅蛋白具有三級構造,血紅素具有四級 構造(α2β2)*.

(78) 血基質. 肌紅蛋白. Protoporphyrin IX.

(79) 肌紅蛋白 Distal. Proximal. 血紅素中的血基質. 游離的血基質.

(80) ↑ ________ ↓.

(81) - 在與O2的接合上,肌紅蛋白無協同性(雙曲線圖形), 血紅素具協同性(“ S” 形曲線圖形)*,肌紅蛋白接O2 的能力不受調節,血紅素接O2的能力受多種因素調節 血紅素的構形變化* - T構形(T state, tensed或taut)指血紅素分子結構 較緊縮,為不接氧的形式(deoxy form),對O2的 親和力弱 - R構形(R state, relaxed)指血紅素分子結構較 膨鬆,為接氧的形式(oxy form),對O2的親和力強.

(82) 不接氧. T構形. 接氧. R構形.

(83) Porphyrin is slightly Puckered, heme iron protrude on His F8 side. Heme assumes a more Planar conformation, shift the position of His F8 and F helix. 血紅素接O2時血基質鄰近區域構形的改變.

(84) 血紅素為一種異位蛋白(allosteric protein),具有 活性部位與調節部位 - Allos (希臘文意為“ other” ),Stereos (希臘文意為 “ shape” ) - 活性部位是血紅素與O2接合的部位(相當於酵素的 受質接合部位),與O2的接合具有協同性 - 調節部位是調節劑接合的部位,如2,3-BPG、H+與 CO2等阻礙劑對血紅素的影響阻礙劑,另尚有活化劑.

(85) 《蛋白質結構的測定與預測》 1. 蛋白質的一級構造決定其立體構造,而蛋白質的立體 構造與其生物功能有密切的關係,因此研究蛋白質的 功能需了解蛋白質的一級構造 2. 蛋白質一級構造的測定為求出多肽中胺基酸的組成與 排列次序 胺基酸的組成分析 - 蛋白質經酸水解*後,胺基酸的混合物可利用由 Stein & Moore (1972年諾貝爾化學獎得主)所開發 的胺基酸分析儀分析其組成 - 胺基酸的組成可提供多種資訊*.

(86) 蛋白質的酸水解.

(87) 9.55% 疏水胺基酸*. *. * * *. 胺基酸的組成分析. * *. * * 1.18%. *. 胺基酸的組成分析: Frequencies of various amino acids in proteins 數據來自超過10萬個蛋白質的胺基酸組成, 共約4千萬個胺基酸(the SWISSPROT protein knowledgebase).

(88) 細胞色素 c: 50/104 (48%) Chymotrypsin: 126/245 (51%) Aliphatic, Aromatic 疏水性.

(89)

(90) 胺基酸的排列順序 - 可利用胺基酸定序儀取得 - Sanger*因定出胰島素分子的構造並提出分析蛋白質 一級構造的方法,而獲得1958年諾貝爾化學獎 (Sanger另因提出分析DNA序列的方法,於1980年 再獲得諾貝爾化學獎) - 現今,大多數蛋白質的胺基酸序列可由基因的核苷酸 序列推知,但一級構造的分析對研究蛋白質是否具有 轉譯後的修飾作用仍深具價值.

(91) 牛胰島素的定序 - 耗時約10年, 使用約100克的蛋白質. Frederick Sanger (1918~) - 1958年諾貝爾化學獎(蛋白質定序) - 1980年諾貝爾化學獎(DNA定序).

(92) 蛋白質定序步驟* - 蛋白質純化,可利用蛋白質的大小、帶電特性、 溶解度或與特定物質的吸附作用等 - 次單元的分離,可利用高鹽濃度或改變溶液的pH值 - N端與C端胺基酸的定性分析 - 利用酵素或化學試劑的作用將多肽鏈分割成小片段, 確保定序結果的正確性 - 胺基酸自動定序 - 序列的重組 - 雙硫鍵的定位*,可利用對角線電泳.

(93) 蛋白質雙硫鍵的破壞.

(94) N端胺基酸定性 FDNB. 胺基酸定序反應. PITC.

(95) 專一性, 可預測.

(96) Edman降解反應.

(97) 蛋白質定序過程.

(98) 雙硫鍵的定位 - Diagonal electrophoresis (對角線電泳).

(99) 其他的定序方法 - 質譜分析法(mass spectrometry)*,蛋白質離子化 後,其片段可依質量電荷比分離(電場) ,Fenn與 Tanaka因開發此方法而同獲2002年諾貝爾化學獎 - 生物資訊學 3. 蛋白質的二級、三級與四級結構的研究 利用物理方法 - 如利用蛋白質分子對偏極光的轉向能力*或核磁共振* 的原理,估測二級構造中α-螺旋或β-褶片的含量 - 如利用X光繞射法*研究蛋白質結晶的構造,以取得 蛋白質的三級與四級結構等.

(100) 蛋白質的電噴灑質譜分析. (1) A Protein solution is dispersed into charged droplets by passage through a needle under a high-voltage electric field (2) The droplets evaporate and ions enter the mass spectrometer for m/Z measurement.

(101) 蛋白質的質譜分析圖譜. The spectrum generated and a computer-generated transformation of the spectrum.

(102) 串聯的質譜分析.

(103) CD光譜分析 Standard. γ. β α.

(104) 2D核磁共振圖譜. One-dimensional NMR spectrum of a globin from a marine blood worm.

(105) X光晶體繞射法. 以X光晶體繞射法研究 抹香鯨肌紅蛋白結構的過程.

(106) 4. 蛋白質結構的預測 Anfinsen等人的實驗證明“ 蛋白質的一級構造決定其 立體結構” ,而蛋白質的立體結構又與其功能息息 相關,因此如能由蛋白質的一級構造預測蛋白質的立體 結構,則蛋白質體計劃的研究將大大加速 蛋白質二級構造的預測 - 目前多以分析已知結構的蛋白質中,各類二級構造中 所出現的胺基酸種類為準* - 由Chou與Fasman於1974年提出,對每一種胺基酸 出現在各類二級構造中的相對頻率給予特定數值(如 Pα, Pβ, Pt),經計算後可預測蛋白質的二級構造, 此法經已知結構的蛋白質研究與預測結果比對驗證, 其準確性可達95%以上.

(107) 特定胺基酸出現在三種常見二級結構的相對機率.

(108)

(109) 蛋白質三級構造的預測 - 三級構造的預測較為複雜,目前仍仰賴計算機龐大 的資料存取與計算能力(computer-based calculation, 以energy minimum為原則)進行 - 配合進一步分析已知結構的蛋白質中不同層級的細部 構造(knowledge-based method, 利用多種 database),尚未能精準有效的預測結果 - 其他方法.

(110) 肌紅蛋白與血紅素的α次單元或β次單元的胺基酸序列比較.

(111) 肌紅蛋白與血紅素的α次單元及β次單元極可能 源自一個共同的祖先 - α次單元與β次單元約140個胺基酸中有64個相同 - 肌紅蛋白與α次單元有38個胺基酸相同 原始球蛋白. 肌紅蛋白與血紅素的α次單元或β次單元的立體結構比較.

(112) 《蛋白質的結構與演化》 1. 分析不同蛋白質的胺基酸序列,可推斷蛋白質是否為 同源蛋白,即源自同一個祖先 2. 以肌紅蛋白與血紅素的研究為例 肌紅蛋白的結構與血紅素的α次單元或β次單元的結構 均十分類似,且同樣具有攜氧的功能,極可能源自於 一個共同的祖先 (一個原始的球蛋白)* 3. 以細胞色素c的研究為例 比較不同來源的細胞色素c的胺基酸序列,說明蛋白質 的結構研究對建立演化關係的重要性.

(113) - 細胞色素c是粒線體電子傳遞鏈的成分,對細胞的 存活極為重要 - 分析得自麵包酵母及人類等40多種不同來源的細胞 色素c,雖然其蛋白質的一級構造不盡相同但卻有 令人訝異的相似處 - 細胞色素c平均含有104個胺基酸,其中有28個完全 相同*,目前已知此28個胺基酸和細胞色素c的功能 有密切的關係,只要任一個胺基酸被其他種類的 胺基酸取代時皆會影響細胞色素c的功能 當比較不同物種的細胞色素c的胺基酸序列時,發現 不同物種間的序列差異程度與其親緣關係有一定的比例 關係* - 如人的細胞色素c胺基酸序列與黑猩猩的完全相同,.

(114) 不同物種間細胞色素c胺基酸序列差異的程度比較.

(115) 與其他哺乳類有10個胺基酸的差異,與爬蟲類有14 個差異,與魚類、軟體動物、昆蟲與酵母或高等植物 則分別有18個、29個、31個與40個以上的差異 - 分析細胞色素c的胺基酸序列差異所建構的“ 演化樹” (phylogenetic tree, 系統發生樹)與使用傳統方法 所建立的演化關係極為符合* - 此類研究衍生出利用分析特定蛋白質的胺基酸序列 以建構演化關係的“ 分子演化學”.

(116) 由分析細胞色素c建構的演化樹.

(117) 《蛋白質與其它分子的交互作用》 1. 蛋白質表現生物功能時需與其它分子接合,此接合 通常是緊密、專一、且會形成複合體,如調控基因 表現的核酸蛋白或細胞辨識的醣蛋白與細胞膜上的 受體蛋白或運輸蛋白等 此接合雖然與細胞的繁殖、生長與發育等不同的生理 作用有關,但蛋白質與其它分子間的交互作用與專一 辨識過程均十分相似 - 親和基(ligand)是與特定蛋白質產生專一性接合的 分子,如酵素的受質、產物、輔因子、阻害劑或 活化劑,甚至運輸蛋白所輸送的物質等.

(118) 2. 親和基的接合作用 蛋白質與其親和基的接合通常具有專一性,此專一性 來自於兩者構造的互補特性與兩者接合後可產生新的 安定作用力 蛋白質與親和基的接合多經由非共價作用力,因此 接合為一可逆的過程 每個蛋白質與同一種親和基的接合可發生在分子內的 一個或多個部位 - 如發生在多個部位時,與同一種親和基接合的能力 可能相同或不同,因此產生了接合的協同性,此種 關係稱為同質性效應,如血紅素與O2的接合.

(119) 一個蛋白質分子內也可有不同種類的親和基接合部位 - 不同親和基的接合部位在親和基接合時,會有相互 溝通(cross-talk)的特性,此種關係稱為異質性 效應,如血紅素與O2的接合受2,3-BPG及波爾效應 的影響 3. 異位效應是蛋白質不同部位之間的相互影響 異位效應(allostery)是具有四級結構的蛋白質所特有 - 此類蛋白質含有不同的次單元,如催化或活性次單元 是受質或反應物接合的部位,而調節次單元則是 調節物的接合部位 - 當兩種不同的親和基接合部位,因親和基接合後引發 的構形改變進而彼此溝通,如血紅素攜氧特性與影響 其攜氧能力的因子研究即為此效應的最佳例子.

(120) 《蛋白質活性的調節》 1. 影響蛋白質活性的因子除了溫度、pH值、受質、 輔因子或調節劑濃度等外,尚有三個較為重要的機制 2. 蛋白質的切除活化作用* 如消化酵素、凝血因子與一些激素等蛋白質通常合成 時是不具有活性的先質(precursors),當需要時會因 一小段肽鏈被切除而具有活性 - 切除活化作用為一不可逆的調節方法 3. 蛋白質的異位調節作用 此調節作用是多種代謝路徑中調節酵素或異位酵素的 活性調控方式.

(121) 胰蛋白酶. 腸道生肽脢. 胰凝乳脢原的切除活化.

(122) 血液凝固反應. B型血友病. A型血友病. 凝血酶原. 凝血酶 血纖維蛋白. 血纖維蛋白原.

(123) - 如代謝路徑的終產物(調節劑)之回饋抑制調控* - 當調節劑與蛋白質的調節部位接合後,引發該部位 的構形發生變化,此變化因四級結構中不同次單元 的相互接觸而傳達到催化部位,因而改變催化部位 的特性,使蛋白質的活性改變* - 以酵素為例,較普遍的是改變酵素對受質的親和力, 少數則是改變酵素的催化效率 4. 蛋白質的共價修飾作用 肝糖代謝的調控為共價修飾作用的最佳例子* - 蛋白質(肝糖磷解酶)因特定胺基酸接上特定的化學 基團(磷酸基)後而改變其活性,此修飾作用屬共價 鍵結的形成,因此活性變化之間需其他酵素的參與*.

(124) 阻害劑. 異白胺酸合成的回饋抑制調控.

(125) 調節部位. 催化部位 活化劑 阻害劑. 異位蛋白與調節劑接合後改變蛋白質(酵素)的活性.

(126) 肝糖磷解酶. 肝糖合成酶.

(127) Amplification of signal. 磷酸化. 磷酸化. 藉由蛋白質激酶與蛋白質磷酸水解酶調控蛋白質活性.

(128) - 共價修飾的調控機制通常是細胞代謝受激素調節的 方式,有訊號放大的效果 5. 其他機制 與其他蛋白質的接合作用 - 如蛋白質激酶A (protein kinase A, PKA)*與調節 次單元的接合 - 如調鈣蛋白(calmodulin)可調控受Ca2+調節的 蛋白質或酵素 蛋白質的分佈(compartmentation或localization) - 如葡萄糖運輸蛋白的細胞表面受胰島素的影響.

(129) 蛋白質激酶A的活化.

(130) 《蛋白質的新陳代謝》 1. 細胞內蛋白質的新陳代謝(分解) 蛋白質雖有驚人的特性,卻非“ 長生不老” ,蛋白質 隨著“ 年紀” 的增長,會累積多種發生的化學反應而 造成生物活性的喪失 - 如胺基酸支鏈的硫原子氧化,天門冬醯胺酸與麩醯 胺酸的側鏈的去醯胺作用,碳的異構化作用,胺基與 葡萄糖間非酵素的反應(最普遍)等 - 此類不正常或老化的蛋白質需持續被分解移除 2. 細胞內特定蛋白質的含量是維持動態平衡的狀態.

(131) 蛋白質持續地被製造與被分解 - 蛋白質的持續分解除了是一般的新陳代謝外,也可 用來移除外來的蛋白質及對環境變化的調適(如因應 養份不足與不同發育階段的需求等) 3. 影響蛋白質分解速率的因子 蛋白質分解(水解)的過程需要能量,具有一級反應的 動力特性,且被分解的蛋白質分子是隨機選取 正常細胞內不同的蛋白質有不同的分解速率 - 蛋白質的半生期(half-life)較短者,細胞內分解的 速率較快.

(132) - 半生期較短的蛋白質通常分子量較大,具有酸性pI 值,在細胞的新陳代謝中擔任關鍵的調節角色*,且 在試管內對熱或蛋白酶的實驗處理較為敏感 近年的研究發現蛋白質N端的胺基酸種類及特定序列 (PEST)的數目與蛋白質的半生期有密切關係 - N端的胺基酸種類,穩定者(半生期>20小時)為 Met、Ser、Gly、Ala、Thr與Val,不穩定者 (半生期7~30分鐘)為Arg、Lys、Asp、Leu與 Phe,高度不穩定者(半生期2~3分鐘)為Ile、Glu、 Pro、Tyr與Gln - 蛋白質的PEST (Pro、Glu、Ser、Thr)序列出現 次數愈多,其半生期愈短.

(133) 哺乳類細胞內蛋白質的半生期 酵素或蛋白質種類. 半生期(hr). c-myc, c-fos, p53 oncogene products RNA polymerase I Tyrosine aminotransferase Deoxythymine kinase Phosphoenolpyruvate carboxykinase Aldolase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Lactate dehydrogenase (isozyme 5) Cytochrome c. 0.5 1.3 2.0 2.6 5.0 118 130 144 150.

(134) 4. 蛋白質降解的機制 細胞內蛋白質的降解主要經由兩個途徑 - 溶體或溶酶體系統負責代謝外來或不正常的蛋白質 - 細胞液的蛋白質降解體(proteasome)系統負責代謝 一般正常蛋白質 蛋白質降解體媒介的蛋白質水解(proteasomemediated proteolysis) - Ciechanover, Hershko與Rose因其貢獻而同獲 2004年諾貝爾化學獎 - 泛素(ubiquitin)標記的蛋白質(ubiqutination)被 26S蛋白質降解體*辨識並分解,需ATP及多種 蛋白質(酵素E1, E2, E3)參與蛋白質的降解.

(135) 26S蛋白質降解體的構造. 蛋白質降解體系統的蛋白質水解.

(136)

數據

Updating...

參考文獻

相關主題 : 蛋白質概論